王棟梁,任 靜,郝琴琴,李鵬飛*

(1.朔州職業(yè)技術(shù)學(xué)院,朔州 036002;2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,太谷 030801)

牛在發(fā)情周期內(nèi)通常只有一個卵泡能夠發(fā)育成熟并排卵受精,絕大多數(shù)卵泡會在發(fā)育過程中走向閉鎖,過度的卵泡閉鎖嚴(yán)重制約著胚胎工程的應(yīng)用及優(yōu)良種畜擴(kuò)繁[1]?？煽ㄒ?苯丙胺調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄肽(cocaine and amphetamine regulated transcript peptide, CART)是下丘腦分泌的內(nèi)源性神經(jīng)肽,參與調(diào)控攝食、藥物成癮及激素分泌等多種生物過程[2-4]。研究表明,CART是牛卵泡發(fā)育過程中的關(guān)鍵調(diào)控因子[5],體外培養(yǎng)牛卵泡顆粒細(xì)胞(granulosa cells, GCs)發(fā)現(xiàn),添加CART可顯著抑制促卵泡素(follicle-stimulating hormone, FSH)誘導(dǎo)的GCs中雌激素(estrogen, E2)的分泌,GCs中芳構(gòu)化酶CYP19A1 mRNA表達(dá)量減少,因此認(rèn)為CART在牛卵泡發(fā)育過程中發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用[6]。

真核生物的基因表達(dá)極為復(fù)雜,可大致分為轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控,其中細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄水平對基因的表達(dá)調(diào)控最為經(jīng)濟(jì)有效,轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控依賴基因啟動子和特異性轉(zhuǎn)錄因子的相互作用。Shobatake等[7]報道,人CART啟動子區(qū)域存在轉(zhuǎn)錄因子GATA2、GATA3結(jié)合位點,進(jìn)一步研究表明干擾上述兩個轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)能夠消除由間歇性缺氧誘導(dǎo)的CARTmRNA水平上調(diào)。Zhang等[8]發(fā)現(xiàn),人CART啟動子和內(nèi)含子中均含有1個NRSF結(jié)合位點(NRSE),轉(zhuǎn)錄因子NRSF通過招募共阻遏復(fù)合物抑制CART表達(dá),且NRSF對內(nèi)含子NRSE的親和力高于啟動子NRSE。有研究發(fā)現(xiàn),給予可卡因刺激后,大鼠伏隔核中CART和轉(zhuǎn)錄因子CREB含量增加,ChIP試驗證明CREB直接與CART啟動子區(qū)域結(jié)合激活轉(zhuǎn)錄[9-10]。本課題組前期致力于篩選并鑒定位于牛卵泡GCs膜上的能夠與CART特異性結(jié)合并發(fā)揮調(diào)控作用的G蛋白偶聯(lián)受體[11-12],而目前對于牛CART轉(zhuǎn)錄因子鑒定及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制的研究也鮮有報道。

本研究利用PCR擴(kuò)增、生物信息學(xué)分析、雙熒光素酶報告基因試驗對牛CART基因核心啟動子區(qū)進(jìn)行分析與鑒定;DNA pull down篩選能夠與CART基因核心啟動子區(qū)特異性結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子,并通過體外試驗分析轉(zhuǎn)錄因子對牛CART基因核心啟動子轉(zhuǎn)錄活性的影響,為進(jìn)一步完善牛下丘腦CART基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò),分析并闡明CART基因調(diào)控卵泡發(fā)育的作用機(jī)理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗樣品

山西文水縣肉牛屠宰場選擇3頭正常發(fā)情的健康西門塔爾母牛,采集下丘腦組織后,投入滅菌DPBS中洗滌后液氮速凍,帶回實驗室處理。

1.2 試驗試劑

人胚胎腎上皮細(xì)胞(293T)由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實驗室保存;組織基因組DNA提取試劑盒(天根);2×TaqPCR Master Mix(中科瑞泰);限制性內(nèi)切酶KpnI、SmaI,TB Green? Premix ExTaqTMII(TaKaRa);pGL3-Basic載體、pRL-TK載體(Promega);pcDNA3.1(+)載體(Invitrogen);TransIntroTMEL(全式金);DNA pull down(伯信)。

1.3 試驗方法

1.3.1 啟動子序列結(jié)構(gòu)分析 從NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫中獲取牛CART(GenBank登錄號:NM_001007820)基因組DNA序列,選取轉(zhuǎn)錄起始位點(transcription start site, TSS)上、下游啟動子區(qū)域1 222 bp作為研究對象,利用EMBOSS數(shù)據(jù)庫(https://www.ebi.ac.uk/Tools/seqstats/emboss_cpgplot/)、MethPrimer數(shù)據(jù)庫(http://www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi)預(yù)測啟動子區(qū)內(nèi)潛在的CpG島位置;利用New PLACE數(shù)據(jù)庫(https://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/)分析啟動子上順式作用元件位點。

1.3.2 基因組DNA提取 根據(jù)組織基因組DNA提取試劑盒說明書從牛下丘腦組織中抽提DNA,Nanodrop超微量核酸蛋白測定儀檢測濃度及純度后,置于-20 ℃暫存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 引物設(shè)計、PCR擴(kuò)增及測序 利用Primer Premier 5.0針對CART啟動子區(qū)設(shè)計特異性引物,交由公司合成,引物詳細(xì)信息見表1。

1.3.4 重組載體構(gòu)建及雙熒光素酶活性檢測 根據(jù)順式作用元件位點對啟動子序列5′端進(jìn)行截短,具體截短長度及位置見圖1,在截短片段上、下游分別引入KpnI和SmaI酶切位點,交由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。利用限制性內(nèi)切酶KpnI和SmaI對pGL3-Basic質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切,酶切產(chǎn)物經(jīng)T4DNA連接酶連接后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞,選取陽性重組質(zhì)粒測序,重組質(zhì)粒分別命名為pGL3-314(-292 bp～+22 bp)、pGL3-497(-475 bp～+22 bp)、pGL3-827(-805 bp～+22 bp)、pGL3-1222(-1 200 bp～+22 bp)。

圖1 牛CART基因啟動子5′端截短示意圖Fig.1 Schematic diagram of bovine CART gene promoter 5′truncated promoter

將重組質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞48 h后,收集細(xì)胞并用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測每個樣品中螢火蟲熒光素酶與海腎熒光素酶活性,螢火蟲熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性的比值即為熒光素酶相對活性(relative luciferase activity, RLA)。

1.3.5 DNA pull down試驗 針對CART核心啟動子區(qū)域設(shè)計5′端生物素標(biāo)記探針,交由伯信公司合成,NC探針選擇編碼β-半乳糖苷酶的LacZ基因。提取牛下丘腦組織核蛋白,Bradford法測定樣品濃度,-80 ℃保存。上述生物素標(biāo)記的目的探針和NC探針分別與鏈霉親和素磁珠25 ℃結(jié)合1 h,向磁珠-探針混合物中加入核蛋白樣品,4 ℃旋轉(zhuǎn)孵育結(jié)合1 h。洗脫收集蛋白復(fù)合物,SDS-PAGE電泳分離蛋白條帶并進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色。從考染后的膠塊上切下差異條帶,進(jìn)行質(zhì)譜檢測。

1.3.6 質(zhì)譜鑒定與數(shù)據(jù)處理 使用Orbitrap ExplorisTM480質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析,液相所用A液為0.1%甲酸水溶液,B液為0.1%甲酸乙腈水溶液。取1 μg酶解后的蛋白膠條由自動進(jìn)樣器上樣到Zorbax 300SB-C18 peptide traps,再經(jīng)由色譜柱RP-C18進(jìn)行分離,色譜柱以95%的A液進(jìn)行平衡,流速為300 nL·min-1。分離梯度為:0～50 min,B液線性梯度4%～50%;50～54 min,B液線性梯度50%～100%;54～60 min,B液維持在100%。Q Exactive質(zhì)譜儀對分離產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)譜分析。

Proteome Discover2.4對原始文件進(jìn)行數(shù)據(jù)庫檢索,數(shù)據(jù)庫為Bos taurus-ensembl-fasta,酶解方式為胰蛋白酶,固定修飾為Carbamidomethy,可變修飾為M Oxidation、Acetyl。TBtools繪制韋恩圖并獲取差異蛋白列表,Gene Ontology數(shù)據(jù)庫(http://geneontology.org/)對差異蛋白進(jìn)行GO富集分析,KEGG數(shù)據(jù)庫(http://www.genome.jp/kegg/)分析差異蛋白參與的信號通路,AnimalTFDB 3.0在線分析數(shù)據(jù)庫(http://bioinfo.life.hust.edu.cn/AnimalTFDB/)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子與核心啟動子互作分析。

1.3.7 過表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子對CART啟動子轉(zhuǎn)錄活性的影響 NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫中獲取牛RFX5(GenBank登錄號:XM_010803041)、CREB基因(GenBank登錄號:NM_174285)、RFX1(GenBank登錄號:XM_024994860)、JUND(GenBank登錄號:NM_001103253)、TEAD4(GenBank登錄號:XM_010805630)、TFAP2D(GenBank登錄號:NM_001192329)、RELA(GenBank登錄號:NM_001080242)序列,與pcDNA3.1(+)質(zhì)粒連接構(gòu)建過表達(dá)載體,交由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成;根據(jù)上述序列設(shè)計轉(zhuǎn)錄因子與β-actin定量引物,交由公司合成,引物信息見表1。

轉(zhuǎn)錄因子過表達(dá)載體分別與牛CART核心啟動子雙熒光素酶報告基因載體共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染24 h后,Trizol提取細(xì)胞總RNA,經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后進(jìn)行RT-qPCR檢測轉(zhuǎn)錄因子過表達(dá)情況,反應(yīng)體系為:cDNA模板1 μL,TB Green Premix ExTaqⅡ 5 μL,上、下游引物各0.4 μL,ddH2O 3.2 μL。反應(yīng)程序為:95 ℃預(yù)變性10 s;定量PCR反應(yīng)95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 20 s,40個循環(huán);熔解曲線:95 ℃ 15 s,60 ℃ 60 s,95 ℃ 15 s。以β-actin為內(nèi)參基因,2-△△CT值計算基因相對表達(dá)量。轉(zhuǎn)染48 h后,雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測細(xì)胞RLA。

1.3.8 統(tǒng)計分析 每個試驗設(shè)置3個重復(fù),通過GraphPad Prism 9.0軟件統(tǒng)計分析試驗數(shù)據(jù),結(jié)果采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示,采用單因素方差分析比較CART截短啟動子活性,采用t檢驗分析轉(zhuǎn)錄因子與CART核心啟動子結(jié)合性各組間的差異,P>0.05表示無顯著差異,P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 牛CART基因啟動子區(qū)序列擴(kuò)增

以下丘腦基因組DNA為模板,PCR擴(kuò)增牛CART基因候選啟動子區(qū)域,擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測得到單一清晰、與目的產(chǎn)物一致的特異性擴(kuò)增條帶(圖2),測序證實擴(kuò)增產(chǎn)物與NCBI GenBank中牛CART基因序列一致,表明已成功獲得牛CART基因1 222 bp的啟動子序列。

M. DNA 相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DL2000;1～3.牛CART基因啟動子擴(kuò)增產(chǎn)物M. DL2000 marker; 1-3. PCR products of promoter for bovine CART gene圖2 牛CART基因啟動子PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.2 PCR amplified product of promoter of bovine CART gene

2.2 牛CART基因啟動子區(qū)序列特征分析

序列分析結(jié)果顯示,牛CART基因啟動子區(qū)內(nèi)A堿基為256個(20.95%),T堿基為325個(26.60%),G堿基為298個(24.39%),C堿基為343個(28.07%)。牛CART基因TSS可能位于翻譯起始位點ATG上游22 bp處的A堿基(記為+1),利用EMBOSS和MethPrimer數(shù)據(jù)庫在線分析CpG島位點,篩選標(biāo)準(zhǔn)為:GC%>50%、Island size>100以及Obs/Exp>0.60,結(jié)果顯示牛CART基因啟動子區(qū)含有1個CpG島,位于-239 bp～-35 bp(205 bp)(圖3A)。順式作用元件位點預(yù)測結(jié)果顯示,存在2個TATA box,分別位于-28～-21 bp和-846～-840 bp;8個CAAT box,分別位于-147～-142 bp、-809～-806 bp、-868～-865 bp、-896～-892 bp、-1 046～-1 043 bp、-1 087～-1 082 bp、-1 121～-1 118 bp和-1 166～-1 162 bp(圖3B)。

A. CpG島位點分析;B. 順式作用元件位點預(yù)測A. Analysis of CpG island sites; B. Prediction of cis-acting element sites圖3 牛CART基因啟動子序列特征分析Fig.3 The sequence characteristic analysis of bovine CART gene promoter

2.3 牛CART基因核心啟動子區(qū)鑒定

雙熒光素酶活性檢測結(jié)果顯示,截短重組載體相對熒光活性均顯著高于pGL-Basic對照載體,其中pGL-314的相對熒光活性顯著高于pGL-497(圖4),表明-292 bp～+22 bp內(nèi)可能存在正向轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件,該區(qū)域為牛CART基因轉(zhuǎn)錄所需的最短核苷酸序列,即牛CART基因的近端核心啟動子區(qū)。

*. P<0.05; **. P<0.01; ns. P>0.05。下同*. P<0.05; **. P<0.01; ns. P>0.05. The same as below圖4 牛CART基因啟動子截短片段相對熒光活性檢測Fig.4 Detection of the relative fluorescence activity of bovine CART gene promoter truncated fragments

2.4 DNA pull down篩選核心啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子

DNA pull down產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE分離及考馬斯亮藍(lán)染色,結(jié)果顯示對照組(NC)與試驗組(DPD)在40～55 ku間存在2條差異條帶(圖5)。質(zhì)譜分析去除各組中特異性肽段數(shù)≤2的蛋白質(zhì)后,DPD組獲得互作蛋白921個,去除與NC組有交集的143個蛋白質(zhì)后,共獲得778個與NC組差異表達(dá)的蛋白質(zhì)(圖6)。

圖5 差異性互作蛋白篩選Fig.5 Screening of differentially interacting proteins

圖6 差異蛋白韋恩圖Fig.6 Venn diagram of differential proteins

2.5 互作蛋白功能分析

GO功能富集分析顯示,778個蛋白質(zhì)中有15個具有DNA結(jié)合功能(圖7A);KEGG分析顯示,差異蛋白涉及的10條主要的信號通路包括:信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、內(nèi)分泌調(diào)節(jié)、癌癥發(fā)生、神經(jīng)調(diào)節(jié)、細(xì)胞生長與凋亡、免疫調(diào)節(jié)、糖代謝、翻譯、轉(zhuǎn)錄和能量代謝(圖7B),其中RFX5、CREB、RFX1、JUND、TEAD4、TFAP2D、RELA共7個蛋白質(zhì)具有基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能,且均與牛CART核心啟動子區(qū)存在結(jié)合位點(表2)。

A.分子功能富集分析;B.信號通路分析A. Molecular function enrichment analysis; B. Signaling pathway analysis圖7 差異蛋白功能分析Fig.7 Functional analysis of differential proteins

表2 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點預(yù)測Table 2 Prediction of transcription factor binding sites

2.6 轉(zhuǎn)錄因子對CART基因核心啟動子轉(zhuǎn)錄活性的影響

pcDNA3.1(+)-轉(zhuǎn)錄因子重組質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞,RT-qPCR檢測細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)水平。結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-RFX5、pcDNA3.1(+)-CREB、pcDNA3.1(+)-RFX1、pcDNA3.1(+)-JUND、pcDNA3.1(+)-TEAD4、pcDNA3.1(+)-TFAP2D、pcDNA3.1(+)-RELA后,細(xì)胞中相應(yīng)的候選轉(zhuǎn)錄因子mRNA水平均極顯著提高(P<0.01)(圖8),表明轉(zhuǎn)錄因子過表達(dá)載體構(gòu)建成功。應(yīng)用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測各轉(zhuǎn)錄因子對牛CART基因核心啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄活性的影響,結(jié)果顯示,過表達(dá)RFX5、RFX1、TEAD4后,293T細(xì)胞相對熒光活性顯著下降(P<0.05);過表達(dá)CREB、RELA后293T細(xì)胞相對熒光活性極顯著上升(P<0.000 1);過表達(dá)JUND、TFAP2D對293T細(xì)胞相對熒光活性無顯著變化(P>0.05)(圖9)。

A. RFX5過表達(dá)檢測;B. CREB過表達(dá)檢測;C. RFX1過表達(dá)檢測;D. JUND過表達(dá)檢測;E. TEAD4過表達(dá)檢測;F. TFAP2D過表達(dá)檢測;G. RELA過表達(dá)檢測。***. P<0.001; ****. P<0.000 1,下同A. Overexpression detection of RFX5; B. Overexpression detection of CREB; C. Overexpression detection of RFX1; D. Overexpression detection of JUND; E. Overexpression detection of TEAD4; F. Overexpression detection of TFAP2D; G. Overexpression detection of RELA. ***. P<0.001; ****. P<0.000 1, the same as below圖8 293T細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子過表達(dá)檢測Fig.8 Detection of transcription factors overexpression in 293T cells

A. RFX5組相對熒光活性檢測;B. CREB組相對熒光活性檢測;C. RFX1組相對熒光活性檢測;E. JUND相對熒光活性檢測;F. TEAD4組相對熒光活性檢測;G. TFAP2D組相對熒光活性檢測;H. RELA組相對熒光活性檢測A. Relative fluorescence activity of RFX5 group; B. Relative fluorescence activity of CREB group; C. Relative fluorescence activity of RFX1 group; E. Relative fluorescence activity of JUND group; F. Relative fluorescence activity of TEAD4 group; G. Relative fluorescence activity of TFAP2D group; H. Relative fluorescence activity of RELA group圖9 轉(zhuǎn)錄因子對牛CART基因核心啟動子轉(zhuǎn)錄活性的影響Fig.9 Effects of transcription factors on transcriptional activity of bovine CART gene core promoter

3 討 論

包裹在卵泡外周的GCs為卵母細(xì)胞發(fā)育提供營養(yǎng)物質(zhì),并通過分泌E2促進(jìn)卵泡成熟和排卵[13],GCs凋亡是引起卵泡閉鎖的主要原因[14]。研究發(fā)現(xiàn),神經(jīng)肽CART通過下丘腦-垂體-卵巢軸作用于GCs,抑制E2分泌[15],E2水平降低是卵泡閉鎖的主要特征之一[16],低濃度的E2促進(jìn)GCs凋亡[17]。前期對牛優(yōu)勢卵泡(dominant follicles, DFs)和從屬卵泡(subordinate follicles, SFs)轉(zhuǎn)錄組測序分析發(fā)現(xiàn),CART在DFs中表達(dá)量顯著高于SFs,且主要在GCs層表達(dá),認(rèn)為CART通過促進(jìn)CGs凋亡來影響E2分泌,進(jìn)而對卵泡發(fā)育發(fā)揮抑制作用[18]。本課題組對CART在牛下丘腦表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)bta-miR-377可與CART3′UTR區(qū)結(jié)合抑制CARTmRNA轉(zhuǎn)錄[19]。為進(jìn)一步完善CART表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò),本研究對牛CART基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了深入探究。

啟動子是基因轉(zhuǎn)錄起始的關(guān)鍵區(qū)域,轉(zhuǎn)錄因子與該區(qū)域內(nèi)的順式作用元件結(jié)合,發(fā)揮轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)或抑制作用。Yamada等[20]克隆獲得人CART基因啟動子序列,對TSS上游1 072 bp的序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析,發(fā)現(xiàn)-156 bp處的基因多態(tài)性位點與肥胖遺傳相關(guān)。Dominguez等[21]構(gòu)建小鼠DNA文庫,對CART基因測序鑒定后發(fā)現(xiàn)在近端啟動子區(qū)內(nèi)存在cAMP反應(yīng)元件等多種順式作用元件,且人和小鼠CART基因-320 bp～+1 bp區(qū)同源性高達(dá)83%。Ling等[22]分析豬CART5′端缺失啟動子片段轉(zhuǎn)錄起始活性,確定-217 bp～+152 bp為豬CART轉(zhuǎn)錄起始所需的最短序列,即豬CART基因核心啟動子區(qū)。本研究從牛下丘腦組織中擴(kuò)增獲得牛CART基因啟動子片段,構(gòu)建4個不同截短長度的啟動子報告基因載體,篩選并鑒定CART基因核心啟動子區(qū),明確-292 bp～+22 bp區(qū)為牛CART基因核心啟動子區(qū)。CpG島通過甲基化影響轉(zhuǎn)錄因子與啟動子的結(jié)合能力,在真核生物基因轉(zhuǎn)錄過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用[23-24]。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示,牛CART基因CpG島位于核心啟動子區(qū),認(rèn)為CART基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控可能受到CpG島甲基化的影響。

CREB是目前研究較為廣泛的一類轉(zhuǎn)錄激活因子,主要參與調(diào)控神經(jīng)元反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)[25],可通過磷酸化和去磷酸化調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄[26],前人研究表明CREB激活大鼠下丘腦CART表達(dá)[10],本研究同樣明確CREB對牛下丘腦CART轉(zhuǎn)錄發(fā)揮激活作用。RFX家族可與主要組織相容性抗原MHC Ⅱ類基因特異性結(jié)合影響機(jī)體免疫性應(yīng)答,在真核生物的各類細(xì)胞中廣泛表達(dá)并發(fā)揮基因轉(zhuǎn)錄激活作用[27-28]。RFX轉(zhuǎn)錄因子家族廣泛存在于真核生物的各個組織中,通過與細(xì)胞增殖和遷移相關(guān)基因啟動子結(jié)合發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活作用,進(jìn)而影響癌癥發(fā)生發(fā)展[29-30]。RFX1是已知的具有雙向活性的轉(zhuǎn)錄因子[31];王娜等[32]研究表明,干擾神經(jīng)元中RFX5表達(dá)導(dǎo)致Pcdhα基因水平顯著上調(diào),表明RFX5具有抑制基因轉(zhuǎn)錄的功能,本研究則發(fā)現(xiàn)RFX5可顯著降低CART核心啟動子轉(zhuǎn)錄活性,因此認(rèn)為RFX5具有與RFX1相似的雙向轉(zhuǎn)錄活性。TEAD4可與轉(zhuǎn)錄輔助激活因子YAP/TAZ結(jié)合發(fā)揮共激活作用,參與調(diào)節(jié)Hippo信號通路并影響癌癥發(fā)生[33-34],另有研究發(fā)現(xiàn),TEAD4參與介導(dǎo)PI3K/AKT 信號通路,促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞的遷移[35],還可在肝癌細(xì)胞中抑制p27基因的表達(dá)[36]。本研究篩選獲得的轉(zhuǎn)錄因子JUND、TFAP2D和RELA均已被證明具有雙向轉(zhuǎn)錄活性[37-40]。綜上所述,轉(zhuǎn)錄因子在不同細(xì)胞中對不同基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控方向有所不同,僅根據(jù)前人研究成果判斷某轉(zhuǎn)錄因子對目的基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用易導(dǎo)致結(jié)果偏差。本研究應(yīng)用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)對RFX5、CREB、RFX1、JUND、TEAD4、TFAP2D、RELA 7個轉(zhuǎn)錄因子與牛CART基因核心啟動子區(qū)的靶向結(jié)合關(guān)系進(jìn)行驗證,初步明確RFX5、RFX1、TEAD4抑制牛CART核心啟動子轉(zhuǎn)錄活性;CREB與RELA增強(qiáng)牛CART核心啟動子轉(zhuǎn)錄活性。本研究未針對牛下丘腦細(xì)胞及動物活體進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子功能驗證,后續(xù)將開展定點突變及細(xì)胞功能試驗,并設(shè)計相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子靶向藥物進(jìn)行動物活體試驗,探究轉(zhuǎn)錄因子對牛下丘腦CART分泌及卵泡發(fā)育的影響,進(jìn)一步明確各轉(zhuǎn)錄因子與CART核心啟動子區(qū)的靶向結(jié)合位點及相互作用關(guān)系。

4 結(jié) 論

本研究擴(kuò)增獲得牛CART基因啟動子序列,預(yù)測該片段上存在CpG島等多種涉及基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的順式作用元件,確定-292 bp～+22 bp為CART核心啟動子區(qū),構(gòu)建轉(zhuǎn)錄因子過表達(dá)載體并明確RFX5、RFX1、TEAD4為牛CART基因轉(zhuǎn)錄抑制因子,CREB與RELA為轉(zhuǎn)錄激活因子。上述結(jié)論為進(jìn)一步揭示牛下丘腦CART轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。