陸 江,朱道仙,盧勁曄*,劉 莉,郝福星,吳 植,盧 煒,劉 靜

(1.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院寵物科技學(xué)院,泰州 225300;2.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,泰州 225300;3.江蘇省獸用生物制藥高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,泰州 225300)

肥胖是犬最常見的代謝性疾病之一,近年來發(fā)病率不斷升高,成為寵物行業(yè)關(guān)注的熱點(diǎn)問題,而且肥胖還可誘發(fā)糖尿病、高血壓等疾病,嚴(yán)重危害動(dòng)物健康,增加飼養(yǎng)成本[1-2]。研究表明,腸道與脂肪組織具有串?dāng)_現(xiàn)象,稱為腸-脂肪組織軸[3]。肥胖與腸-脂肪組織軸關(guān)系密切,腸道黏膜屏障功能障礙導(dǎo)致脂多糖易位產(chǎn)生的代謝性內(nèi)毒素血癥是肥胖癥最重要的啟動(dòng)因子之一[4-6]。因此,調(diào)節(jié)腸-脂肪組織軸有望成為肥胖防治的一種有效途徑。

菊粉是一種聚合度(degree of polymerization, DP)為2～60的果糖聚合物,具有降血糖和血脂、調(diào)節(jié)腸道菌群及提高免疫等多種生理功能,已廣泛應(yīng)用于豬、牛及家禽等動(dòng)物[7-9]。通常把DP≤10的稱為低聚合度菊粉,DP≥23的稱為高聚合度菊粉[10],不同聚合度的菊粉可產(chǎn)生不同的生理功能[11]。He等[12]研究發(fā)現(xiàn),高聚合度菊粉可通過調(diào)節(jié)腸道黏膜屏障功能影響腸-胰腺軸緩解急性胰腺炎,而低聚合度菊粉無此作用。王琦[13]研究表明,菊粉可降低高脂飲食小鼠的體重,且高聚合度菊粉效果優(yōu)于低聚合度菊粉。然而,高聚合度菊粉通過調(diào)節(jié)腸-脂肪組織軸改善肥胖癥的作用還有待于研究。因此,本試驗(yàn)主要研究高聚合度菊粉對(duì)高脂飲食犬肥胖改善作用及其與腸-脂肪組織軸的關(guān)系,為高聚合度菊粉在犬抗肥胖功能性食品上的應(yīng)用和開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

經(jīng)江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院動(dòng)物福利與倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)(編號(hào)NSF202108),40只泰迪型貴賓犬由本單位美容實(shí)驗(yàn)犬舍提供,雄性,3歲,體重5.5 kg左右,健康狀況良好。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證為SYXK(蘇)2021-0037。

1.2 主要材料

高聚合度菊粉(Orafti? HP,聚合度≥23,純度>99%)購于常州迪沙醫(yī)藥科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取40只泰迪型貴賓犬,隨機(jī)等分為5組:正常飼糧組(CD組)、高脂飼糧組(HFD組)、低劑量高聚合度菊粉組(LHI組)、中劑量高聚合度菊粉組(MHI組)和高劑量高聚合度菊粉組(HHI組)。試驗(yàn)前各組均以正常飼糧進(jìn)行2周適應(yīng)性飼喂。然后,CD組飼喂正常飼糧,HFD組飼喂高脂飼糧,LHI組、MHI組和HHI組分別飼喂含1.0%、3.0%和5.0%高聚合度菊粉的高脂飼糧。試驗(yàn)期為12周。整個(gè)試驗(yàn)過程中,所有犬均單籠飼養(yǎng),每天08:30及16:30各喂食1次,所有犬每天自由活動(dòng)15 min左右。基礎(chǔ)飼糧參考《犬營養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》(NRC—2016)配制,各組飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧的組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet(air-dry basis) %

1.4 體重、采食量和體脂率的測(cè)定

試驗(yàn)前稱量體重,然后每2周稱重1次,按公式:

體重增加率=(測(cè)量體重-初始體重)/初始體重×100%,計(jì)算體重變化情況。按:采食量=給予飼糧-剩余飼糧,每周計(jì)算1次采食量,按:平均采食量=總采食量/總時(shí)間,計(jì)算平均采食量。試驗(yàn)結(jié)束后,用EchoMRI體成分分析儀(美國,EchoMRI LLC公司)測(cè)定體脂率。

1.5 血液生化檢測(cè)

試驗(yàn)結(jié)束時(shí),空腹經(jīng)橈外側(cè)靜脈采集各組試驗(yàn)犬的血液,3 000 r·min-1離心10 min得到血清。當(dāng)天用試劑盒測(cè)定血清甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和葡萄糖(Glu)含量,試劑盒購于北京百奧萊博科技有限公司。用ELISA試劑盒法(購于美國Biolegend公司)測(cè)定白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-ɑ(TNF-ɑ)、脂多糖(LPS)和D-乳酸含量。

1.6 口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(OGTT)

試驗(yàn)結(jié)束后,所有犬禁食12 h,然后按2.0 g·kg-1體重服用葡萄糖。在給藥后0、30、60、90和120 min,通過血糖檢測(cè)試劑盒測(cè)量橈側(cè)靜脈血液中的葡萄糖濃度。然后,以血糖濃度為縱坐標(biāo),時(shí)間為橫坐標(biāo)繪制曲線,并計(jì)算出曲線下面積(AUC)。

1.7 胰島素耐量試驗(yàn)(ITT)

在OGTT試驗(yàn)結(jié)束后第3天,按0.5 U·kg-1體重肌肉注射胰島素,在給藥后0、30、60、90和120 min,通過血糖檢測(cè)試劑盒測(cè)量橈側(cè)靜脈血液中的葡萄糖濃度。然后,以血糖濃度為縱坐標(biāo),時(shí)間為橫坐標(biāo)繪制曲線,并計(jì)算出曲線下面積(AUC)。

1.8 實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)

試驗(yàn)結(jié)束后,分別取腹部皮下白色脂肪組織和結(jié)腸黏膜,用TRIzol法提取脂肪組織總RNA和結(jié)腸黏膜總RNA。然后合成cDNA并用于實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增。β-肌動(dòng)蛋白(β-actin) 為內(nèi)參基因,檢測(cè)脂肪組織中白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-ɑ(TNF-ɑ)的mRNA相對(duì)表達(dá)量以及空腸黏膜中閉鎖蛋白(Occludin)、閉鎖小帶蛋白-1(ZO-1)和肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)的mRNA相對(duì)表達(dá)量。PCR擴(kuò)增條件為:95 ℃ 30 s, 55 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s,40個(gè)循環(huán)。目的基因引物由上海生工生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)和合成,詳見表2。目的基因 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量用 2-ΔΔCt法計(jì)算。

表2 PCR引物序列Table 2 Primer sequences for PCR

1.9 Western blot檢測(cè)

用RIPA裂解液提取皮下脂肪組織總蛋白,BCA法測(cè)定蛋白濃度,用5×上樣緩沖液配平各蛋白樣品,上樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳2 h,PVDF膜轉(zhuǎn)膜2 h,用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h。加Ⅰ抗IL-6(1∶2 000)、TNF-ɑ(1∶2 000)和GAPDH(1∶5 000),置于4 ℃搖床中孵育過夜,TBST洗膜3次,每次5 min。加辣根過氧化物酶標(biāo)記Ⅱ抗(1∶5 000)室溫下孵育1 h, TBST洗膜3次,每次5 min。化學(xué)發(fā)光成像儀中顯影成像。以GAPDH為內(nèi)參,采用Image J分析軟件對(duì)各組條帶的光密度值進(jìn)行分析,試驗(yàn)重復(fù)3次,取平均值。所有抗體均購于美國Sigma公司。按上述方法,檢測(cè)結(jié)腸黏膜中Occludin、ZO-1和MLCK表達(dá)。

1.10 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示,兩組間數(shù)據(jù)用SPSS 23.0軟件t檢驗(yàn)進(jìn)行比較,采用Pearson方法進(jìn)行相關(guān)性分析。P<0.05表示有顯著性差異,P<0.01表示有極顯著性差異。

2 結(jié) 果

2.1 高聚合度菊粉對(duì)高脂飲食犬體重、采食量和體脂率的影響

從圖1a可知,各組犬體重呈增加趨勢(shì),HFD組體重從第2周開始顯著高于CD組(P<0.05),MHI組和HHI組體重從第4周開始顯著低于HFD組(P<0.05),LHI組體重從第8周開始顯著低于HFD組(P<0.05)。從圖1b可知,試驗(yàn)結(jié)束時(shí),HFD組體重增加率顯著高于CD組(P<0.05),約增加34%,各劑量高聚合度菊粉組的體重增加率顯著低于HFD組(P<0.05)。各組間平均采食量無顯著變化(圖1c)。HFD組犬體脂率顯著高于CD組,高聚合度菊粉以劑量依賴式降低高脂飲食犬的體脂率,與HFD組差異顯著(P<0.05,圖1d)。

a. 體重變化;b.體重增加率;c.平均采食量;d.體脂率。圖中CD正常飼糧組,HFD為高脂飼糧組,LHI、MHL和HHI分別為低劑量、中劑量和高劑量高聚合度菊粉組,下圖同。*表示與CD組比較P<0.05, #表示與HFD組比較P<0.05a. Body weight change; b. Body weight gain rate; c. Average feed intake; d. Body fat rate. In the figure, CD. Normal diet group; HFD. High fat diet group; LHI, MHL and HHI. Low-dose, medium-dose and high-dose high polymerization inulin groups, respectively. The same as below. * P<0.05 compared with CD group, and # P<0.05 compared with HFD group圖1 高聚合度菊粉對(duì)高脂飲食犬體重、采食量和體脂率的影響Fig.1 Effects of inulin with high degree of polymerization on body weight, feed intake and body fat rate in dogs fed with high-fat diet

2.2 高聚合度菊粉對(duì)高脂飲食犬血清生化指標(biāo)的影響

由表3可知,HFD組血中TG、TC和LDL-C的含量顯著高于CD組,HDL-C顯著低于CD組(P<0.05)。隨著高聚合度菊粉劑量的增加,高脂飲食犬血中TG、TC和LDL-C的含量逐漸降低,HDL-C含量逐漸升高,且HHI組與HFD組有顯著差異(P<0.05)。所有組之間的Glu含量無顯著差異。

表3 血液生化指標(biāo)的變化Table 3 Changes of blood biochemical indexes mmol·L-1

2.3 高聚合度菊粉對(duì)高脂飲食犬血糖代謝的影響

從圖2a、圖2b可以看出,各組犬口服給予葡萄糖后,血糖值呈顯著增加趨勢(shì),在第30分鐘達(dá)到最高值,隨后血糖值呈逐漸降低趨勢(shì);與CD組相比,HFD組AUC顯著增加,高脂飲食中添加低、中、高劑量高聚合度菊粉后,LHI組、MHI組和HHI組的AUC顯著低于HFD組(P<0.05)。ITT結(jié)果顯示(圖2c、2d),各組犬肌肉注射胰島素后,血糖值呈顯著降低趨勢(shì),在第60 min 達(dá)到最低值,隨后血糖值呈逐漸增加趨勢(shì);與CD組相比,HFD組AUC顯著增加,高脂飲食中添加低、中、高劑量高聚合度菊粉后AUC呈降低趨勢(shì),HHI組的AUC顯著低于HFD組(P<0.05)。

a. 口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(OGTT)血糖變化;b. OGTT曲線下面積;c. 胰島素耐量試驗(yàn)(ITT)血糖變化;d. ITT曲線下面積。*.P<0.05a. Changes of blood glucose in oral glucose tolerance test (OGTT); b. AUC of OGTT blood glucose curve; c. Changes of blood glucose in insulin tolerance test (ITT); d.AUC of ITT blood glucose curve. *. P<0.05 圖2 高聚合度菊粉對(duì)高脂飲食犬血糖代謝的影響Fig.2 Effect of inulin with high degree of polymerization on blood glucose metabolism in dogs fed with high-fat diet

2.4 高聚合度菊粉對(duì)高脂飲食犬結(jié)腸黏膜屏障功能的影響

與CD組比較,HFD組血清中D-乳酸的含量顯著升高(P<0.01);與HFD組比較,MHI組和HHI組D-乳酸顯著降低(P<0.05,圖3a)。從圖3b可以看出,與CD組比較,HFD組結(jié)腸黏膜中Occludin、ZO-1的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著下調(diào);不同劑量高聚合度菊粉均可回調(diào)這些mRNA相對(duì)表達(dá)量,MHI組和HHI組Occludin和ZO-1的mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著高于HFD組(P<0.05);HFD組結(jié)腸黏膜中MLCK的mRNA表達(dá)較CD組顯著上調(diào),而MHI組和HHI組MLCK的mRNA表達(dá)較HFD組顯著下調(diào)。Western blot結(jié)果顯示,與CD組比較,HFD組結(jié)腸黏膜中Occludin、ZO-1蛋白表達(dá)顯著下調(diào),MLCK蛋白表達(dá)顯著上調(diào);與HFD組比較,MHI組和HHI組Occludin、ZO-1蛋白表達(dá)顯著上調(diào),MLCK蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(圖3c、3d)。

a. 血清中D-乳酸含量;b. 結(jié)腸黏膜中閉鎖蛋白、閉鎖小帶蛋白-1和肌球蛋白輕鏈激酶的mRNA相對(duì)表達(dá)量;c～d. 結(jié)腸黏膜中閉鎖蛋白、閉鎖小帶蛋白-1和肌球蛋白輕鏈肌酶的Western blot相對(duì)定量分析。*.P<0.05; **.P<0.01a. The content of D-lactic acid in serum; b. The relative mRNA expression of Occludin, Zonula occludens protein 1(ZO-1) and myosin light chain kinase(MLCK); c-d. The relative expression of occludin, ZO-1 and MLCK in colonic mucosa by Western blot.*.P<0.05; **.P<0.01圖3 高聚合度菊粉對(duì)高脂飲食犬結(jié)腸黏膜屏障功能的影響Fig.3 Effect of inulin with high degree of polymerization on colonic mucosal barrier function in dogs fed with high-fat diet

2.5 高聚合度菊粉對(duì)高脂飲食犬血清及脂肪組織炎癥因子表達(dá)的影響

由圖4a、4b、4c 可知,與CD組比較,HFD組血清IL-6、TNF-ɑ和LPS含量顯著升高(P<0.01);隨著高聚合度菊粉劑量增加,高脂飲食犬血清IL-6、TNF-ɑ和LPS含量均呈下降趨勢(shì);與HFD組比較,MHI組TNF-ɑ和LPS含量顯著降低(P<0.05),HHI組IL-6、TNF-ɑ和LPS含量顯著降低(P<0.05或P<0.01)。高脂飲食犬血清LPS與IL-6、TNF-ɑ均呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.663,P<0.001;r=0.695,P<0.001。圖4d、e)。HFD組脂肪組織中IL-6、TNF-ɑ的mRNA相對(duì)表達(dá)量較CD組顯著上調(diào),但隨著高聚合度菊粉劑量增加呈下調(diào)趨勢(shì),MHI組(P<0.05)和HHI組(P<0.01)均與HFD組有顯著差異(圖4f、4g)。Western blot結(jié)果顯示,與CD組比較,HFD組脂肪組織中IL-6、TNF-ɑ蛋白相對(duì)表達(dá)量升高,與HFD組比較,MHI組和HHI組IL-6、TNF-ɑ蛋白相對(duì)表達(dá)量降低(P<0.05,圖4h、4i)。

3 討 論

肥胖是動(dòng)物能量代謝穩(wěn)態(tài)失調(diào)導(dǎo)致能量攝入超過消耗所引起的大量脂肪積聚于脂肪組織的一種代謝病,并且還可引發(fā)胰島素抵抗,加劇糖脂代謝紊亂,使病情惡化[14-15]。利用高能高脂飲食構(gòu)建動(dòng)物肥胖癥是研究肥胖發(fā)生機(jī)制以及尋求有效治療方法的極為重要方式[16],田威龍等[17]利用高能高脂飲食成功建立豬的肥胖模型。本試驗(yàn)以貴賓犬為試驗(yàn)動(dòng)物,給予高脂飼糧后,不僅體重、體脂率和血脂水平顯著增加,還發(fā)生了葡萄糖耐量受損及胰島素抵抗。本研究結(jié)果與之前一些研究結(jié)果相一致[18-19]。以上結(jié)果提示,本試驗(yàn)成功建立了高脂飼糧誘導(dǎo)的肥胖犬模型。給予高聚合度菊粉干預(yù)可降低高脂飲食犬的體重、體脂率及血脂水平,改善糖耐量受損和胰島素抵抗。這些結(jié)果說明高聚合度菊粉對(duì)改善犬肥胖具有積極作用。

研究表明,白色脂肪組織(WAT)炎癥是促進(jìn)肥胖發(fā)展的重要因素。WAT中的脂肪細(xì)胞以及M1巨噬細(xì)胞可分泌大量的TNF-α及IL-6等促炎因子,這些促炎因子釋放到循環(huán)系統(tǒng),引起全身慢性低度炎癥,進(jìn)一步加劇代謝紊亂,加快肥胖及其相關(guān)代謝病的發(fā)展。Lu等[20]研究發(fā)現(xiàn),LPS易位介導(dǎo)的TLR4/NF-κB通路可促進(jìn)犬脂肪組織炎癥和肥胖。而腸黏膜屏障功能障礙是LPS易位的重要前提。腸道黏膜屏障是由腸物理屏障、化學(xué)屏障、微生物屏障和免疫屏障4個(gè)部分組成的復(fù)雜結(jié)構(gòu)[21]。緊密連接是腸物理屏障的重要組成部分,由多種腸道緊密連接蛋白組成[22]。緊密連接蛋白Occludin主要負(fù)責(zé)調(diào)控緊密連接的通透性[23],ZO-1調(diào)控細(xì)胞骨架形成[24],MLCK可調(diào)控這些蛋白表達(dá)[25]。研究表明,緊密連接蛋白表達(dá)水平降低是機(jī)體腸道屏障功能損傷的主要原因[26-27],高脂飲食可通過誘導(dǎo)腸上皮緊密連接蛋白的表達(dá)降低或分布異常引起腸黏膜屏障受損[28-29]。Kim等[30]發(fā)現(xiàn)高脂飲食可導(dǎo)致小鼠腸道中LPS易位進(jìn)入血液,誘導(dǎo)脂肪組織和肝中TLR4及其下游產(chǎn)物IL-6和TNF-α的高表達(dá)。細(xì)胞試驗(yàn)也表明,脂肪細(xì)胞中LPS-TLR4信號(hào)通路激活誘導(dǎo)的慢性低度炎癥與肥胖關(guān)系密切[31-32]。上述結(jié)果表明,腸-脂肪組織軸對(duì)話機(jī)能紊亂與肥胖有密切關(guān)系。本研究中,高脂飼糧組結(jié)腸黏膜中Occludin和ZO-1表達(dá)下調(diào),血清LPS和D-乳酸水平升高,血清中IL-6和TNF-α水平升高,脂肪組織中IL-6和TNF-α的表達(dá)升高,給予高聚合度菊粉后,可逆轉(zhuǎn)這些變化。這些結(jié)果說明高聚合度菊粉可以調(diào)節(jié)“腸黏膜屏障功能障礙-LPS易位-脂肪組織炎癥”這一腸-脂肪組織軸機(jī)能紊亂。

4 結(jié) 論

綜上,高聚合度菊粉可能通過改善“腸黏膜屏障功能-LPS易位-脂肪組織炎癥”這一途徑調(diào)節(jié)腸-脂肪組織軸,從而有效改善高脂飲食誘導(dǎo)犬的肥胖和血糖血脂代謝。