袁何玲,方 詞,黃金虎,王曉明,肖文浚,劉睿婷,史榮梅,王麗平*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院,南京 210095;2.新疆醫(yī)科大學 藥學院,烏魯木齊 830017;3.新疆大蒜藥用研究重點實驗室,烏魯木齊 830013)

細胞色素P450酶(cytochrome P450,CYP450)是由CYP450基因編碼的重要代謝酶,廣泛存在于所有生命體。CYP450在人和動物機體肝組織中含量最高,主要參與內(nèi)源性和外源性化合物的 Ⅰ 相代謝過程。研究已證實有些外源化合物,包括一些臨床常用的藥物是CYP450酶的誘導劑或抑制劑[1]。因此,當這些藥物與CYP450底物聯(lián)用時,會因改變藥物藥代動力學過程導致藥物臨床療效改變,也可因代謝減少或毒性代謝物生成增多而增加藥物毒性,產(chǎn)生不良的藥物-藥物間相互作用(drug-drug interaction,DDI)[2-3]。基于此,美國FDA明確要求在新藥研究時增加藥物對CYP450影響的研究,以避免藥物間相互作用引起的臨床不良反應。目前已報道CYP家族成員主要有CYP1A2、CYP3A4、CYP2D6和CYP2E1等,其中CYP1A2是CYP450家族的重要成員之一,可以代謝機體約10%的藥物[4]。獸醫(yī)臨床常用藥物如喹諾酮類藥物、灰黃霉素等以及動物飼料中存在的前致癌物黃曲霉毒素均是CYP1A2的底物或抑制劑[5]。因此,若動物機體的CYP1A2活性改變,則有可能導致獸醫(yī)臨床藥物療效下降或者外源性毒性化合物在體內(nèi)的代謝過程發(fā)生改變,進而對機體產(chǎn)生不良影響,故研究外源性化合物對動物機體CYP1A2的影響具有重要的臨床意義。

為應對細菌耐藥問題,世界衛(wèi)生組織及各國家均鼓勵研發(fā)抗生素替代品用作動物飼料添加劑用于預防細菌感染,以減少抗菌藥在畜牧養(yǎng)殖中的應用,故篩選和開發(fā)抗生素替代品也成為全球研究熱點。大蒜(garlic)是藥食同源性草本植物,大蒜碾碎時液泡中的蒜氨酸(alliin)和胞質(zhì)中的蒜酶(allinase)發(fā)生催化裂解反應后產(chǎn)生的大蒜辣素(allicin),被認為是天然大蒜中含量最高、最重要的活性成分[6]。已有研究表明大蒜辣素不僅具有抗菌、抗病毒、抗寄生蟲和預防心血管疾病等作用[7-9],而且發(fā)現(xiàn)飼糧中添加蒜粉后還可以促進斷奶仔豬和蛋雞的生長發(fā)育、提高機體免疫力和改善周圍環(huán)境[10-12]。本實驗室前期研究也發(fā)現(xiàn)大蒜辣素可以通過抗氧化和抗炎作用,預防和治療CCL4所致的小鼠急性肝損傷,并且肉雞飼糧中添加一定量的蒜粉可以降低肉雞脂肪肝發(fā)生率和緩解氧化應激[13]。由此可見,大蒜辣素屬于典型的多靶點活性化合物,是具有良好潛質(zhì)的抗生素替代品,但是蒜粉或者大蒜辣素作為飼料添加劑長期應用,對動物機體的CYP450酶系是否產(chǎn)生誘導或者抑制作用,尚未進行過評價。鑒于CYP1A2底物或抑制劑(如飼料中的黃曲霉毒素、常用藥物恩諾沙星等)與獸醫(yī)臨床密切相關,因此,本研究首次采用體內(nèi)外方法探討了大蒜辣素對肉雞CYP1A2的mRNA表達量以及CYP1A2酶活性的影響。該研究一方面可預測大蒜辣素在飼料中添加是否會引起藥物代謝方面的相互作用,為獸醫(yī)臨床合理使用提供理論指導,另一方面為飼料添加劑的安全性評價提供研究范式和參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

1日齡雄性AA肉雞,體重45～55 g,購自南京特給力種植專業(yè)合作社。肉雞飼養(yǎng)于南京農(nóng)業(yè)大學實驗室動物房,入雛前24 h將雞舍升溫至32～35 ℃,此后溫度每周降低2～3 ℃,直至保持在22～24 ℃,且雞舍采光、通風良好,保暖、飲水和采食設施完善。本研究經(jīng)南京農(nóng)業(yè)大學動物倫理委員會批準(NJAU.No20211130184)。動物的處死和取樣等程序符合中國科技部《試驗動物管理和治療規(guī)范》(2006)398號以及《實驗動物管理和治療條例》(2008)第45號。

1.2 試劑與藥品

蒜粉(蒜氨酸質(zhì)量分數(shù)為3.5%,產(chǎn)生潛在大蒜辣素質(zhì)量分數(shù)為1.603%),由新疆醫(yī)科大學提供,按照蒜粉中蒜氨酸的質(zhì)量分數(shù)計算其轉(zhuǎn)化為大蒜辣素量(1 g蒜氨酸產(chǎn)生0.458 g大蒜辣素)[14],根據(jù)試驗設定大蒜辣素劑量,臨用時由蒜粉加水反應10 min后過濾,濾液噴灑飼料拌勻使用。無菌生理鹽水購自南京艾瑞思生物技術(shù)有限公司;非那西丁和對乙酰氨基酚標準品均購自上海安譜實驗科技有限公司;α-萘黃酮標準品購自南京斐諾生物科技有限公司;乙腈購自南京巨優(yōu)科學器材有限公司;HPLC用水為超純水系統(tǒng)購自美國Ohaus公司;0.05 mol·L-1Tris-HCl緩沖液(pH 7.4)購自于南京邁博生物科技有限公司;煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸還原四鈉鹽(NADPH)(含量>98%)購自上海源葉生物科技有限公司;RNA-easy Isolation Reagent(R701)、Reverse-transcribed to cDNA(Vazyme R223-01)和ChamQ qPCR SYBR Green Master Mix(Q311-02/03)均購自南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 肉雞分組及處理 90只1日齡AA肉雞,適應性飼養(yǎng)4 d后,隨機分為3組,分別為對照組、大蒜辣素處理組(40和80 mg·kg-1),每組肉雞等分為3批,于給藥后不同時間點采集肝組織用于制備微粒體并提取肝總RNA。試驗具體分組和處理情況見圖1所示。

1.3.2 雞肝微粒體的制備 參考劉婉玉等[15]的鈣離子沉淀法制備肝微粒體。將凍存的肝組織置于研缽中(液氮)研磨后稱重,按照肝重∶蔗糖溶液為1∶4的比例加入0.25 mol·L-1蔗糖溶液后勻漿5 min(在冰上進行)。制備好的肝勻漿液于4 ℃、12 000 r·min-1離心15 min,取上清液,按照體積比10∶1加入濃度為88 mmol·L-1的CaCl2溶液,置于冰水浴中輕攪混勻5 min,然后再于12 000 r·min-1、4 ℃離心15 min后,取沉淀,用0.05 mol·L-1、pH 7.4的Tris-HCl緩沖液沖洗沉淀(除去多余的鈣離子)并重懸,12 000 r·min-1、4 ℃離心15 min,再次重懸離心后取沉淀,用含20%甘油的Tris-HCL緩沖液重懸,保存至-80 ℃冰箱備用。

1.3.3 HPLC檢測雞肝微粒體中對乙酰氨基酚

1.3.3.1 樣品的前處理及HPLC檢測條件的確定:樣品的前處理:樣品加入55 μL冰乙腈后立即置于-20 ℃冰箱中終止反應,12 000 r·min-1、4 ℃,離心15 min,取上清過0.22 μm濾膜,用于HPLC分析。

優(yōu)化的HPLC檢測條件:色譜柱為Diamonsil磚石 Ⅱ 代C18(5 μm,250 mm×4.6 mm),柱溫為室溫,進樣量為20 μL。流動相為水(A)和甲醇(B),流速為1 mL·min-1,流動相比例為A∶B=55∶45,檢測波長為254 nm。

第三，網(wǎng)絡威脅的防范能力不足。雖然各國適當加強了網(wǎng)絡威脅防范措施，但許多國家仍未做好應對網(wǎng)絡攻擊的準備。在擁有核材料或核設施的國家和地區(qū)中，1/3缺乏基本的網(wǎng)絡安全法規(guī)，2/3沒有制訂網(wǎng)絡事件響應計劃。自2016年以來，僅有12個國家加強了網(wǎng)絡安全法規(guī)建設。僅有12個國家和地區(qū)在網(wǎng)絡安全方面的得分是滿分，確認這些這些國家和地區(qū)已經(jīng)制定基礎的網(wǎng)絡安全法規(guī)。

1.3.3.2 標準曲線、檢測限和定量限的測定:取滅活的空白雞肝微粒體10 μL,分別加入2.5 μL系列濃度的對乙酰氨基酚標準溶液,配制成濃度為0.005、0.01、0.02、0.04、0.1、0.2、0.4和0.8 mmoL·L-1的對乙酰氨基酚,再加入5 μL 50 mmol·L-1NADPH溶液,最后用Tris-HCL溶液補足至250 μL,渦旋混勻后于41 ℃振蕩搖床中孵育40 min,按照“1.3.3.1”方法處理樣品。分別以對乙酰氨基酚的濃度為橫坐標,峰面積為縱坐標繪制標準曲線,并計算相關系數(shù)。選擇低濃度對乙酰氨基酚的樣品,經(jīng)前處理之后,將樣品測定3次,不同時間內(nèi)重復上述3次,取9次測定結(jié)果的均值S和N,以信噪比S/N≥3時樣品的最低濃度為該方法的檢測限(LOD),以達到信噪比S/N≥10時樣品的最低濃度為該方法的定量限(LOQ)。

1.3.3.3 準確度和精密度的測定:取滅活的空白雞肝微粒體10 μL,加入系列濃度的對乙酰氨基酚標準溶液配成終濃度0.03、0.10和0.60 mmol·L-1后,加入5 μL NADPH溶液,用Tris-HCl溶液補足至250 μL,渦旋混勻后,于41 ℃振蕩搖床中孵育40 min后取出,按照“1.3.3.1”方法處理樣品。日內(nèi)不同時間每個濃度重復3次,連續(xù)測定3 d,分別計算日內(nèi)和日間變異系數(shù),并代入標準曲線計算回收率(%)。如果日內(nèi)相對標準偏差(RSD)和日間RSD均小于15%,則符合生物樣品定量檢測的要求。

1.3.4 大蒜辣素處理對肉雞CYP1A2酶活性的影響 分別將對照組、40和80 mg·kg-1大蒜辣素處理組肝微粒體于冰上解凍,每組各取10 μL微粒體混合液置于2 mL EP管內(nèi),加入探針底物非那西丁,用Tris-HCL溶液補足至245 μL,41 ℃振蕩預孵育5 min后,加入5 μL NADPH啟動反應(微粒體孵育總體系為250 μL),繼續(xù)在41 ℃振蕩孵育40 min后取出,按照“1.3.3.1”方法處理樣品,以對乙酰氨基酚的生成量反映CYP1A2酶活性的變化。每次測定均設置5個平行。

1.3.5 大蒜辣素處理對肉雞CYP1A2 和CXRmRNA表達的影響按照RNA提取試劑說明書提取肝總RNA,測定A260 nm/A280 nm比值為1.8～2.0以及A260 nm/A230 nm比值大于2.0。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作將RNA反轉(zhuǎn)成cDNA,依次加入2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix、特異性引物及dd H2O渦旋混勻并離心之后進行cDNA擴增(注意避光操作)。內(nèi)參β-actin基因和目的基因CYP1A2、CXR的上下游引物均用Primer 5軟件設計,由擎科生物科技有限公司合成。引物序列如表1所示。目的基因的mRNA相對表達量采用2-△△Ct法計算[16]。

表1 目的基因及內(nèi)參基因的引物序列Table 1 Primer sequences of target genes and reference genes

1.3.6 大蒜辣素對CYP1A2酶動力學的影響 1.3.6.1 α-萘黃酮和大蒜辣素對CYP1A2酶的半數(shù)抑制濃度(IC50)測定:雞肝微粒體孵育總體系為250 μL。取10 μL空白微粒體混合液置于2 mL EP管中,加入底物非那西丁和系列濃度α-萘黃酮或大蒜辣素后,具體操作如“1.3.4”方法所述,孵育體系中α-萘黃酮的終濃度分別是0.05、0.1、0.2、0.5、0.8、1.0、2.0和5.0 μmol·L-1;大蒜辣素的終濃度分別是5、10、25、50、100和200 μmol·L-1。以剩余肝CYP1A2的活性作為縱坐標,α-萘黃酮或大蒜辣素濃度的對數(shù)作為橫坐標繪圖。采用GraphPad Prism 9軟件計算抑制作用的IC50,每次測定均設置3個平行。

1.3.6.2 α-萘黃酮和大蒜辣素對CYP1A2酶的抑制常數(shù)(Ki)測定:雞肝微粒體孵育同“1.3.6.1”方法所述,孵育體系中α-萘黃酮的終濃度為0.10和0.50 μmol·L-1;大蒜辣素的終濃度為10、20和40 μmol·L-1;探針非那西丁的濃度分別是25、50、100、150和200 μmol·L-1。并對酶動力學數(shù)據(jù)采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法進行非線性曲線擬合,確定抑制類型,采用GraphPad軟件計算Ki值。每次測定均設置3個平行。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析 各組間顯著性差異采用GraphPad軟件進行單因素方差分析。*.P<0.05;**.P<0.01;***.P<0.001。

2 結(jié) 果

2.1 對乙酰氨基酚的HPLC方法學考察

2.1.1 專屬性 經(jīng)優(yōu)化處理之后,獲得了雞肝微粒體樣品中非那西丁及其代謝產(chǎn)物對乙酰氨基酚的HPLC最佳檢測條件。結(jié)果如圖2所示,待測藥物與雜質(zhì)峰分離良好,表明該法的特異性和專一性良好,對乙酰氨基酚和非那西丁的出峰時間分別為3.22和10.90 min。

A. 空白肝微粒體;B. 流動相加入標準品(對乙酰氨基酚100 μmol·L-1,非那西丁50 μmol·L-1);C. 空白肝微粒體加入標準品(對乙酰氨基酚10 μmol·L-1,非那西丁200 μmol·L-1)。1和3. 對乙酰氨基酚;2和4. 非那西丁A. Blank liver microsome; B. Mobile phase added with standard substance (acetaminophen 100 μmol·L-1, phenacetin 50 μmol·L-1); C. Blank liver microsomes added with standard substance (acetaminophen 10 μmol·L-1, phenacetin 50 μmol·L-1). 1 and 3. Acetaminophen; 2 and 4. Phenacetin圖2 空白雞肝微粒體中非那西丁和對乙酰氨基酚的色譜圖Fig.2 Chromatogram of phenacetin and acetaminophen in blank chicken liver microsomes

2.1.2 標準曲線方程及檢測限和定量限 如圖3所示,在0.01～0.80 mmol·L-1,對乙酰氨基酚濃度與峰面積的線性關系良好,標準曲線回歸方程為y=6.595 1x-0.057 0,R2=0.999 4。對乙酰氨基酚的檢測限(LOD)和定量限(LOQ)分別為0.005和0.01 mmol·L-1。

圖3 對乙酰氨基酚的標準曲線Fig.3 The standard curve of acetaminophen

2.1.3 準確度和精密度 如表2所示,雞肝微粒體中對乙酰氨基酚回收率為94.61% ～96.32%,日內(nèi)RSD≤2.85%,日間RSD≤14.83%,均符合生物樣品的測定要求。

表2 對乙酰氨基酚在雞肝微粒體中的準確度和精密度(n=5)Table 2 Accuracy and precision of acetaminophen in chicken liver microsomes (n=5)

2.2 大蒜辣素對肉雞肝CYP1A2酶活性的影響

大蒜辣素對肉雞CYP1A2酶活性的影響見圖4。添加不同濃度大蒜辣素第14和28天時,肉雞肝微粒體中CYP1A2酶活性分別顯著增加為對照組的1.2倍和1.4倍(P<0.05),但第42天時40和80 mg·kg-1大蒜辣素分別使CYP1A2酶活性極顯著下降至對照組的80%和62%(P<0.001)。該結(jié)果提示大蒜辣素對肉雞CYP450酶活性的影響呈現(xiàn)雙向作用。

結(jié)果用表示,下同。*.P<0.05,**.P<0.01,***.P<0.001The results are expressed as ”, the same as below.*.P<0.05,**.P<0.01,***.P<0.001圖4 大蒜辣素對肉雞CYP1A2酶活性的影響(n=5)Fig.4 Effect of allicin on CYP1A2 enzyme activity of broilers (n=5)

2.3 大蒜辣素對肉雞肝組織CYP1A2和CXR mRNA表達的影響

RT-qPCR檢測肝組織中CYP1A2和CXR的基因表達情況如圖5所示。結(jié)果顯示不同濃度大蒜辣素分別處理肉雞后第14 和28天時,高劑量(80 mg·kg-1)大蒜辣素可使CYP1A2基因的mRNA表達量分別極顯著上升為對照組的1.8倍和4.0倍(P<0.01),而低劑量(40 mg·kg-1)大蒜辣素處理組與對照組相比差異不顯著(P>0.05),第42天時,高劑量和低劑量大蒜辣素處理組CYP1A2基因的表達量均顯著下調(diào)為對照組的50%(P<0.05;P<0.01);大蒜辣素對肉雞肝CXR的mRNA表達量影響呈現(xiàn)與CYP1A2相似情況,即80 mg·kg-1大蒜辣素處理肉雞后第14 和28天時,CXR基因的表達量均顯著上調(diào)(為對照組的1.8倍)(P<0.05),而在第42天時,40和80 mg·kg-1大蒜辣素處理組CXR基因的表達量均極顯著下調(diào)(P<0.01),為對照組的50%。

*.P<0.05,**.P<0.01,***.P<0.001,ns.P>0.05圖5 大蒜辣素對肉雞CYP1A2和CXR mRNA表達的影響(n=6)Fig.5 Effects of allicin on CYP1A2 and CXR mRNA expression in broilers (n=6)

2.4 大蒜辣素對CYP1A2底物非那西丁O-脫乙基化活性的半數(shù)抑制濃度(IC50)

圖6A和B分別為CYP1A2的經(jīng)典抑制劑α-萘黃酮和大蒜辣素對CYP1A2 抑制作用的擬合抑制曲線。計算可得α-萘黃酮對CYP1A2的IC50值為0.29 μmol·L-1,表現(xiàn)為較強的抑制作用,對量效關系進行線性回歸,α-萘黃酮對數(shù)濃度在-1.0～0.3范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關系,線性回歸方程為y=-45.91x+20.30,R2=0.99(圖6C)。在此條件下,測得大蒜辣素的IC50值為18.87 μmol·L-1,大蒜辣素濃度在0.699～1.699范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關系,線性回歸方程為y=-75.18x+153.10,R2=0.98(圖6D)。

2.5 大蒜辣素對非那西丁O-脫乙基化活性的抑制常數(shù)(Ki)

圖7(A和C)是α-萘黃酮和大蒜辣素對CYP1A2抑制曲線采用Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)法作圖獲得的直線。結(jié)果顯示直線均相交于X軸。當無抑制劑時,非那西丁O-脫乙基化活性的最大反應速率Vmax為(16.03±0.34)nmol·(mg·min)-1,當有抑制劑α-萘黃酮和大蒜辣素存在時,Vmax隨抑制劑濃度增加而變小,米氏常數(shù)Km均保持不變,為(128.57±4.36 )μmol·L-1,表明α-萘黃酮和大蒜辣素對雞肝微粒體CYP1A2的抑制作用類型為非競爭性抑制。采用Km/Vmax和抑制劑濃度作線性回歸,計算α-萘黃酮和大蒜辣素對非那西丁O-脫乙基反應的抑制常數(shù)Ki分別為0.97 μmol·L-1(圖7B)和10.89 μmol·L-1(圖7D)。

2.6 大蒜辣素在不同處理時間和濃度下對CYP1A2抑制作用的影響

圖8顯示,不同濃度大蒜辣素與雞肝微粒體預孵育不同時間時,其對雞肝微粒體代謝非那西丁O-脫乙基化活性的抑制作用。圖8A顯示,同一濃度大蒜辣素處理時,CYP1A2剩余酶活性隨預孵育時間的增加而極顯著降低(P<0.001),呈現(xiàn)時間依賴性;圖8B顯示,預孵育時間相同時,CYP1A2剩余酶活性隨大蒜辣素濃度的增加而極顯著降低(P<0.001),且呈濃度依賴性。該結(jié)果提示大蒜辣素對雞肝微粒體CYP1A2的抑制作用表現(xiàn)為時間和濃度依賴性。

3 討 論

研究已證實獸醫(yī)臨床中因CYP450介導藥物間相互作用發(fā)生而導致嚴重不良反應,如泰妙菌素、泰樂菌素等與聚醚類抗生素在家禽聯(lián)用時,因前者可抑制CYP450酶活性導致聚醚類抗生素代謝障礙引起雞中毒甚至死亡[17]。除此之外,紅霉素、諾氟沙星、依諾沙星、柚子汁等對CYP1A2具有顯著抑制作用[18-19]。通常情況下,酶抑制所導致的藥物間相互作用要遠大于酶促反應,約占酶系統(tǒng)全部作用的70%左右[20]。因此新獸藥和飼料添加劑進行安全性評價時,也應考慮其對肝藥酶的影響。基于此,本試驗以蒜粉中的活性成分大蒜辣素為研究對象,率先評價了其對肉雞肝藥酶CYP1A2的表達及CYP1A2酶活性的影響。

大蒜辣素性質(zhì)不穩(wěn)定,常溫下易分解失活[6,21],為充分發(fā)揮大蒜辣素的活性,作者采用前體物質(zhì)蒜氨酸和蒜酶制備大蒜辣素添加到肉雞飼糧中[22],并優(yōu)化條件建立了體外肝微粒體孵育體系和探針藥物法評價其對CYP1A2酶活性的影響。值得注意的是大蒜辣素連續(xù)給與肉雞后第14和28天時,會顯著增加CYP1A2酶活性,但在第42天時,CYP1A2酶活性反而會極顯著下降,進一步對編碼該酶的基因表達水平進行檢測,發(fā)現(xiàn)與酶活性變化的趨勢基本一致,即大蒜辣素對CYP1A2酶活性和mRNA表達的影響均表現(xiàn)出明顯的先誘導后抑制的雙向作用。這與常偉宇[23]的有關黃連素對CYP3A先誘導后抑制的作用一致,但是也有文獻顯示五味子水提物對大鼠肝微粒體 CYP3A也表現(xiàn)為雙重的調(diào)節(jié)作用,但表現(xiàn)為先抑制后誘導的現(xiàn)象[24-25]。由此可見,天然化合物或者中藥對機體肝藥物代謝酶的影響較為復雜,大蒜辣素對CYP1A2酶表現(xiàn)的雙重作用機制尚需深入探討。此外,草藥成分或天然產(chǎn)物改變CYP450的表達或活性對CYP450底物的吸收和生物利用度具有重要意義[26]。因此,本研究后續(xù)還需進一步研究大蒜辣素處理對CYP1A2底物非那西丁在肉雞體內(nèi)的藥代動力學的影響,進而闡明其臨床意義。

研究表明,小鼠和人的肝CYP2B和CYP3A基因受組成型雄烷受體CAR(constitutive androstane receptor)和孕烷X受體PXR(pregnane X receptor)調(diào)控[27-28]。雞組織中未發(fā)現(xiàn)PXR或CAR,但發(fā)現(xiàn)核內(nèi)受體CXR(chicken xenobiotic receptor)具有與哺乳動物PXR和CAR相似功能,可調(diào)節(jié)異源代謝酶CYP2H1和CYP2C45以及ABCG2[29]。因此作者進一步探究了大蒜辣素對肉雞肝CXRmRNA表達的影響,結(jié)果顯示,其對CXR也表現(xiàn)出雙向的調(diào)節(jié)作用,并與CYP1A2 mRNA表達的變化趨勢具有較強的相關性,后續(xù)作者將采用RNA干擾或者過表達的方法進一步探討大蒜辣素是否通過CXR調(diào)控雞CYP1A2的表達。由于缺少雞源CYP1A2抗體,故本研究未能研究大蒜辣素對CYP1A2蛋白表達的影響。目前本實驗室也在制備和純化雞源CYP特異性單克隆抗體,以期能建立和完善雞源CYP450 研究體系和平臺。

另外,體內(nèi)結(jié)果顯示長時間使用大蒜辣素會對CYP1A2產(chǎn)生抑制作用,故本研究進一步優(yōu)化了探針藥物法測定了大蒜辣素對CYP1A2的酶抑制動力學影響。通過將不同濃度α-萘黃酮和CYP1A2的底物非那西丁按照建立的體外孵育方法共同孵育,測得其IC50值和Ki值分別為0.29 μmol·L-1和0.97 μmol·L-1,這和前人的研究結(jié)果是一致的[30-31],證明作者的體外孵育方法可靠,在此條件下測得大蒜辣素對CYP1A2的IC50值為18.87 μmol·L-1。根據(jù)通用的CYP450酶抑制劑強度分級規(guī)則[32-33],IC50值<1 μmol·L-1為強抑制劑,IC50值在1 ～ 10 μmol·L-1為中等抑制劑,IC50值>10 μmol·L-1為弱抑制劑,表明大蒜辣素為CYP1A2的弱抑制劑。Lineweaver-Burk作圖法計算大蒜辣素對CYP1A2的Ki值為10.89 μmol·L-1,并表現(xiàn)為非競爭性抑制,表明大蒜辣素并非與底物競爭酶活性位點而導致抑制作用,其抑制機制有待進一步闡明。雖然大蒜辣素為CYP1A2的弱抑制劑,但本試驗顯示長期添加對酶活性還是能夠產(chǎn)生顯著影響,所以臨床中大蒜辣素與 CYP1A2 底物類藥物合用或者機體暴露于外源性化合物如黃曲霉毒素時, 應考慮到藥物-藥物相互作用或者藥物-外源化合物相互作用,尤其對于治療窗較窄的藥物特別需要注意毒性作用產(chǎn)生。另外,后續(xù)還需細致探討階段性不連續(xù)使用大蒜辣素對雞肝藥酶活性影響的特點,為臨床實際應用提供參考。

4 結(jié) 論

本試驗通過將40 和80 mg·kg-1的大蒜辣素分別連續(xù)14、28和42 d添加于肉雞飼糧中,發(fā)現(xiàn)大蒜辣素對CYP1A2的酶活性和 mRNA表達均表現(xiàn)出明顯的先誘導后抑制的雙向作用;大蒜辣素對CXR基因表達的影響與CYP1A2 mRNA表達的變化趨勢具有較強的相關性;此外,本研究表明大蒜辣素對CYP1A2表現(xiàn)為非競爭性抑制,雖是CYP1A2的弱抑制劑,但長期使用大蒜辣素對肉雞肝CYP1A2產(chǎn)生顯著影響,需注意其介導的藥物間相互作用。