葛明峰，徐勝威，王雯瓊，付志明，沈偉良

(寧波市海洋與漁業(yè)研究院，浙江 寧波 315000)

2019—2021年中國大黃魚(Pseudosciaenacrocea)養(yǎng)殖產(chǎn)量年均達24.5×104t，位居海水養(yǎng)殖魚類第一[1-3]，但因疾病造成的經(jīng)濟損失約6.2億元/年[4-6]。其中，細菌病是影響大黃魚養(yǎng)殖最為嚴重的一類病害，主要包括內(nèi)臟白點病、潰瘍病、腸炎病、諾卡氏菌病等[7-9]。抗菌藥物是水產(chǎn)養(yǎng)殖中用來控制各種細菌性疾病必不可少的藥物，包括抗生素和人工合成抗菌藥[10]。近年來，隨著規(guī)范用藥科普下鄉(xiāng)活動的推進，科學、精準用藥的水平有所提升，但仍存在較多養(yǎng)殖戶濫用藥的現(xiàn)象。這不僅會導致藥物殘留超標、影響水產(chǎn)品質(zhì)量安全，而且會導致致病菌耐藥性增強，對生態(tài)和公共衛(wèi)生安全造成嚴重影響[11-12]。

為更好地落實農(nóng)業(yè)部《水產(chǎn)養(yǎng)殖動物主要病原菌耐藥性監(jiān)測》，持續(xù)推動水產(chǎn)養(yǎng)殖用藥減量，助力水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)綠色健康發(fā)展，本研究連續(xù)3年(2020—2022年)對寧波市主導養(yǎng)殖品種大黃魚的主要病原菌進行了8種抗菌藥物的耐藥性分析。通過藥物敏感性試驗，了解和掌握病原菌耐藥性變化規(guī)律，為指導水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)者科學、規(guī)范地用藥提供有力支撐，提升病害防控能力和保障水產(chǎn)品質(zhì)量安全。同時，開展細菌耐藥性監(jiān)測，也為動物和公共衛(wèi)生的推薦性政策奠定基礎(chǔ)，為新藥的研究和評估提供有價值的信息。

1 材料和方法

1.1 病原菌的分離鑒定

2020—2022年間每月在寧波市幾個主要大黃魚養(yǎng)殖基地開展一次流行病學調(diào)查工作，每次現(xiàn)場采集已發(fā)病且出現(xiàn)明顯癥狀或瀕臨死亡的大黃魚5尾，3年共計采集大黃魚250尾。在無菌條件下，取肝、脾、腎等組織或器官劃線接種于BHI固體平板上，28 ℃培養(yǎng)24～48 h(鰤魚諾卡氏菌培養(yǎng)5～7 d)，挑取優(yōu)勢單菌落劃線提純培養(yǎng)。提取純化培養(yǎng)后的細菌DNA，根據(jù)16S rRNA序列設(shè)計引物，PCR產(chǎn)物測序由北京六合華大基金科技有限公司完成，測序結(jié)果經(jīng)GenBank Blast比對后進行細菌鑒定。同時，挑選純化好的單菌落用于后續(xù)的藥敏試驗。

1.2 測試藥物

使用全國水產(chǎn)技術(shù)推廣總站統(tǒng)一定制的藥敏檢測分析試劑盒、藥敏檢測分析試劑板。選用恩諾沙星、硫酸新霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、鹽酸多西環(huán)素、氟甲喹、磺胺間甲氧嘧啶鈉、磺胺甲噁唑+甲氧芐啶8種國務(wù)院獸醫(yī)主管部門批準的水產(chǎn)養(yǎng)殖用抗菌藥物。

1.3 藥敏試驗

將培養(yǎng)純化后的菌落加入到5 mL生理鹽水中，制成0.5麥氏單位濃度的菌懸液，再用生理鹽水將菌液濃度稀釋為5×105cfu/mL，分別加到含8種不同濃度梯度藥物(以甲砜霉素為例，藥物濃度依次為0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00、16.00、32.00、64.00、128.00、256.00、512.00 mg/L)的96孔藥敏板中，每孔加入0.2 mL。以不含抗菌藥物、等量的生理鹽水為陰性對照。將藥敏分析試劑板置于28 ℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24～48 h后觀察菌落生長情況，記錄藥物對菌株的最低抑菌濃度(MIC)[13]。通過計算MIC50(抑制50%受試菌生長所需的MIC)，比較分析病原菌對抗菌藥物的感受性。

1.4 耐藥性分析

因中國漁業(yè)漁政管理局發(fā)布的SC/T 7028—2022《水產(chǎn)養(yǎng)殖動物細菌耐藥性調(diào)查規(guī)范 通則》只列出細菌對氟苯尼考、鹽酸多西環(huán)素、磺胺甲噁唑+甲氧芐啶、磺胺間甲氧嘧啶鈉、恩諾沙星5種抗菌藥物的耐藥性判定參考值(S=敏感，I=中敏，R=耐藥)[14]，以及美國臨床和實驗室標準協(xié)會(CLSI)發(fā)布的藥物敏感性及耐藥性標準中也只有針對這5種藥的數(shù)據(jù)，因此本文作耐藥性分析時，不將硫酸新霉素、甲砜霉素、氟甲喹3種抗菌藥物納入統(tǒng)計。判別標準及菌株耐藥率計算如下：

1)氟苯尼考：S，MIC≤2 mg/L；I，MIC=4 mg/L；R，MIC≥8 mg/L。

2)鹽酸多西環(huán)素：S，MIC≤4 mg/L；I，MIC=8 mg/L；R，MIC≥16 mg/L。

3)磺胺甲噁唑+甲氧芐啶：S，MIC≤(38/2)mg/L；R，MIC≥(76/4)mg/L。

4)磺胺間甲氧嘧啶鈉：S，MIC≤256 mg/L；R，MIC≥512 mg/L。

5)恩諾沙星：S，MIC≤0.5 mg/L；I，MIC=1～2 mg/L；R，MIC≥4 mg/L。

6)菌株耐藥率(R，% )=(n/N)×100%。式中：n為耐藥菌株數(shù)量，個；N為菌株總數(shù)，個。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌種類和數(shù)量

2020—2022年采集的患病大黃魚主要表現(xiàn)為體表潰瘍、內(nèi)臟有白色結(jié)節(jié)、皮下脂肪和肌肉形成膿瘡等病癥。從患病大黃魚上分離到7種病原菌，共計58株(表1、圖1)，其中2021年、2022年分離到的菌株數(shù)較多，分別為25株和21株，共計占總菌株數(shù)的79.3%；殺香魚假單胞菌(Pseudomonasplecoglossicida)、哈維氏弧菌(Vibrioharveyi)、鰤魚諾卡氏菌(Nocardiaseriolea)是這3年大黃魚最主要的病原菌，分別占總菌株數(shù)的27.6%、27.6%、19.0%；溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)、海豚鏈球菌(Streptococcusiniae)和美人魚發(fā)光桿菌(Photobacteriumdamselae)各分離到4株，另外有3株副溶血弧菌(Vibrioparahemolyticus)；在病原菌中，哈維氏弧菌和鰤魚諾卡氏菌每年都有被分離到。

表1 2020—2022年分離到的病原菌種類和數(shù)量(株)Tab.1 Kind and quantity (strain)of pathogenic bacteria isolated from 2020 to 2022

2.2 病原菌耐藥性分析

2.2.1 病原菌對藥物感受性

8種抗菌藥物對2020—2022年從大黃魚上分離到的7種病原菌的MIC50如表2所示。由表2可知，各種病原菌對抗菌藥物的感受性表現(xiàn)不一。相較其他病原菌，殺香魚假單胞菌對藥物的耐受性更高，尤其是對甲砜霉素、氟苯尼考、磺胺間甲氧嘧啶鈉、磺胺甲噁唑+甲氧芐啶這4種藥物，MIC50分別為128.00、256.00、512.00、512.00/102.00 mg/L，遠高于另外4種藥物。除哈維氏弧菌對磺胺間甲氧嘧啶鈉較敏感外，3種弧菌(哈維氏弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌)對抗菌藥物的感受性差異不大。美人魚發(fā)光桿菌對恩諾沙星的耐藥性較強，MIC50為1.56 mg/L，而該藥對其他病原菌的MIC50≤0.50 mg/L。革蘭氏染色陽性的鰤魚諾卡氏菌和海豚鏈球菌感受敏感的藥物均為鹽酸多西環(huán)素和恩諾沙星(MIC50≤0.25 mg/L)。另外，海豚鏈球菌對磺胺類2種藥物較為敏感，而對氟甲喹有較大的耐藥性，該結(jié)果與其他致病菌對這3種漁藥感受性有較明顯的區(qū)別。

表2 8種抗菌藥物對7種病原菌的MIC50Tab.2 MIC50 of 8 antibiotics on 7 kinds of pathogenic bacteria mg/L

2.2.2 病原菌耐藥率

根據(jù)58株病原菌對8種抗菌藥物的感受性分布(表3)，以SC/T 7028—2022《水產(chǎn)養(yǎng)殖動物細菌耐藥性調(diào)查規(guī)范 通則》的標準為依據(jù)，對病原菌耐藥率進行分析統(tǒng)計，結(jié)果如圖2所示。58株菌株對鹽酸多西環(huán)素的感受性均分布在MIC≤4.00 mg/L，耐藥率為0%，100%菌株對該藥敏感；分離的菌株對恩諾沙星的耐藥率也較低，僅為7.41%；分離的菌株對氟苯尼考則表現(xiàn)出較高的生物耐藥率，為35.18%，有19株菌對該藥的感受性分布在MIC≥8.00 mg/L；46株菌株對磺胺間甲氧嘧啶鈉、35株菌株對磺胺甲噁唑+甲氧芐啶的感受性均分布在MIC≥32.00 mg/L，菌株對該2種藥物的耐藥率分別為50.00%、32.76%。

表3 58株病原菌對8種抗菌藥物的感受性分布Tab.3 Susceptibility distribution of 58 pathogenic bacteria to 8 antibiotics

2.2.3 病原菌耐藥性年度變化

在7種病原菌中，僅哈維氏弧菌和鰤魚諾卡氏菌每年都有被分離到。為比較這2種病原菌對抗菌藥物的感受性的變化趨勢，按年份對MIC50進行了統(tǒng)計，結(jié)果見表4。由表4可知，2種病原菌每年對抗菌藥物的感受性均有所差異?？傮w而言，2021年分離得到的哈維氏弧菌對甲砜霉素、磺胺間甲氧嘧啶鈉表現(xiàn)出較高的耐藥性，而對硫酸新霉素較2020年、2022年則更敏感。2022年分離得到的哈維氏弧菌除對磺胺甲噁唑+甲氧芐啶較敏感外，對其他藥物的MIC50與2020—2021年的相比變化不大。相比哈維氏弧菌，鰤魚諾卡氏菌隨年度遞增，對藥物表現(xiàn)出更明顯的耐受性，其中鰤魚諾卡氏菌對恩諾沙星、硫酸新霉素、氟苯尼考的MIC50逐年提高，該病原菌對甲砜霉素及2 種磺胺類藥物的耐藥性也只增不減。可見，病原菌耐藥性問題依然存在，應引起足夠重視。

表4 2020—2022年8種抗菌藥物對哈維氏弧菌和鰤魚諾卡氏菌的MIC50Tab.4 MIC50 of 8 antibiotics on V.harveyi and N.seriolea from 2020 to 2022 mg/L

3 討論

本研究結(jié)果表明，大黃魚體內(nèi)分離得到的最主要病原菌為殺香魚假單胞菌、哈維氏弧菌和鰤魚諾卡氏菌。殺香魚假單胞菌為引起大黃魚近年來高發(fā)疾病之一的內(nèi)臟白點病主要的病原菌[15-16]，哈維氏弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌會引起大黃魚體表潰瘍、肛門紅腫、鰭條出血、內(nèi)臟及腸道病變[17-19]。鰤魚諾卡氏菌最早由王國良等[20]從浙江網(wǎng)箱養(yǎng)殖大黃魚上分離得到，患病魚體表皮下脂肪和肌肉形成膿瘡，呈現(xiàn)大小不一的鼓起軟包，脾、腎腫大并有白色結(jié)節(jié)。美人魚發(fā)光桿菌為條件致病菌，一旦養(yǎng)殖水體環(huán)境惡化或魚體免疫力下降，便可感染大黃魚而使其發(fā)病[21]。另外，2022年分離得到的海豚鏈球菌是近幾年開展大黃魚流行病學調(diào)查以來的首次發(fā)現(xiàn)，患病魚體上下頜充血、鰓蓋軟條骨間膜充血發(fā)紅，甚至能引起大黃魚大量死亡。因此，除對常規(guī)病原菌繼續(xù)開展調(diào)查外，還需更加關(guān)注新的致病菌對大黃魚的致病性等相關(guān)研究。

從病原菌對抗菌藥物感受性結(jié)果來看，大黃魚上分離得到的大部分病原菌對鹽酸多西環(huán)素、硫酸新霉素、恩諾沙星敏感，而對磺胺類及酰胺醇類的藥物耐受濃度較高。這與游宇[11]研究福建大黃魚病原菌耐藥性的結(jié)果類似。推測兩地大黃魚普遍對磺胺類耐藥的產(chǎn)生與此類藥物的頻繁使用有關(guān)?；前芳讎f唑+甲氧芐啶對病原菌的MIC50又普遍小于磺胺間甲氧嘧啶，這可能與甲氧芐啶作為增效劑提高了聯(lián)合用藥的效果[10]有關(guān)。而磺胺類藥物對海豚鏈球菌的MIC50明顯低于其他病原菌，推測與該菌第一次被分離得到且用磺胺藥物治療時未對其產(chǎn)生耐藥性有關(guān)。

由病原菌耐藥性年度變化可知，2021年分離得到的鰤魚諾卡氏菌對抗菌藥物的耐受性較2020年更明顯，而2022年分離得到的該菌的耐受性又普遍比2021年更高?？梢?，鹽酸多西環(huán)素、硫酸新霉素、恩諾沙星可作為防治絕大多數(shù)大黃魚病原菌的優(yōu)選藥物，但也要做到藥物的經(jīng)常輪換，嚴格按照藥敏試驗結(jié)果及結(jié)合藥代動力學、藥效學確定劑量和藥程，才能盡可能地避免耐藥菌株的產(chǎn)生[22-23]。由于本研究采集的病原菌樣本量有限，因此后續(xù)還將繼續(xù)加大對大黃魚病原菌的鑒定及耐藥性普查工作的力度。

通過大黃魚病原菌耐藥性的連續(xù)監(jiān)測，可掌握重要病原菌對抗菌藥物的感受性及其變化規(guī)律，豐富病原菌耐藥性數(shù)據(jù)和耐藥譜庫。這將有利于在病害發(fā)生時為養(yǎng)殖戶提供疾病早期診斷和科學精準用藥方案，從而降低病原微生物的耐藥性，對持續(xù)推動水產(chǎn)養(yǎng)殖用藥減量、提高水產(chǎn)品質(zhì)量安全水平、助力水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)綠色健康發(fā)展具有十分重要的意義。