梁 睿,范小瑞,張晉強,龐全海*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院,太谷 030801;2.中華人民共和國晉陽海關,太原 030027)

在哺乳動物皮膚組織中,黑色素的數(shù)量及類型對毛色起重要作用[1]。同時,黑色素是動物皮膚組織的“遮陽傘”,保護動物機體皮膚免受太陽紫外線輻射引起的DNA損傷和突變[2]。胚胎時期的神經(jīng)嵴細胞(neural crest cells, NCC)是黑色素前體細胞的起源,前體細胞經(jīng)逐步分化、發(fā)育形成黑色素細胞,黑色素由黑色素細胞中的細胞器黑色素小體產(chǎn)生[3]。黑色素的合成及動物皮膚組織色素沉著受到多種遺傳基因和發(fā)育途徑的調控[4]。Wnt信號通路在神經(jīng)嵴黑色素細胞的發(fā)育過程中具有重要作用,研究證實,增強Wnt1信號能夠使具有內皮素3(endothelin 3,EDN3)依賴性的神經(jīng)嵴黑色素細胞數(shù)量增加,增強神經(jīng)嵴黑色素細胞的色素沉著[5]。Wnt3α通過經(jīng)典通路在黑色素細胞的發(fā)育過程中起重要的調控作用,可以促進神經(jīng)嵴細胞分化為黑色素細胞[6],可顯著增強酪氨酸蛋白激酶活性和黑色素的合成[7],缺乏Wnt1和Wnt3α的突變小鼠幾乎完全缺失神經(jīng)嵴細胞起源的黑色素細胞[8]。小眼畸形相關轉錄因子(microphthalmia-associated transcription factor, MITF)是黑色素細胞發(fā)育、生存和發(fā)揮功能的重要調節(jié)因子,MITF基因缺失的小鼠表現(xiàn)出神經(jīng)嵴來源的黑色素細胞丟失[9-10]。這些因子之間存在相互作用,Wnt3α通過作用于黑色素母細胞維持MITF的表達,從而促進黑色素母細胞分化形成黑色素細胞[11],也可通過上調MITF的表達,增加酪氨酸酶活性,促進黑色素合成[6]。經(jīng)典Wnt通路通過β-catenin的積累實現(xiàn),因此也稱作Wnt/β-catenin通路[12],β-catenin與MITF的近端啟動子存在相關性[13],提示β-catenin在黑色素生成中發(fā)揮關鍵作用。

色素上皮衍生因子(pigment epithelium-derived factor, PEDF)是一種50 ku的分泌型糖蛋白,屬于非抑制性絲氨酸家族[14]。研究證實,在人黑色素細胞中,存在PEDF的表達,且PEDF蛋白在健康皮膚組織的表達量最高,其次是色素痣,在黑色素瘤的表達量最低[15];PEDF對黑色素細胞的過度增殖有抑制作用[16]。

雖然PEDF對黑色素細胞的生物學活性和黑色素的合成具有調控作用,但具體的調控機制尚不清楚,調控黑色素合成的關鍵因子與PEDF之間是否存在互作關系也尚不明確。因此,本研究選取小鼠黑色素細胞,探索PEDF與黑色素合成相關因子之間是否存在互作關系,以期探索PEDF對哺乳動物皮膚組織黑色素合成的調控作用。為進一步研究動物毛色形成提供基礎,同時也為動物經(jīng)濟性狀育種提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

選取出生1 d以內的野生型C57BL/6小鼠,雄性和雌性各3只,取下整塊背部皮膚(經(jīng)山西農(nóng)業(yè)大學實驗動物倫理委員會審批),用于黑色素細胞的分離培養(yǎng)。

1.2 主要試劑

RNA提取試劑盒(上海生工生物技術股份有限公司),反轉錄試劑盒、熒光定量試劑盒(北京全式金生物技術有限公司),RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑PMSF(上海碧云天生物技術有限公司),BCA蛋白濃度測定試劑盒、ECL顯色液、DAPI試劑(中杉金橋生物技術有限公司),siRNA(通用生物股份有限公司);脂質體2000(Invitrogen公司);腺病毒穿梭質粒pDC316-mCMV-EGFP(Stratagene)、腺病毒輔助質粒pBHGlox(delta)E1,3Cre(Microbix)、DH5α感受態(tài)細胞(Thermo公司)。

多克隆兔抗PEDF抗體(北京博奧森生物技術有限公司),Wnt1和Wnt3α兔抗多克隆抗體、MITF、β-catenin和GAPDH兔抗單克隆抗體(Abcam)、HRP-驢抗兔IgG(北京索萊寶科技有限公司),驢抗兔Alexa FluorTMPlus 594熒光二抗(Thermo公司)。

1.3 小鼠黑色素細胞的分離培養(yǎng)

分別取小鼠整塊背部皮膚,置入含雙抗的PBS中,0.25%的Dispase Ⅱ酶4 ℃過夜消化。分離表皮與真皮,將表皮剪碎置于0.25%的胰蛋白酶中37 ℃水浴消化。加終止液終止消化,過濾并離心。棄上清,加入DMEM培養(yǎng)基,部分進行細胞計數(shù)。剩余部分置入6孔培養(yǎng)板中37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)1 h,更換黑色素細胞專用培養(yǎng)基。培養(yǎng)至小鼠黑色素細胞的細胞密度達到90%左右時,0.25%胰蛋白酶消化液37 ℃消化,終止。離心棄上清,加入RPMI-1640培養(yǎng)基重懸培養(yǎng)。

1.4 siRNA的合成與轉染黑色素細胞

根據(jù)GenBank中已登錄的小鼠PEDFmRNA序列(NM_011340.3),參考siRNA設計原則,設計合成3對siRNA及陰性對照。用于PEDF基因沉默的siRNA由通用生物技術有限公司通過常規(guī)化學合成,詳細的序列信息見表1。黑色素細胞生長到占六孔板面積60%～80%,進行轉染。設置陰性對照組(negative control, NC)、PEDF-siRNA組(包括PEDF-siRNA1、PEDF-siRNA2、PEDF-siRNA3)。首先,制備NC、siRNA稀釋液:用100 μL不含血清雙抗的培養(yǎng)基分別稀釋NC、PEDF-siRNA1、PEDF-siRNA2、PEDF-siRNA3,終濃度為100 nmol·L-1。其次,制備轉染試劑:用100 μL不含血清雙抗的培養(yǎng)基稀釋2 μL脂質體2000轉染試劑,混勻,常溫靜置5 min。最后,將轉染試劑與NC、siRNA稀釋液混勻,室溫靜置20 min。將轉染復合物加入6孔板中,200 μL·孔-1,前后輕搖細胞板混合均勻,細胞板置于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h,提取總蛋白和RNA進行測定。

表1 PEDF-siRNA序列Table 1 PEDF-siRNA sequences

1.5 PEDF過表達載體的構建與電轉染黑色素細胞

提取小鼠黑色素細胞RNA,反轉錄合成cDNA,根據(jù)GenBank中已登錄的小鼠PEDFmRNA序列(NM_011340.3),設計合成一對PEDF特異性引物,引物序列為F:5′-ATGCAGGCCCTGGTGCTACT-3′;R:5′-TTAAGTACTACTGGGGTCCA-3′。以小鼠黑色素細胞cDNA為模板擴增獲得PEDFcDNA片段,將該片段亞克隆于質粒pDC316-EGFP-cmv中,獲得重組的腺病毒穿梭質粒:pDC316-EGFP-cmv-PEDF。通過雙酶切的方式對重組質粒進行鑒定,鑒定正確后共轉染:通過脂質體2000,將重組腺病毒穿梭質粒pDC316-EGFP-cmv-PEDF與腺病毒輔助質粒pBHGlox(delta)E1,3Cre,共轉染至DH5α感受態(tài)細胞。在DH5α感受態(tài)細胞中,兩質粒發(fā)生同源重組,即可獲得重組腺病毒rAd-PEDF。制備高滴度病毒液,TCID50法測定病毒滴度,將病毒滴度調整為1012copies·mL-1。取5×106個狀態(tài)良好的對數(shù)生長期黑色素細胞懸液,1 000 r·min-1離心4 min。將細胞沉淀懸浮于210 μL DPBS,并轉移至1.5 mL EP管中,分別加入空載病毒(overexpression control, OE-con)、PEDF基因過表達腺病毒(overexpressionPEDF, OE-PEDF),輕輕混勻。轉移至電擊杯中,確定電擊杯中溶液無氣泡,且液面凸起后,蓋上電擊杯蓋并置于電轉儀,設定好電轉條件后進行電轉。待顯示峰圖正常后取出細胞液轉移至六孔板培養(yǎng)基中。細胞板置于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h,提取總蛋白和RNA進行測定。

1.6 黑色素細胞活力和黑色素含量檢測

MTT法檢測每組黑色素細胞活力;每組黑色素細胞用0.25%胰酶消化后收集,PBS沖洗2～3次,細胞計數(shù)后,用0.2 mol·L-1NaOH溶解黑色素細胞,使用475 nm波長的分光光度計檢測黑色素含量,每組重復3次。

1.7 RNA的提取和qRT-PCR檢測

參照NCBI小鼠PEDF、GAPDH、Wnt1、Wnt3α、MITF和β-catenin基因序列,利用primer premier 5.0軟件設計PCR擴增引物,送北京華大基因公司合成。引物序列見表2。參照RNA提取試劑盒說明書提取黑色素細胞的總RNA,測定濃度,參照反轉錄試劑盒說明書合成cDNA。反轉錄體系包括(20 μL):Total RNA 500 ng、Random Primer 1 μL,2×ES reaction Mix 10 μL,EasyScript ? RT/RI Enzyme Mix 1 μL,gDNA Remover 1 μL,加入無RNase-free Water至20 μL后,25 ℃孵育10 min, 42 ℃孵育15 min, 85 ℃孵育5 s。

表2 本試驗中所用的引物Table 2 Primers used in the test

以沉默和過表達PEDF后小鼠黑色素細胞cDNA為模板,檢測PEDF、Wnt1、Wnt3α、MITF和β-cateninmRNA水平的表達情況。按照SYBR Premix Ex TapTMⅡ 試劑盒說明書進行qRT-PCR,通過2-ΔΔCt法計算目的mRNA相對表達量。

1.8 蛋白表達水平檢測

根據(jù)蛋白提取試劑盒說明書提取黑色素細胞的總蛋白,使用BCA檢測試劑盒檢測蛋白濃度。制備目的蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳,電泳結束,轉移至PVDF膜上。PVDF膜經(jīng)5%脫脂奶粉室溫封閉2 h;加入PEDF、Wnt1、Wnt3α、MITF、β-catenin和內參GAPDH(1∶3 000稀釋)一抗4 ℃過夜孵育;次日取出PVDF膜,用TBST清洗3×10 min,分別加入1∶3000稀釋的驢抗兔IgG-HRP,37 ℃孵育1 h,TBST反復清洗6×5 min,使用ECL試劑盒顯色,并使用ChemiDOC XRS+成像儀掃描膜。使用Image-Pro Plus軟件對目的蛋白和GAPDH免疫印跡結果進行分析。蛋白含量=條帶面積×平均灰度;目的蛋白半定量值=目的蛋白含量/GAPDH蛋白含量。

1.9 細胞免疫熒光(IF)檢測

將各組小鼠黑色素細胞去除培養(yǎng)基,PBS漂洗3×5 min,4%的甲醛固定15 min。丟棄固定液,PBS漂洗3×5 min。封閉液封閉1 h,按照1∶200的比例稀釋一抗(PEDF、Wnt1、Wnt3α、MITF和β-catenin),4 ℃孵育過夜。PBS漂洗3×5 min。1∶500的比例稀釋驢抗兔Alexa FluorTMPlus 594熒光二抗,室溫避光孵育1 h,PBS漂洗3×10 min,滴加DAPI,激光共聚焦顯微鏡觀察并拍照。

1.10 數(shù)據(jù)分析

2 結 果

2.1 siRNA對PEDF表達的影響

與NC組相比,3組PEDF-siRNA組PEDF表達量均極顯著(P<0.001)下降,其中PEDF-siRNA 2的沉默效率最佳,因此選擇PEDF-siRNA 2進行后續(xù)試驗(圖1)。

CON.空白對照組;NC.陰性對照組;***. P<0.001CON. Blank control; NC. Negative control; ***. P<0.001圖1 PEDF mRNA的相對表達量Fig.1 The relative expression quantity of PEDF mRNA

2.2 黑色素細胞電轉染

電轉染結果表明,在540 V(30 ms,1pulse)條件下,PEDF過表達載體組熒光強度明顯高于空載組,故在后續(xù)PEDF過表達載體轉染黑色素細胞試驗中選擇540 V(30 ms,1pulse)條件下轉染(圖2)。

Control組為正常培養(yǎng)的黑色素細胞;OE-con組為轉染空載體的黑色素細胞;OE-PEDF為轉染PEDF過表達載體的黑色素細胞。標尺=25 μmThe Control group. Normal melanocytes; OE-con. The melanocytes transfected with empty vector; OE-PEDF. The melanocytes transfected with PEDF overexpression vector. Bar=25 μm圖2 PEDF過表達載體轉染黑色素細胞的效率Fig.2 The efficiency of transfected melanocytes with PEDF overexpression vector

2.3 沉默及過表達PEDF對小鼠黑色素細胞活力的影響

檢測沉默及過表達PEDF后小鼠黑色素細胞的細胞活力,結果顯示:PEDF-siRNA轉染小鼠黑色素細胞后,黑色素細胞活力極顯著(P<0.001)高于NC組;OE-PEDF組黑色素細胞活力極顯著(P<0.001)低于OE-con組,在PEDF高表達的情況下,黑色素細胞活力受到顯著抑制(圖3)。

NC.陰性對照組;OE-con.轉染空載體的黑色素細胞;***. P<0.001NC. Negative control; OE-con. The melanocytes transfected with empty vector. ***. P<0.001圖3 沉默和過表達PEDF對黑色素細胞活力的影響Fig.3 Effect of silencing and overexpression of PEDF on melanocyte activity

2.4 沉默及過表達PEDF對黑色素含量的影響

測定沉默及過表達PEDF后黑色素細胞中的黑色素含量,結果顯示:siRNA-PEDF組黑色素含量極顯著(P<0.001)高于NC組;OE-PEDF組黑色素含量極顯著(P<0.01)低于OE-con組。PEDF基因表達情況與黑色素含量的關系說明:PEDF對黑色素合成存在抑制作用(圖4)。

NC.陰性對照組;OE-con.轉染空載體的黑色素細胞;***. P<0.001;**. P<0.01NC. Negative control; OE-con. The melanocytes transfected with empty vector. ***. P<0.001; **. P<0.01圖4 沉默及過表達PEDF對黑色素細胞黑色素合成的影響Fig.4 Effect of silencing and overexpression of PEDF on melanin synthesis in melanocytes

2.5 沉默及過表達PEDF后相關基因mRNA水平檢測

qRT-PCR檢測沉默及過表達PEDF后黑色素細胞中PEDF及相關基因Wnt1、Wnt3α、MITF和β-catenin的表達情況,結果顯示:沉默PEDF基因后,黑色素細胞中PEDFmRNA的表達量是NC組的47%,極顯著(P<0.001)低于NC組,進一步說明用于基因沉默的siRNA構建成功(圖5A);Wnt1 mRNA表達量是NC組的2.29倍,極顯著(P<0.001)高于NC組(圖5B);Wnt3αmRNA表達量是NC組的1.11倍,極顯著(P<0.001)高于NC組(圖5C);MITFmRNA表達量是NC組的1.11倍,極顯著(P<0.001)高于NC組(圖5D);β-cateninmRNA表達量是NC組的1.79倍,極顯著(P<0.001)高于NC組(圖5E)。說明在RNA水平上,PEDF負調控Wnt1、Wnt3α、MITF和β-catenin的表達。

NC.陰性對照組;OE-con.轉染空載體的黑色素細胞;A. PEDF基因表達量分析;B. Wnt1基因表達量分析;C. Wnt3α基因表達量分析 D. MITF基因表達量分析;E. β-catenin基因表達量分析。***. P<0.001NC. Negative control; OE-con. The melanocytes transfected with empty vector. A. PEDF gene expression analysis; B. Wnt1 gene expression analysis; C. Wnt3α gene expression analysis; D. MITF gene expression analysis; E. β-catenin gene expression analysis. ***. P<0.001圖5 相關基因的qRT-PCR 檢測Fig.5 qRT-PCR detection of related genes

PEDF基因過表達后,黑色素細胞中PEDFmRNA的表達量極顯著(P<0.001)高于OE-con組,是OE-con組的1.5倍(圖5A);Wnt1 mRNA表達量極顯著(P<0.001)低于OE-con組,是OE-con組的42%(圖5B);Wnt3αmRNA表達量極顯著(P<0.001)低于OE-con組,是OE-con組的79%(圖5C);MITFmRNA表達量極顯著(P<0.001)低于OE-con組,是OE-con組的78%(圖5D);β-cateninmRNA表達量極顯著(P<0.001)低于OE-con組,是OE-con組的57%(圖5E)。說明在RNA水平上,PEDF負調控Wnt1、Wnt3α、MITF和β-catenin的表達。PEDF沉默和過表達后相關基因的表達情況相符,均說明PEDF負調控Wnt1、Wnt3α、MITF和β-catenin的表達。

2.6 沉默及過表達PEDF后相關蛋白表達水平檢測

試驗結果顯示(圖6):沉默及過表達PEDF后PEDF、Wnt1、Wnt3α、MITF和β-catenin的蛋白表達變化趨勢與mRNA表達變化趨勢基本一致。

NC.陰性對照組;OE-con.轉染空載體的黑色素細胞NC. Negative control; OE-con. The melanocytes transfected with empty vector圖6 沉默及過表達PEDF后黑色素細胞內相關蛋白表達水平檢測Fig.6 Detection of related protein expression levels in melanocytes after PEDF silencing and overexpression

對Western blotting結果進行灰度值分析可知:沉默PEDF基因后,黑色素細胞中PEDF蛋白的表達量極顯著(P<0.001)低于NC組,是NC組的50%(圖7A);Wnt1蛋白表達量極顯著(P<0.001)高于NC組,是NC組的2.38倍(圖7B);Wnt3α蛋白表達量極顯著(P<0.001)高于NC組,是NC組的2.50倍(圖7C);MITF蛋白表達量極顯著(P<0.001)高于NC組,是NC組的4.67倍(圖7D);β-catenin蛋白表達量極顯著(P<0.001)高于NC組,是NC組的1.99倍(圖7E)。PEDF基因過表達后,黑色素細胞中PEDF蛋白的表達量極顯著(P<0.01)高于OE-con組,是OE-con組的1.30倍,與mRNA表達情況一致(圖7A);Wnt1蛋白表達量極顯著(P<0.001)低于OE-con組,是OE-con組的69%(圖7B);Wnt3α蛋白表達量極顯著(P<0.001)低于OE-con組,是OE-con組的24%(圖7C);MITF蛋白表達量極顯著(P<0.001)低于OE-con組,是OE-con組的56%(圖7D);β-catenin蛋白表達量顯著(P<0.05)低于OE-con組,是OE-con組的82%(圖7E)。PEDF沉默和過表達后相關蛋白的表達情況與mRNA表達情況相符,均說明PEDF負調控Wnt1、Wnt3α、MITF和β-catenin的表達。

NC.陰性對照組;OE-con.轉染空載體的黑色素細胞;A. PEDF蛋白表達量分析;B. Wnt1蛋白表達量分析;C. Wnt3α蛋白表達量分析;D. MITF蛋白表達量分析;E. β-catenin蛋白表達量分析。***. P<0.001;**. P<0.01;*. P<0.05NC. Negative control; OE-con. The melanocytes transfected with empty vector; A. PEDF protein expression analysis; B. Wnt1 protein expression analysis; C. Wnt3α protein expression analysis; D. MITF protein expression analysis; E. β-catenin protein expression analysis. ***. P<0.001; ;**. P<0.01; *. P<0.05圖7 相關蛋白表達水平檢測Fig.7 The expression levels of related proteins

2.7 PEDF與相關蛋白在小鼠黑色素細胞中的定位

沉默及過表達PEDF后,細胞免疫熒光法檢測黑色素細胞內PEDF、Wnt1、Wnt3α、MITF和β-catenin的表達及定位,結果顯示PEDF表達于黑色素細胞的細胞質(圖8A);黑色素細胞沉默PEDF后,PEDF熒光強度極顯著(P<0.001)低于NC組(圖8B);過表達PEDF后,黑色素細胞內PEDF熒光強度極顯著(P<0.001)高于OE-con組(圖8B)。Wnt1表達于黑色素細胞的細胞質(圖9A);黑色素細胞沉默PEDF后,Wnt1熒光強度與NC組相比無顯著差異(圖9B);過表達PEDF后,Wnt1熒光強度極顯著(P<0.01)低于OE-con組(圖9B)。Wnt3α表達于黑色素細胞的細胞質和細胞膜(圖10A);黑色素細胞沉默PEDF后,Wnt3α熒光強度極顯著(P<0.001)高于NC組(圖10B);過表達PEDF后,Wnt3α熒光強度極顯著(P<0.01)低于OE-con組(圖10B)。MITF表達于黑色素細胞的細胞質(圖11A);黑色素細胞沉默PEDF后,MITF熒光強度極顯著(P<0.001)高于NC組(圖11B);過表達PEDF后,MITF熒光強度極顯著(P<0.001)低于OE-con組(圖11B)。β-catenin表達于黑色素細胞的細胞質(圖12A);黑色素細胞沉默PEDF后,β-catenin熒光強度極顯著(P<0.001)高于NC組(圖12B);過表達PEDF后,β-catenin熒光強度極顯著(P<0.001)低于OE-con組(圖12B)。

NC.陰性對照組;OE-con.轉染空載體的黑色素細胞;A. 細胞免疫熒光技術檢測沉默及過表達PEDF后黑色素細胞中PEDF的表達與定位;B. 沉默及過表達PEDF后黑色素細胞中PEDF的光密度值分析。CP.細胞質;PEDF在黑色素細胞胞質中表達,圓圈代表陽性表達,圓圈個數(shù)越多,陽性表達越強;標尺=25 μm。***. P<0.001NC. Negative control; OE-con. The melanocytes transfected with empty vector; A. The expression and localization of PEDF in melanocytes after PEDF silencing and overexpression were detected by cellular immunofluorescence; B. Optical density analysis of PEDF in melanocytes after silencing and overexpression of PEDF. CP. Cytoplasm; PEDF was expressed in the cytoplasm of melanocytes, circles represent positive expression, and the more circles, the stronger the positive expression; Scale =25 μm. ***. P<0.001圖8 沉默及過表達PEDF后黑色素細胞中PEDF的表達與定位Fig.8 Expression and localization of PEDF in melanocytes after silencing and overexpression of PEDF

NC.陰性對照組;OE-con.轉染空載體的黑色素細胞;A. 細胞免疫熒光技術檢測沉默及過表達PEDF后黑色素細胞中Wnt1的表達與定位;B. 沉默及過表達PEDF后黑色素細胞中Wnt1的光密度值分析。CP.細胞質;Wnt1在黑色素細胞胞質中表達,圓圈代表陽性表達,圓圈數(shù)越多,陽性表達越強;標尺=25 μm。**. P<0.01NC. Negative control; OE-con. The melanocytes transfected with empty vector; A. The expression and localization of Wnt1 in melanocytes after PEDF silencing and overexpression were detected by cellular immunofluorescence; B. Optical density analysis of Wnt1 in melanocytes after silencing and overexpression of PEDF. CP. Cytoplasm; Wnt1 was expressed in the cytoplasm of melanocytes, circles represent positive expression, and the more circles, the stronger the positive expression; Scale =25 μm. **. P<0.01圖9 沉默及過表達PEDF后黑色素細胞中Wnt1的表達與定位Fig.9 Expression and localization of Wnt1 in melanocytes after silencing and overexpression of PEDF

NC.陰性對照組;OE-con.轉染空載體的黑色素細胞;A. 細胞免疫熒光技術檢測沉默及過表達PEDF后黑色素細胞中Wnt3α的表達與定位;B. 沉默及過表達PEDF后黑色素細胞中Wnt3α的光密度值分析。CP.細胞質;PM.細胞膜;Wnt3α在黑色素細胞細胞質和細胞膜表達,圓圈代表陽性表達,圓圈數(shù)越多,陽性表達越強;標尺=25 μm。***. P<0.001;**. P<0.01NC. Negative control; OE-con. The melanocytes transfected with empty vector; A. The expression and localization of Wnt3α in melanocytes after PEDF silencing and overexpression were detected by cellular immunofluorescence; B. Optical density analysis of Wnt3α in melanocytes after silencing and overexpression of PEDF. CP. Cytoplasm; PM. Cell membrane; Wnt3α was expressed in the cytoplasm and cell membrane of melanocytes, circles represent positive expression, and the more circles, the stronger the positive expression; Scale =25 μm. ***. P<0.001; **. P<0.01圖10 沉默及過表達PEDF后黑色素細胞中Wnt3α的表達與定位Fig.10 Expression and localization of Wnt3α in melanocytes after silencing and overexpression of PEDF

NC.陰性對照組;OE-con.轉染空載體的黑色素細胞;A. 細胞免疫熒光技術檢測沉默及過表達PEDF后黑色素細胞中MITF的表達與定位;B. 沉默及過表達PEDF后黑色素細胞中MITF的光密度值分析。CP.細胞質,MITF在黑色素細胞細胞質表達,圓圈代表陽性表達,圓圈數(shù)越多,陽性表達越強。標尺=25 μm。***. P<0.001NC. Negative control; OE-con. The melanocytes transfected with empty vector; A. The expression and localization of MITF in melanocytes after PEDF silencing and overexpression were detected by cellular immunofluorescence; B. Optical density analysis of MITF in melanocytes after silencing and overexpression of PEDF. CP. Cytoplasm, MITF was expressed in the cytoplasm of melanocytes, circles represent positive expression, and the more circles, the stronger the positive expression. Scale =25 μm. ***. P<0.001圖11 沉默及過表達PEDF后黑色素細胞中MITF的表達與定位Fig.11 Expression and localization of MITF in melanocytes after silencing and overexpression of PEDF

NC.陰性對照組;OE-con.轉染空載體的黑色素細胞;A. 細胞免疫熒光技術檢測沉默及過表達PEDF后黑色素細胞中β-catenin的表達與定位;B. 沉默及過表達PEDF后黑色素細胞中β-catenin的光密度值分析。CP.細胞質;β-catenin在黑色素細胞胞質中表達,圓圈代表陽性表達,圓圈數(shù)越多,陽性表達越強;標尺=25 μm。***. P<0.001NC. Negative control; OE-con. The melanocytes transfected with empty vector; A. The expression and localization of β-catenin in melanocytes after PEDF silencing and overexpression were detected by cellular immunofluorescence; B. Optical density analysis of β-catenin in melanocytes after silencing and overexpression of PEDF. CP. Cytoplasm; β-catenin was expressed in the cytoplasm of melanocytes, circles represent positive expression, and the more circles, the stronger the positive expression; Scale =25 μm. ***. P<0.001圖12 沉默及過表達PEDF后黑色素細胞中β-catenin的表達與定位Fig.12 Expression and localization of β-catenin in melanocytes after silencing and overexpression of PEDF

該結果與mRNA和蛋白水平結果趨勢相符,均證明在黑色素合成過程中,PEDF對促進黑色素合成的相關基因Wnt1、Wnt3α、MITF和β-catenin具有負調控作用。

3 討 論

哺乳動物毛色多樣性的遺傳與分子機制長期受到關注。一種發(fā)現(xiàn)于黑色素瘤的黑色素生成調控因子PEDF如何調控色素形成,其機制尚不清楚。本研究成功分離培養(yǎng)小鼠黑色素細胞,發(fā)現(xiàn)PEDF表達和定位于小鼠黑色素細胞;通過沉默小鼠黑色素細胞PEDF,發(fā)現(xiàn)黑色素細胞的活力和黑色素生成升高,黑色素生成正調控因子Wnt1、Wnt3α、MITF、β-catenin mRNA和蛋白表達水平上調;小鼠黑色素細胞過表達PEDF致黑色素細胞的活力減弱,黑色素生成減少,色素生成正調控因子Wnt1、Wnt3α、MITF、β-catenin mRNA和蛋白表達水平下降。qRT-PCR結果與Western blotting、細胞免疫熒光結果趨勢一致。

黑色素細胞和胚胎視網(wǎng)膜色素上皮細胞均來源于神經(jīng)嵴細胞[15,17],且胚胎色素上皮細胞可產(chǎn)生PEDF[17],推測黑色素細胞也可能產(chǎn)生PEDF。本研究顯示黑色素細胞中存在PEDF的表達,且PEDF的表達與黑色素的合成存在關聯(lián)。研究報道,PEDF在黑色素瘤中表達缺失或下調[14],認為PEDF對黑色素瘤細胞施加了抗增殖作用,誘導黑色素瘤細胞凋亡[18],本試驗結果與之相符,在PEDF表達下降時,黑色素細胞活力提高,PEDF高表達的情況下,黑色素細胞活力受到顯著抑制,提示PEDF對黑色素細胞活力有抑制作用,PEDF抑制黑色素細胞增殖或遷移。

先前研究發(fā)現(xiàn),PEDF在健康的皮膚中高度表達,在色素痣中的表達水平低于在健康皮膚中,在黑色素瘤細胞中的表達量最低,PEDF的表達量與黑色素合成量成反比[15],結合本試驗結果中PEDF表達情況與黑色素含量的關系,提示PEDF對黑色素合成存在抑制作用。

Wnt信號在黑色素細胞發(fā)育中起著關鍵作用,通過KEGG信號通路生物信息學分析提示,PEDF對Wnt信號通路具有調控作用,且與Wnt通路抑制劑Dickkopf等類似,調控位點位于Wnt家族與Frizzled受體結合域之間,提示PEDF可能通過抑制Wnt與受體的結合來抑制Wnt信號通路功能的發(fā)揮。因此,檢測沉默和過表達PEDF后Wnt通路中黑色素合成相關基因的表達情況,可以明確PEDF與調控黑色素合成的候選基因之間的互作關系,推測PEDF在Wnt通路中的位置,以及對黑色素合成的調控機制。Wnt1和Wnt3α是激活Wnt經(jīng)典通路的重要成員[19];在Wnt1和Wnt3α表達缺失的胚胎中,黑色素母細胞明顯缺乏[8];Wnt1和Wnt3α促進神經(jīng)嵴細胞向黑色素細胞的發(fā)育[11];Wnt1向成黑素細胞發(fā)出信號以增加黑色素細胞的數(shù)量。Wnt3α蛋白與受體的結合可以提高β-catenin的穩(wěn)定性,β-catenin進入細胞核后調節(jié)MITF的轉錄[20-21],上調MITF及其下游基因促進黑色素合成[7],相反,抑制Wnt/β-catenin信號通路能夠強烈抑制黑色素合成[22-23];先前研究發(fā)現(xiàn),在肝中,PEDF對Wnt/β-catenin信號存在抑制[24]。本研究發(fā)現(xiàn)小鼠黑色素細胞沉默PEDF導致Wnt下游分子β-catenin、MITF的表達上調,解除了PEDF對Wnt信號的抑制,黑色素細胞活力和黑色素合成增加。小鼠黑色素細胞過表達PEDF導致Wnt下游分子β-catenin、MITF的表達下降,加劇了PEDF對Wnt信號的抑制,黑色素細胞活力和黑色素合成減少。PEDF與Wnt1、Wnt3α、MITF和β-catenin的表達負相關,提示PEDF在Wnt信號通路中位于以上4種基因的上游,下調Wnt信號通路中促進黑色素合成因子的表達,抑制Wnt信號通路,從而抑制黑色素的合成。

本研究初步闡釋了PEDF與黑色素生成調節(jié)因子之間的互作關系,為進一步明確PEDF在黑色素合成過程中的調控機制提供了基礎;豐富了色素生產(chǎn)調控的分子機制,以期為人工調控動物毛色和膚色的深淺提供借鑒。

4 結 論

本研究發(fā)現(xiàn),色素上皮衍生因子對小鼠黑色素細胞活力存在抑制作用,通過抑制Wnt信號通路中Wnt1、Wnt3α、MITF、β-catenin的表達,從而減少黑色素的合成。