湯水粉，錢卓真，李雷斌，劉智禹，王麗娟，位紹紅，姜琳琳，余 穎，陳宇鋒，劉海新，陳 思，羅方方

(福建省水產(chǎn)研究所，福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點實驗室，福建 廈門 361013)

本研究在已有文獻(xiàn)和相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，以菊黃東方鲀?yōu)檠芯繉ο螅M實際養(yǎng)殖中全池潑灑的給藥方式，研究呋喃西林代謝物氨基脲(Semicarbazide，SEM)在菊黃東方鲀體內(nèi)的殘留與消除規(guī)律，評估使用呋喃西林后的代謝物SEM在菊黃東方鲀體內(nèi)的殘留風(fēng)險，為河鲀魚的安全健康養(yǎng)殖及質(zhì)量安全風(fēng)險評估提供科學(xué)的數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 試劑與設(shè)備

SEM標(biāo)準(zhǔn)品(CH5N3O，純度>99.0%，德國Augsburg公司)；內(nèi)標(biāo)SEM-13C-15N2標(biāo)準(zhǔn)品(13CH6ClN15N2O，純度>99.0%，德國WIETGA公司)；2-硝基苯甲醛(純度>98.0%，美國Sigma公司)；乙酸乙酯、正己烷、甲酸、甲醇(色譜純，美國Tedia公司)；乙酸銨、鹽酸、磷酸氫二鉀(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

TSQ Quantum Ultra液相色譜-串聯(lián)四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Thermo Fisher公司)；Hypersil Gold C18色譜柱(100 mm × 2.1 mm，3.0 μm，美國Thermo公司)；AB204-E電子分析天平(精密度0.1 mg)、ME203E電子分析天平(精密度0.001 g，Menler Toledo公司)；SHA-B水浴恒溫振蕩器(常州國華電器有限公司)；MS3旋渦混合器(德國IKA公司)；DT5-5低速離心機(北京時代北利離心機有限公司)；HSC-24B氮吹儀(廣州智真生物科技有限公司)；Milli-Q純水機(法國Millipore公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 養(yǎng)殖條件

實驗地點為福建省水產(chǎn)研究所水產(chǎn)養(yǎng)殖實驗基地，養(yǎng)殖水體體積為20 m3，時間：12月—翌年3月。實驗用健康的菊黃東方鲀共計200尾，平均體質(zhì)量約為250 g。實驗前，先對菊黃東方鲀進(jìn)行暫養(yǎng)，正常投喂空白飼料，兩周后挑選體色、活力均正常的健康菊黃東方鲀進(jìn)行實驗。

1.2.2 實驗設(shè)計與采樣

實驗分為1組空白對照組和2組平行給藥組，每組約有菊黃東方鲀70尾。經(jīng)檢測，實驗用魚投藥前未檢出SEM。根據(jù)養(yǎng)殖過程中的菊黃東方鲀實際情況，對于給藥組，每組稱取10.0 g呋喃西林原粉，先用養(yǎng)殖水對其進(jìn)行一定的溶解后，再進(jìn)行全池潑灑，使養(yǎng)殖池中呋喃西林溶液理論濃度為0.5 mg/m3。于給藥后第8天對養(yǎng)殖池進(jìn)行換水。給藥后第1、2、4、6、8、10、13、16、19、23、27、34、41、48、52、62和77天的上午9點進(jìn)行樣品采集，每批次樣品至少采集3尾，去皮并處理取得肌肉部分，勻漿后將樣品分成3份，于-20 ℃冰箱中冷凍保存，一周內(nèi)進(jìn)行檢測。空白對照組不給藥，采樣方法同給藥組。所有組別的養(yǎng)殖條件均一致，實驗周期為77 d。

1.2.3 樣品前處理

樣品前處理參考GB 31656.13—2021《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物多殘留的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》[31]中的方法。

1.2.4 色譜條件

流動相：A為0.02%甲酸水溶液，含5 mmol/L乙酸銨；B為0.02%甲酸甲醇溶液。流動相梯度洗脫程序如表1所示。

表1 流動相梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution program

1.2.5 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源，正離子模式；噴霧電壓：3.0 kV；毛細(xì)管溫度：350 ℃；蒸發(fā)室溫度：220 ℃；鞘氣壓力：3.0×105Pa；輔助氣壓力：6.6×104Pa；碰撞氣壓力：0.20 Pa。

質(zhì)譜參數(shù)：SEM離子對209/166，碰撞能量11 eV；離子對209/192，碰撞能量13 eV；離子對212/168，碰撞能量11 eV。

1.2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別準(zhǔn)確稱取10.0 mg SEM和SEM-13C-15N2,用甲醇溶解并定容至100 mL，配制成100 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液和100 μg/mL內(nèi)標(biāo)儲備液，于-20 ℃冰箱中避光存放；再經(jīng)稀釋，分別配制成質(zhì)量濃度為100 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)工作液和100 ng/mL內(nèi)標(biāo)工作液。于50 mL離心管中分別加入10.0、20.0、50.0、100.0、200.0、400.0 μL標(biāo)準(zhǔn)工作液，同時加入100 μL內(nèi)標(biāo)工作液，按照1.2.3方法進(jìn)行處理，配制得到的SEM質(zhì)量濃度為1.0～40.0 ng/mL、內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度為10.0 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，待上機測定。以SEM的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，SEM與SEM-13C-15N2的峰面積比為縱坐標(biāo)，得到線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

1.2.7 加標(biāo)回收率

在空白的菊黃東方鲀肌肉樣品中，分別加入100 ng/mL SEM標(biāo)準(zhǔn)溶液10.0、50.0 μL(相當(dāng)于SEM在肌肉中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.50、2.50 μg/kg)，避光放置至少30 min，使SEM滲入肌肉組織。每個加標(biāo)濃度作3個平行樣，按照1.2.3方法進(jìn)行處理，經(jīng)上機測定求得該方法的平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理(藥時曲線)

通過上機測定得到每批次樣品中SEM的含量，以采樣時間為橫坐標(biāo)、SEM含量平均值為縱坐標(biāo)，采用Excel 2013處理，得到菊黃東方鲀肌肉中SEM的藥時曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性回歸及回收率

在實驗設(shè)置的色譜和質(zhì)譜條件下，對系列濃度的SEM標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定，可得SEM標(biāo)準(zhǔn)品的選擇離子流圖，圖1為20.0 ng/mL SEM標(biāo)準(zhǔn)溶液的選擇離子流圖。以SEM和內(nèi)標(biāo)SEM-13C-15N2的峰面積比值(Y)對SEM質(zhì)量濃度(X，ng/mL)作線性回歸，SEM在系列濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y=0.172X-3.94×10-2，R2=0.999 7。同時以空白的菊黃東方鲀樣品為研究對象，考察加標(biāo)回收率和精密度，得到菊黃東方鲀空白樣和加標(biāo)樣品的選擇離子流圖(圖2)。結(jié)果表明，在加標(biāo)量為0.50 μg/kg時，樣品平均回收率為112%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為6.19%；在加標(biāo)量為2.50 μg/kg時，平均回收率為89.2%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.26%。本研究采用的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的精密度和準(zhǔn)確度滿足水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物殘留量檢測的要求。

2.2 SEM在菊東方鲀肌肉中的殘留量及消除規(guī)律

采用實驗選取的處理方法和儀器條件，對不同時間點采集的樣品進(jìn)行SEM殘留量的測定，得到硝基呋喃代謝物的藥時曲線如圖3所示。由圖可知，在潑灑呋喃西林溶液后，SEM在菊黃東方鲀肌肉中呈現(xiàn)出較強的蓄積能力，1 d后菊黃東方鲀肌肉中檢出SEM的含量為4.50 μg/kg；到第4天，SEM的殘留量逐漸升高至峰值35.0 μg/kg；之后，SEM的殘留量開始下降，到了第6天迅速下降至15.0 μg/kg，隨后達(dá)到平衡狀態(tài)，消除速率趨于平緩；21 d后，SEM殘留量維持在9.00～12.0 μg/kg的濃度水平；35 d后SEM殘留量開始出現(xiàn)比較明顯的降低，但消除速率緩慢；直至第77天實驗結(jié)束時，肌肉中的SEM質(zhì)量濃度還有約2.50 μg/kg，仍高于5倍檢出限(0.50 μg/kg)。

3 討論

3.1 SEM在菊東方鲀肌肉中的殘留量趨勢分析

呋喃西林潑灑到池塘后，菊黃東方鲀肌肉中SEM含量的達(dá)峰時間、峰濃度值是反映藥物在機體內(nèi)消除規(guī)律的重要參數(shù)。在實驗的前期階段，菊黃東方鲀肌肉中SEM的殘留量呈現(xiàn)隨時間的延長顯著增加并達(dá)到最高值(第4天)再波動降低的趨勢(圖3)。這是因為在潑灑藥物后，呋喃西林原藥一部分在養(yǎng)殖水體中降解為SEM[28]，一部分則通過被菊黃東方鲀的皮膚、鰓、飲食等不同方式進(jìn)行吸收或滲透，在體內(nèi)代謝為SEM，從而使魚體內(nèi)的SEM含量升高。相關(guān)研究表明，呋喃西林原藥在養(yǎng)殖水體中1 d內(nèi)即降解為SEM[28]，而進(jìn)入水生動物體內(nèi)后，在幾小時內(nèi)就迅速代謝為SEM[22-23，25]。而根據(jù)藥時曲線，菊黃東方鲀肌肉中SEM含量是逐漸升高的，在第4 天左右才達(dá)峰，而不是在第1 天。因此，推測在給藥后的0～4 d內(nèi)，魚體除了自身吸收原藥代謝產(chǎn)生的SEM外，同時也在不斷吸收環(huán)境中的SEM，從而導(dǎo)致肌肉中SEM含量的累積。而第6天的迅速降低，可能是魚體自身的代謝和排泄導(dǎo)致的。在給藥第8天換水后，肌肉中SEM含量并沒有明顯的下降，反而有少量上升的趨勢，由此可見，到消除階段后期，養(yǎng)殖水體對肌肉中SEM含量的累積并沒有明顯的影響。根據(jù)索紋紋等[28]的研究結(jié)果，在水體中的SEM剛開始時消除速率較快，隨后趨于平緩并慢慢降至檢出限以下。這可能是養(yǎng)殖水體不再影響肌肉中SEM累積的原因所在。在第8～48天，SEM含量雖然整體上是下降的趨勢，但是有三次出現(xiàn)回升，這可能是SEM含量在體內(nèi)降低至一定程度后達(dá)到了相對平衡，與環(huán)境互相循環(huán)所致。

3.2 SEM在菊東方鲀肌肉中的消除規(guī)律分析

本實驗開展的時間是12月—翌年3月，水溫比較低，而藥物的吸收和代謝受環(huán)境溫度的影響，在高溫條件下，動物代謝加強加快，藥物消除速率也會高于低溫狀態(tài)[24]。因此本次的研究結(jié)果僅代表該季節(jié)條件下SEM的殘留消除規(guī)律。另外，硝基呋喃類藥物對光敏感，在光照充足的條件下，降解加快，同時養(yǎng)殖環(huán)境中的微生物也會影響SEM的消除[24-25]。因此，室外的池塘養(yǎng)殖環(huán)境以及高溫條件下菊黃東方鲀對SEM的殘留消除規(guī)律還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本實驗研究了在全池潑灑的給藥方式下，呋喃西林代謝物SEM在菊黃東方鲀肌肉中的殘留消除規(guī)律。直至實驗結(jié)束，菊黃東方鲀肌肉中的SEM仍未被消除至檢出限以下，可見SEM在菊黃東方鲀體內(nèi)的消除時間較長。因此在實際的水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中，應(yīng)嚴(yán)格禁止呋喃西林藥物的使用。本實驗的研究結(jié)果可為河鲀魚的健康養(yǎng)殖提供科學(xué)的數(shù)據(jù)支持，也有利于相關(guān)管理部門對水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中呋喃西林使用情況的嚴(yán)格監(jiān)控，進(jìn)一步加強排查和監(jiān)測，從而保證水產(chǎn)品的質(zhì)量安全。