董軍璐 金鑫 劉華 簡(jiǎn)守珺 岳娟 張紅敏 王麗婭

河南省人民醫(yī)院眼科 河南省立眼科醫(yī)院 河南省眼科研究所 河南大學(xué)人民醫(yī)院 鄭州大學(xué)人民醫(yī)院,鄭州 450003

真菌性角膜炎(fungal keratitis,FK)是一種由致病真菌引起的感染性角膜炎,該病致盲率高,為我國(guó)常見(jiàn)的難治性致盲眼病[1]。FK的治療目前大多依賴于局部抗真菌藥物。然而,由于抗真菌藥物相對(duì)分子質(zhì)量大且滲透性差,嚴(yán)重的FK藥物控制效果欠佳,預(yù)后不良,大多數(shù)患者遺留下中度或重度視力障礙,約25%的患眼仍需進(jìn)行復(fù)雜的手術(shù),且手術(shù)成功率較低[2-3]。中性粒細(xì)胞在抗真菌感染方面發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn),在真菌感染早期,角膜內(nèi)募集的中性粒細(xì)胞達(dá)90%以上,是FK早期主要的免疫細(xì)胞[4-5]。角膜真菌感染后中性粒細(xì)胞迅速?gòu)慕悄ぞ壯苡纬霾⒃诟腥静课唤?rùn),以殺滅真菌并使病灶局限[6]。然而,中性粒細(xì)胞在殺菌的同時(shí),還通過(guò)釋放蛋白水解酶、活性氧和氮對(duì)組織造成損傷[7]?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)是中性粒細(xì)胞釋放的蛋白酶中的一類。MMP-8是MMP家族膠原酶的一種,可降解Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型膠原[8],不僅可以輔助中性粒細(xì)胞遷移,還參與組織的損傷過(guò)程[9-10]。目前對(duì)MMP-8調(diào)節(jié)先天免疫作用的研究主要集中在腫瘤、癌癥以及肺部、血管等炎癥相關(guān)性疾病[7],FK角膜組織破壞方面的研究不多,對(duì)其作用機(jī)制知之甚少。AMP依賴的蛋白激酶(adenosine 5-monophosphate-activated protein kinase,AMPK)是一種高度保守的蛋白激酶,主要以異源三聚體復(fù)合物的形式存在于真核細(xì)胞中。以往AMPK信號(hào)通路作為調(diào)節(jié)能量代謝的途徑而備受關(guān)注,O'Neill等[11]研究發(fā)現(xiàn),AMPK信號(hào)通路在感染和免疫炎癥性疾病中也發(fā)揮重要作用,但其在FK中的作用尚不清楚。FK的致病菌主要有絲狀真菌和酵母樣真菌2種類型,其中絲狀真菌中的鐮刀菌是我國(guó)FK的主要致病菌[12-13],在FK的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中具有一定的代表性。本研究擬探討中性粒細(xì)胞來(lái)源MMP-8對(duì)FK角膜組織破壞的作用機(jī)制,為避免患眼角膜組織的損害提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及外周血、菌種來(lái)源 SPF級(jí)6～8周齡雄性C57BL/6J小鼠108只,購(gòu)自南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所,經(jīng)眼科檢查均無(wú)眼疾。實(shí)驗(yàn)小鼠按每籠6只飼養(yǎng),飼養(yǎng)室內(nèi)溫度保持在22～26 ℃,濕度40%～60%,每日光照與黑暗時(shí)間各12 h。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)及使用均遵照ARVO聲明,遵循國(guó)家科學(xué)技術(shù)委員會(huì)頒布的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量管理辦法》要求,研究方案經(jīng)河南省眼科研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批文號(hào):HNEECA-2017-04-02)。選取健康成人志愿者1名,采集外周靜脈血5 ml,研究方案經(jīng)河南省立眼科醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究倫理委員會(huì)審批[批文號(hào):HNEECKY-2019(16)號(hào)]。腐皮鐮刀菌(編號(hào):3.5840)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院微生物研究所中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心。

1.1.2主要試劑及儀器 兔抗小鼠Phospho-AMPKα(Thr172)抗體、兔抗小鼠AMPKα(D5A2)抗體(美國(guó)CST公司);兔抗小鼠MMP8抗體(英國(guó)Abcam公司);兔抗小鼠GAPDH抗體(杭州賢至生物科技有限公司);羊抗兔IgG-HRP標(biāo)記二抗、重組 MMP-8蛋白(美國(guó)R&D公司);Alexa fluor 488標(biāo)記PEG生物素二抗(美國(guó)Jackson公司);DAPI(美國(guó)Invitrogen公司);Acadesine、二鹽酸鹽化合物 C(美國(guó)MCE公司);BCA法蛋白濃度測(cè)定試劑盒、組織裂解液(北京索萊寶科技有限公司);ECL發(fā)光液(美國(guó)Millipore公司);小鼠眼球固定液(北京康為試劑公司);脫脂奶粉(美國(guó)BD公司);羥脯氨酸測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所)。裂隙燈顯微鏡(SLM-8E,重慶康華瑞明科技股份有限公司);體視解剖顯微鏡(OMS-90,日本Topcon公司);正置熒光顯微鏡(美國(guó)Olympus公司);電泳儀、化學(xué)發(fā)光儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1FK小鼠模型制作 所有小鼠腹腔內(nèi)注射80 mg/kg戊巴比妥鈉進(jìn)行全身麻醉,并采用1%鹽酸丁卡因滴眼液點(diǎn)右眼進(jìn)行角膜表面麻醉,麻醉后將小鼠置于解剖顯微鏡下進(jìn)行FK模型制作,具體制作方法參照文獻(xiàn)[4]。

1.2.2腐皮鐮刀菌復(fù)蘇和傳代 腐皮鐮刀菌復(fù)蘇和傳代方法參照文獻(xiàn)[14]中描述的方法。4 ℃保存的鐮刀菌轉(zhuǎn)種至葡萄糖馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基,置于26～28 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)生長(zhǎng)7 d,轉(zhuǎn)種至葡萄糖馬鈴薯液體培養(yǎng)基于26～28 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)生長(zhǎng),取培養(yǎng)5～7 d的菌絲用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.3實(shí)驗(yàn)分組及模型眼炎癥評(píng)分 造模后12 h于裂隙燈顯微鏡下對(duì)小鼠模型眼進(jìn)行FK炎癥評(píng)分,并根據(jù)炎癥評(píng)分將小鼠分為12 h、24 h、48 h、72 h模型組,每組27只小鼠27眼,再分別于24、48和72 h在裂隙燈顯微鏡下對(duì)小鼠模型眼進(jìn)行炎癥評(píng)分,采用過(guò)量麻醉方法處死各組小鼠。參照文獻(xiàn)[15]中描述的方法對(duì)FK模型眼進(jìn)行炎癥評(píng)分,總評(píng)分為各項(xiàng)評(píng)分之和。(1)病灶面積 占角膜總面積1%～25%為1分;占角膜總面積26%～50%為2分;占角膜總面積51%～75%為3分;占角膜總面積76%～100%為4分。(2)角膜混濁度 角膜輕度霧狀混濁,瞳孔及虹膜清晰可見(jiàn)為1分;角膜淺層混濁,透過(guò)病灶可見(jiàn)瞳孔及虹膜為2分;角膜全層呈不均勻混濁為3分;均勻致密混濁為4分。(3)角膜水腫為1分。(4)前房積膿 少量積膿,未及旁中央為1分;大量積膿,達(dá)角膜旁中央為2分。(5)角膜病灶表面粗糙和隆突為2分。(6)后彈力層膨出為3分。(7)角膜穿孔為4分。(8)角膜新生血管 新生血管面積占角膜總面積1%～50%為1分;新生血管占角膜總面積51%～100%為2分。(9)眼球腫脹明顯,比正常眼球體積膨大為5分。(10)角膜溶解,眼球萎縮為6分。

1.2.4Western blot法檢測(cè)FK小鼠角膜組織內(nèi)目標(biāo)蛋白相對(duì)表達(dá)量 每組分別取23只小鼠,冰上取角膜組織,浸泡于100 μl組織裂解液(內(nèi)含蛋白酶抑制劑),剪碎角膜,充分研磨。離心半徑8 cm,4 ℃條件下12 000 r/min離心10 min,取上清,蛋白變性后備用。聚丙烯酰胺凝膠90 V恒壓電泳,濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜,將目標(biāo)相對(duì)分子質(zhì)量范圍的硝酸纖維素膜進(jìn)行免疫反應(yīng)。將硝酸纖維素膜放入5%脫脂奶粉封閉液中,于搖床上室溫下封閉1 h;去除封閉液,分別浸入MMP-8(1∶1 000)、AMPKα(1∶1 000)、Phospho-AMPKα一抗(1∶1 000),4 ℃孵育過(guò)夜;復(fù)溫后用0.01 mol/L TBST洗3次,每次5 min;于HRP IgG二抗(1∶1 000)室溫孵育1 h;用ECL顯色液顯色,置于化學(xué)發(fā)光儀中進(jìn)行曝光,以GAPDH為內(nèi)參。采用Quantity One軟件進(jìn)行灰度統(tǒng)計(jì)分析,目標(biāo)蛋白相對(duì)表達(dá)量為目標(biāo)蛋白灰度值與內(nèi)參蛋白灰度值的比值。

1.2.5羥脯氨酸測(cè)定法檢測(cè)角膜組織中羥脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù) 每組取2只未處理小鼠的角膜4只,按照1.2.4部分方法取角膜并修剪為直徑2 mm大小。將角膜分為MMP-8組、緩沖液組和生理鹽水組,取96孔板,每孔各加入1只角膜,按照分組分別添加100 μl活化的重組MMP-8、緩沖液和生理鹽水,每組4個(gè)孔。將96孔板置在培養(yǎng)箱中于37 ℃、5% CO2條件下孵育24 h,采用羥脯氨酸測(cè)定試劑盒測(cè)定角膜中羥脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.2.6蘇木精-伊紅染色法檢測(cè)小鼠角膜組織中中性粒細(xì)胞數(shù)量 各時(shí)間點(diǎn)組分別取4只小鼠的4只眼球,室溫下置于固定液內(nèi)12 h以上,梯度乙醇脫水,石蠟包埋,5 μm厚切片并制成白片。各組分別取4張白片行蘇木精-伊紅染色,正置熒光顯微鏡下觀察角膜樣本中性粒細(xì)胞并拍照。采用ImageJ 軟件計(jì)數(shù)各切片中性粒細(xì)胞數(shù)。

1.2.7免疫熒光染色法觀察角膜組織中中性粒細(xì)胞與MMP-8蛋白的共定位表達(dá) 取小鼠48 h FK模型組白片切片1張(見(jiàn)1.2.6部分),脫蠟,浸泡于Tris-EDTA修復(fù)液內(nèi)加熱煮沸進(jìn)行抗原修復(fù)。取出白片,滴加MMP-8一抗(1∶200)4 ℃孵育過(guò)夜,次日復(fù)溫,浸入0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution,PBS)洗滌3次,每次5 min;再滴加Alexa fluor 488二抗(1∶1 000)室溫孵育1 h,浸入0.01 mol/L PBS洗滌3次,每次5 min;滴加5 μg/ml DAPI室溫孵育30 min,封片,正置熒光顯微鏡下觀察并定位角膜組織中中性粒細(xì)胞和MMP-8蛋白的表達(dá)。MMP-8顯示綠色熒光,中性粒細(xì)胞顯示藍(lán)色熒光。

1.2.8人中性粒細(xì)胞和腐皮鐮刀菌孢子提取 將抽取的外周靜脈血置于抗凝管內(nèi),1 300 r/min離心10 min,收集血細(xì)胞。加入紅細(xì)胞裂解液,血液與紅細(xì)胞裂解液體積比為1∶3;在Percoll密度梯度液(依次向15 ml離心管內(nèi)緩慢加入4 ml 81% Percoll、3 ml 70% Percoll和4 ml 55% Percoll)上層加入白細(xì)胞懸液,1 700 r/min離心20 min,收集4 ml液面層的細(xì)胞,即中性粒細(xì)胞。以1倍PBS重懸,1 700 r/min離心5 min,收集沉淀物,加入RPMI-1640培養(yǎng)基重懸后計(jì)數(shù)。刮取真菌培養(yǎng)基上的腐皮鐮刀菌菌落并溶于無(wú)菌生理鹽水,過(guò)濾,1 700 r/min離心5 min,得到真菌孢子,光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)。

1.2.9體外腐皮鐮刀菌孢子感染人中性粒細(xì)胞 將1.2.8中處理和獲取的中性粒細(xì)胞分為4個(gè)組,陰性對(duì)照組為常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)的中性粒細(xì)胞,共培養(yǎng)組為中性粒細(xì)胞與孢子共培養(yǎng),AICAR處理組和化合物C處理組分別向中性粒細(xì)胞和孢子共培養(yǎng)體系內(nèi)加入p-AMPK蛋白酶激動(dòng)劑AICAR或抑制劑化合物C。采用24孔板,按照分組分別依次添加培養(yǎng)基500 μl/孔、AICAR 500 μmol/L/孔或化合物C 10 μmol/L/孔、中性粒細(xì)胞5.0×105/孔和孢子5.0×105/孔,其中孢子在中性粒細(xì)胞培養(yǎng)30 min后加入,均于37 ℃、5% CO2條件下孵育4 h。

圖1 各組小鼠模型眼裂隙燈顯微鏡下病灶表現(xiàn) 隨著造模后時(shí)間的延長(zhǎng),角膜病灶面積逐漸擴(kuò)大Figure 1 Slit lamp micrographs of cornea lesion in different groups Area of corneal lesions was progressively expended over time after modeling

1.2.10細(xì)胞免疫熒光染色法檢測(cè)中性粒細(xì)胞中MMP-8的表達(dá) 取1.2.9中處理的細(xì)胞,以4%多聚甲醛固定,0.2% Triton透化,滴入2%牛血清白蛋白室溫下封閉1 h,滴加MMP-8一抗(1∶200)4 ℃孵育過(guò)夜。次日復(fù)溫,滴加0.01 mol/L PBS洗滌3次,每次5 min;再滴加熒光488二抗(1∶1 000)室溫下孵育1 min,浸入0.01 mol/L PBS洗滌3次,每次5 min。滴加5 μg/ml DAPI室溫下反應(yīng)30 min,封片,正置熒光顯微鏡下觀察并拍照,各組統(tǒng)一曝光強(qiáng)度和時(shí)間,每組隨機(jī)拍下10個(gè)視野,采用ImageJ軟件分析各組中性粒細(xì)胞中MMP-8表達(dá)的熒光強(qiáng)度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 造模后不同時(shí)間組小鼠模型眼角膜病變情況及評(píng)分比較

造模后24 h組小鼠模型眼出現(xiàn)典型的菌絲苔被,隨造模后時(shí)間延長(zhǎng)病灶面積逐漸擴(kuò)大,角膜混濁逐漸加重,并伴有前房積膿,造模后72 h 組42%的模型眼出現(xiàn)角膜穿孔(圖1)。造模后12、24、48和72 h組模型眼角膜炎癥評(píng)分分別為2(2,3)、6(5,6)、9(8,9)和12(12,14)分,總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H=129.38,P<0.01),其中造模后24、48和72 h組炎癥評(píng)分均明顯高于12 h組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.001)。

2.2 造模后不同時(shí)間組角膜中MMP-8相對(duì)表達(dá)量比較

與造模前相比,造模后不同時(shí)間組MMP-8蛋白表達(dá)條帶均明顯增強(qiáng),其中以造模后24 h組角膜中 MMP-8蛋白表達(dá)條帶最強(qiáng)(圖2A)。造模后0、12、24、48、72 h組角膜中MMP-8蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為1.07±0.24、22.77±13.40、53.41±15.97、43.99±24.94和14.35±10.21,總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=9.89,P<0.01),其中造模后12、24和48 h 組MMP-8蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯高于0 h組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)(圖2B)。模型眼角膜組織內(nèi)MMP-8蛋白相對(duì)表達(dá)量與相應(yīng)炎癥評(píng)分呈中等強(qiáng)度正相關(guān)(rs=0.50,P<0.05)(圖3)。

圖2 造模后不同時(shí)間組小鼠角膜組織中MMP-8蛋白表達(dá) A:不同時(shí)間組小鼠角膜組織中MMP-8蛋白表達(dá)電泳圖 B:不同時(shí)間組小鼠角膜組織中MMP-8蛋白相對(duì)表達(dá)量量化比較 F=9.89,P<0.01.與造模后0 h組比較,aP<0.05(單因素方差分析,LSD-t 檢驗(yàn),n=5) MMP:基質(zhì)金屬蛋白酶;GAPDH:甘油醛-3-磷酸脫氫酶Figure 2 MMP-8 protein expression of modeling eyes at different time points following modeling A:Electrophoretogram of MMP-8 protein expression of modeling eyes at different time points B:Comparison of MMP-8 protein relative expression level in cornea among different time points F=9.89,P<0.01.Compared with 0 hour after molding,aP<0.05 (One-way ANOVA,LSD-t test,n=5) MMP:matrix metalloproteinase;GAPDH:glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase

2.3 未處理小鼠離體角膜MMP-8孵育后角膜中羥脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)比較

緩沖液組、生理鹽水組和MMP-8組角膜羥脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為(0.52±0.02)、(0.51±0.03)和(0.27±0.02)μg/mg,總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=156.63,P<0.01),其中MMP-8組角膜中羥脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)明顯低于緩沖液組和生理鹽水組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。

2.4 造模后不同時(shí)間組模型眼角膜組織中p-AMPK蛋白相對(duì)表達(dá)量比較及其與MMP-8蛋白表達(dá)量的相關(guān)性

隨造模后時(shí)間的延長(zhǎng),小鼠模型眼角膜中p-AMPKα(Thr 172)蛋白相對(duì)表達(dá)量升高,造模后0、12、24、48、72 h組模型眼角膜中p-AMPKα(Thr172)/AMPKα值分別為0.61±0.40、0.82±0.36、1.04±0.64、1.13±0.60和1.09±0.58,總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=3.11,P<0.05),其中,造模后12 h組模型眼角膜中p-AMPKα(Thr 172)/AMPKα值與造模后0 h組相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);造模后24、48和72 h組角膜中p-AMPKα(Thr 172)/AMPKα值明顯高于0 h組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)(圖4)。角膜中p-AMPKα(Thr 172)/AMPKα值與MMP-8蛋白相對(duì)表達(dá)量呈中等強(qiáng)度正相關(guān)(r=0.54,P<0.01)(圖5)。

圖4 造模后不同時(shí)間組小鼠角膜中p-AMPK蛋白表達(dá)比較 A:不同時(shí)間組小鼠角膜組織中p-AMPK蛋白表達(dá)電泳圖 B:不同時(shí)間組小鼠角膜組織中p-AMPKα (Thr172)/AMPKα表達(dá)值比較 F=3.11,P<0.05.與造模后0 h組比較,aP<0.05(單因素方差分析,LSD-t檢驗(yàn),n=18) AMPK:AMP依賴的蛋白激酶;GAPDH:甘油醛-3-磷酸脫氫酶Figure 4 Comparison of p-AMPK expression in cornea among different time points following modeling A:Electrophoretogram of p-AMPK protein expression in cornea among different time points B:Comparison of relative expression levels of p-AMPKα (Thr172)/AMPKα protein in cornea among different time points F=3.11,P<0.05.Compared with 0 hour after molding,aP<0.05 (One-way ANOVA,LSD-t test,n=18) AMPK:adenosine 5-monophosphate-activated protein kinase;GAPDH:glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase

圖5 p-AMPKα(Thr 172)/AMPKα表達(dá)量與MMP-8表達(dá)量相關(guān)性分析 p-AMPKα(Thr 172)/AMPKα表達(dá)量與MMP-8表達(dá)量呈中等強(qiáng)度正相關(guān)(r=0.54,P<0.01)(Pearson線性相關(guān)分析,n=25) AMPK:AMP依賴的蛋白激酶;MMP:基質(zhì)金屬蛋白酶Figure 5 Correlation of p-AMPKα (Thr 172)/AMPKα expression with MMP-8 expression p-AMPKα (Thr 172)/AMPKα expression was moderately positively correlated with MMP-8 expression in cornea (r=0.54,P<0.01) (Pearson linear correlation analysis,n=25) AMPK:adenosine 5-monophosphate-activated protein kinase;MMP:matrix metalloproteinase

2.5 造模后不同時(shí)間組角膜中中性粒細(xì)胞數(shù)量比較

造模后12 h組模型眼角膜中即出現(xiàn)中性粒細(xì)胞,隨造模時(shí)間延長(zhǎng),角膜內(nèi)中性粒細(xì)胞逐漸增多(圖6)。造模后0、12、24、48、72 h組角膜內(nèi)中性粒細(xì)胞數(shù)量分別為(8±6)、(35±19)、(1 479±286)、(1 994±188)和(1 328±93)個(gè)/切片,總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=17.13,P<0.01),其中造模后24、48和72 h組角膜中中性粒細(xì)胞數(shù)量明顯多于0 h組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.001)。模型眼角膜中中性粒細(xì)胞數(shù)量與炎癥評(píng)分呈強(qiáng)正相關(guān)(rs=0.77,P<0.001),與MMP-8蛋白相對(duì)表達(dá)量呈中等強(qiáng)度正相關(guān)(r=0.56,P<0.05)(圖7)。

圖6 造模后不同時(shí)間組裂隙燈顯微鏡下角膜表現(xiàn)及病理組織學(xué)檢查表現(xiàn) 隨造模后時(shí)間延長(zhǎng)及病情加重,角膜組織中中性粒細(xì)胞向數(shù)量增加并向角膜深層浸潤(rùn) A:不同時(shí)間組裂隙燈顯微鏡下角膜病灶表現(xiàn) B:不同時(shí)間組模型眼角膜組織學(xué)表現(xiàn)(HE ×200,標(biāo)尺=100 μm) 方框內(nèi)所示為角膜病灶區(qū) C:角膜病灶區(qū)放大圖(HE ×400,標(biāo)尺=20 μm)Figure 6 Slit lamp microphotographs and histopathological findings of corneal lesions at various time points following modeling The inflammation of the corneas was gradually aggravated over the time,and the number of neutrophils was obviously increased A:Manifestation of corneal lesion under a slit lamp microscope at each time point B:The pathohistological findings of lesions (HE ×200,bar=100 μm) The corneal lesion was marked in square frame C:Magnified view of the corneal lesion (HE ×400,bar=20 μm)

2.6 MMP-8蛋白在角膜中性粒細(xì)胞中的表達(dá)及定位

MMP-8蛋白在角膜的中性粒細(xì)胞中呈陽(yáng)性表達(dá),呈綠色熒光,包繞中性粒細(xì)胞的分葉核,角膜中中性粒細(xì)胞呈藍(lán)色熒光,可見(jiàn)綠色熒光與藍(lán)色熒光重疊,即MMP-8蛋白與中性粒細(xì)胞表達(dá)高度共定位(圖8)。

2.7 不同腐皮鐮刀菌孢子感染處理組人中性粒細(xì)胞中MMP-8蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

MMP-8蛋白在中性粒細(xì)胞中表達(dá)呈綠色熒光,AICAR處理組MMP-8蛋白表達(dá)熒光強(qiáng)度強(qiáng)于陰性對(duì)照組和化合物C處理組(圖9)。陰性對(duì)照組、中性粒細(xì)胞與孢子共培養(yǎng)組、AICAR處理組和化合物C處理組人中性粒細(xì)胞中MMP-8蛋白表達(dá)熒光強(qiáng)度值分別為5 516 671±146 755、5 666 755±331 791、6 063 087±332 378和5 518 788±419 323,組間總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=12.75,P<0.01),其中AICAR處理組人中性粒細(xì)胞中MMP-8蛋白表達(dá)熒光強(qiáng)度值明顯高于陰性對(duì)照組和化合物C處理組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。

圖7 模型眼角膜中性粒細(xì)胞數(shù)量與炎癥評(píng)分或MMP-8蛋白相對(duì)表達(dá)量相關(guān)性分析 A:中性粒細(xì)胞數(shù)與炎癥評(píng)分呈強(qiáng)正相關(guān)(rs=0.77,P<0.001)(Spearman秩相關(guān)分析,n=20) B:中性粒細(xì)胞數(shù)與MMP-8蛋白相對(duì)表達(dá)量呈中等強(qiáng)度正相關(guān)(r=0.56,P<0.05)(Pearson線性相關(guān)分析,n=20) MMP:基質(zhì)金屬蛋白酶Figure 7 Correlations of neutrophil count with inflammation score or MMP-8 protein expression A:Neutrophil count was positively correlated with inflammation score (rs=0.77, P<0.001) (Spearman rank correlation analysis,n=20) B:Neutrophil count was positively correlated with MMP-8 protein expression (r=0.56, P<0.05) (Pearson linear correlation analysis,n=20) MMP:matrix metalloproteinase

圖8 MMP-8蛋白在角膜中性粒細(xì)胞中的表達(dá)情況 A:MMP-8蛋白表達(dá)包繞中性粒細(xì)胞分葉核,呈綠色熒光(Alexa fluor 488),中性粒細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光(DAPI)(×400,標(biāo)尺=50 μm) B:熒光共定位分析擬合圖 C:熒光共定位分析計(jì)算結(jié)果條圖(Pearson_Rr=1,Overlap_R=1) MMP:基質(zhì)金屬蛋白酶;DAPI:二脒基苯基吲哚Figure 8 MMP-8 protein expression in neutrophils in the cornea A:MMP-8 encompassed neutrophil segmented nuclei,showing green fluorescence (Alexa fluor 488),and neutrophil nuclei presented blue fluorescence (DAPI) (×400,bar=50 μm) B:Fitted plot of fluorescence co-localization analysis C:Histogram of calculated results of fluorescence co-localization analysis (Pearson_Rr=1,Overlap_R=1) MMP:matrix metalloproteinase;DAPI:diaminidine phenyl indole

圖9 各處理組人中性粒細(xì)胞中MMP-8蛋白表達(dá)的免疫熒光染色 MMP-8蛋白在人中性粒細(xì)胞的表達(dá)呈綠色熒光(Alexa fluor 488),人中性粒細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光(DAPI)(×200,標(biāo)尺=100 μm) AICAR處理組MMP-8蛋白表達(dá)熒光強(qiáng)于陰性對(duì)照組和化合物C處理組 MMP:基質(zhì)金屬蛋白酶;DAPI:二脒基苯基吲哚Figure 9 Immunofluorescence staining of MMP-8 expression in human neutrophils nuclei MMP-8 expression showed green fluorescence (Alexa fluor 488) and human neutrophil nuclei presented blue fluorescence (DAPI) (×200,bar=100 μm) The fluorescence was stronger in AICAR-treated group than in negative control group and compound C-treated group MMP:matrix metalloproteinase;DAPI:diaminidine phenyl indole

3 討論

正常角膜無(wú)血管、透明,是重要的屈光介質(zhì)。角膜基質(zhì)約占整個(gè)角膜厚度的90%,由絕大部分膠原纖維構(gòu)成的細(xì)胞外基質(zhì)和少量細(xì)胞組成。角膜膠原纖維的主要成分是Ⅰ型膠原,構(gòu)成了角膜組織的主要骨架[16]。角膜的折光功能依賴于有序排列的膠原板層結(jié)構(gòu),有序膠原結(jié)構(gòu)的破壞是角膜混濁的主要原因[17]。本課題組既往通過(guò)小鼠角膜MMP-8基質(zhì)注射造模發(fā)現(xiàn),注射眼角膜較對(duì)照眼明顯混濁,證明MMP-8可直接降解角膜基質(zhì)層膠原纖維造成基質(zhì)破壞,導(dǎo)致角膜混濁[18],與本研究體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。正常角膜中無(wú)中性粒細(xì)胞,角膜真菌感染誘發(fā)中性粒細(xì)胞向角膜內(nèi)遷移募集。研究表明,去除中性粒細(xì)胞的FK小鼠角膜內(nèi)菌絲量較高,證明了中性粒細(xì)胞關(guān)鍵的殺菌作用,而去除中性粒細(xì)胞的FK小鼠角膜混濁程度、組織損傷程度較正常FK小鼠低,表明角膜組織混濁是中性粒細(xì)胞降解膠原蛋白破壞組織所致[19]。本研究也同樣發(fā)現(xiàn),FK小鼠感染早期,隨著角膜內(nèi)中性粒細(xì)胞數(shù)量的增多,其分泌的MMP-8表達(dá)水平也逐漸升高,有助于中性粒細(xì)胞由角膜緣向角膜感染部位遷移以殺死真菌,在此過(guò)程中也會(huì)降解角膜基質(zhì)層膠原纖維致使角膜混濁,使MMP-8表達(dá)水平與FK炎癥評(píng)分嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。

中性粒細(xì)胞分泌MMP-8前體,只有破壞其活性位點(diǎn)與Zn2+的相互作用才會(huì)被激活。激活的過(guò)程可以通過(guò)中性粒細(xì)胞釋放的活性氧和多種蛋白酶來(lái)介導(dǎo),如組織蛋白酶G、糜蛋白酶以及MMP-3、MMP-7、MMP-10、MMP-14等[8,20-25]。AMPK磷酸化激活MMP-8是我們首次在FK中發(fā)現(xiàn)的,其在人肺結(jié)核疾病中已有報(bào)道,中性粒細(xì)胞來(lái)源的MMP-8導(dǎo)致基質(zhì)破壞空洞化的過(guò)程依賴于AMPK,AMPK激活水平在人肺結(jié)核細(xì)胞模型中上調(diào),并驅(qū)動(dòng)中性粒細(xì)胞MMP-8分泌和基因表達(dá),這被AMPK抑制劑化合物C抑制[26],與本研究中體外鐮刀菌孢子感染人中性粒細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。由于中性粒細(xì)胞趨化網(wǎng)絡(luò)在小鼠和人中是不同的,鼠和人的中性粒細(xì)胞在循環(huán)細(xì)胞的數(shù)量和形態(tài)方面也不同[27],因此本研究中選用人中性粒細(xì)胞來(lái)研究AMPK與MMP-8之間的作用。AICAR、二甲雙胍或A-769662(AMPK激活劑)均被報(bào)道在各種炎癥和免疫動(dòng)物模型中發(fā)揮抗炎作用[28-32],在FK動(dòng)物模型中尚未見(jiàn)報(bào)道,AMPK磷酸化激活MMP-8在FK病變中的作用還需進(jìn)一步研究。

綜上所述,本研究證明了在FK病變?cè)缙?中性粒細(xì)胞分泌大量MMP-8降解角膜基質(zhì)層膠原纖維致使角膜混濁,組織被破壞,MMP-8表達(dá)水平與FK的嚴(yán)重程度相關(guān)。本研究首次發(fā)現(xiàn)在FK病程中,AMPK信號(hào)通路在調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞MMP-8分泌和天然免疫介導(dǎo)的組織破壞之間存在相互作用,AMPK磷酸化可調(diào)控人中性粒細(xì)胞MMP-8分泌。本研究為FK中性粒細(xì)胞分泌MMP-8致組織破壞提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明董軍璐:實(shí)施研究、采集數(shù)據(jù)、統(tǒng)計(jì)/分析數(shù)據(jù)、文章撰寫(xiě);金鑫、劉華、簡(jiǎn)守珺、岳娟:實(shí)施研究;張紅敏、王麗婭:醞釀和設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、實(shí)施研究、解釋數(shù)據(jù)、對(duì)文章的知識(shí)性內(nèi)容作批評(píng)性審閱