張曉林，汪 盛

（蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院泌尿外科，安徽 蚌埠 233000）

膀胱癌是常見的癌癥之一，隨著人口增長及老齡化，膀胱癌發(fā)病率將呈上升趨勢［1］。2018 年，膀胱癌躍居于全球惡性腫瘤第12 位［2］。大約70%的膀胱癌在診斷時(shí)被歸類為非肌層浸潤性膀胱癌（nonmuscle-invasive bladder cancer， NMIBC），而其余約30%被歸類為肌層浸潤性膀胱癌（muscle-invasive bladder cancer， MIBC），NMIBC 中高級(jí)別原位癌有侵 襲 膀 胱 壁 肌 肉 組 織 的 趨 勢，從 而 成 為MIBC［3，4］。在生物學(xué)和臨床水平上，NMIBCs 是一種異質(zhì)性癌癥，具有易復(fù)發(fā)特點(diǎn)［5］。雖然目前針對(duì)早期膀胱癌治療可以取得較好療效，但進(jìn)展為中晚期膀胱癌后，目前尚無有效治療措施。相比NMIBC，MIBC預(yù)后要差很多，因此，迫切需要降低膀胱癌進(jìn)展幾率及改善中晚期膀胱癌預(yù)后的措施。如今，探索膀胱癌發(fā)病機(jī)制是腫瘤進(jìn)展和治療研究的熱點(diǎn)之一［6］。如果可以研究出針對(duì)膀胱癌有效的免疫制劑或分子靶向藥物將為膀胱癌患者帶來福音。此外，發(fā)掘可用于診斷或預(yù)后標(biāo)志物，研究人員目前所關(guān)注的一個(gè)重要方向是明晰膀胱癌的發(fā)生和發(fā)展機(jī)制。

ADAM 是一種蛋白質(zhì)家族，含有崩解素和金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域，廣泛參與生物過程的調(diào)控，包括細(xì)胞遷移、黏附、分化和增殖等［7，8］。ADAM12 是家族成員之一，基因位于10q26.3，具有典型的ADAM 家族結(jié)構(gòu)序列，包括金屬蛋白酶、崩解素、富含半胱氨酸和表皮生長因子樣結(jié)構(gòu)域，可能與水解蛋白、細(xì)胞黏附以及細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)等功能有關(guān)［9-11］。已有多項(xiàng)研究表明ADAM12 在多種癌癥中高表達(dá)并促進(jìn)惡行腫瘤進(jìn)展，例如乳腺癌［12］、結(jié)直腸癌［10］、肝癌［13］、胰腺癌［14］等；其中，相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道表明ADAM12 通過調(diào)控腫瘤免疫浸潤及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）促進(jìn)胃癌進(jìn)展［15］。盡管ADAM12 在膀胱癌中研究已有報(bào)道，但其作用機(jī)制尚未被明確闡明，其與腫瘤免疫細(xì)胞關(guān)系也未見報(bào)道［18］。

因此，利用生物信息學(xué)方法結(jié)合體外實(shí)驗(yàn)研究來分析ADAM12在膀胱癌中的表達(dá)情況，同時(shí)也探討它與臨床病理特征以及免疫細(xì)胞浸潤之間的關(guān)系，從而深入研究其可能對(duì)膀胱癌進(jìn)展的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

采用上海細(xì)胞庫購買的正常人膀胱細(xì)胞SVHUC-1 以及膀胱癌細(xì)胞系UMUC3、5637、J82 作為實(shí)驗(yàn)材料。膀胱癌細(xì)胞系T24 由蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院郭園園課題組惠贈(zèng)。

主要試劑和儀器：MEM、DMEM 及1640 培養(yǎng)基購自武漢普諾賽公司，牛胎兒血清（FBS）購自浙江天航生物，胰酶購自美國Gbico 公司，小干擾siRNA 及質(zhì)粒購自上海吉滿生物公司，nanotrans 購自合肥佰歐晶公司，引物購自安徽通用生物公司，Marker、Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒MonScriptTMRTlll All-in-One Mix with dsDNase 及實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試劑盒MonAmpTMChemoHS qPCR Mix 均購自武漢莫納生物公司，蛋白酶磷酸酶抑制劑及BCA 蛋白定量試劑盒購自上海碧云天生物公司，一抗及二抗分別購自武漢Proteintech 生物公司和北京Bioss 生物公司。多功能酶標(biāo)儀（型號(hào)：1510）購自美國賽默飛公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（型號(hào)：7500）購自美國Bio-Rad 公司。光學(xué)顯微鏡（型號(hào)：4J09628）購自日本Olympus 公司。

1.2 標(biāo)本來源

蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科采集了30 例2021 年度膀胱癌患者的手術(shù)切除標(biāo)本蠟塊。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）全部為全膀胱切除患者；（2）所有患者術(shù)前均未進(jìn)行放、化療；（3）已經(jīng)我院病理檢查確診；排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）經(jīng)尿道局部電切患者；（2）術(shù)前已經(jīng)過治療患者；（3）合并其他重大疾病患者。本實(shí)驗(yàn)計(jì)劃經(jīng)蚌埠醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)同意。

1.3 數(shù)據(jù)下載和處理

從TCGA 數(shù)據(jù)庫官方網(wǎng)站下載膀胱癌轉(zhuǎn)錄組FPKM 數(shù)據(jù)，總共有412 個(gè)膀胱癌組織樣本和19 個(gè)正常膀胱組織樣本。利用R.4.0.3 等軟件對(duì)對(duì)下載的基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理，然后使用log2轉(zhuǎn)化，以便進(jìn)行后續(xù)分析。同時(shí)，應(yīng)用自動(dòng)操作將膀胱癌患者的臨床病理特征信息進(jìn)行下載和提取，并篩選出僅保留臨床信息完整的數(shù)據(jù)用于后續(xù)分析。

1.4 數(shù)據(jù)庫及生物信息學(xué)分析

TCGA 數(shù)據(jù)庫分析ADAM12 在腫瘤與正常組織中的表達(dá)，并根據(jù)其表達(dá)水平進(jìn)行預(yù)后分析。利用 公 共 在 線GEPIA 數(shù) 據(jù) 庫（http：//gepia.cancerpku.cn）對(duì)基因相關(guān)性分析。使用GSEA4.0.3 軟件進(jìn)行基因富集分析。 利用仙桃學(xué)術(shù)數(shù)據(jù)庫（https：//www.xiantao.love）對(duì)基因ADAM12進(jìn)行泛癌分析，并探索其與EMT 相關(guān)標(biāo)志物之間的相關(guān)性。利用CIBERSORT 方法計(jì)算膀胱癌樣本中22 個(gè)免疫細(xì)胞浸潤比例，使用P<0.05 作為過濾標(biāo)準(zhǔn)，過濾結(jié)果使用柱狀圖顯示；同時(shí)提取并分析ADAM12基因與免疫細(xì)胞浸潤之間相關(guān)性，并通過散點(diǎn)圖展示。

1.5 ADAM12 表達(dá)與臨床病理特征相關(guān)性分析

根據(jù)膀胱癌患者中ADAM12表達(dá)水平的中位數(shù)，將膀胱癌患者分為高表達(dá)組和低表達(dá)組。使用SPSS Statistics 25.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析ADAM12表達(dá)與年齡、性別、T階段、N階段、M階段、Grade分級(jí)、Stage分期等之間的關(guān)系。我通過對(duì)膀胱癌患者的生存數(shù)據(jù)和ADAM12的表達(dá)量進(jìn)行單因素和多因素cox回歸分析，研究了ADAM12在膀胱癌患者中的預(yù)后價(jià)值。這些數(shù)據(jù)來自于TCGA-BLCA數(shù)據(jù)庫。

1.6 免疫組化檢測

使用DAB 法對(duì)腫瘤組織石蠟切片進(jìn)行免疫組化染色，經(jīng)烘烤后，脫蠟、水合、抗原再生等過程，在加入3%過氧化氫滅活內(nèi)源性過氧化物酶后，樣品接著加入了一抗（兔抗，稀釋比例為1∶200），然后在4 ℃條件下孵育過夜（共計(jì)12 h），接著使用通用二抗（抗兔，稀釋比例為1∶2 000），在37 ℃條件下孵育30 min。隨后，使用DAB 光鏡顯色，并對(duì)樣品進(jìn)行脫水、封片，最后在顯微鏡下觀察并統(tǒng)計(jì)結(jié)果。蛋白表達(dá)強(qiáng)度的計(jì)算方法為：在100 倍和400 倍高倍放大鏡下分別隨機(jī)選擇3 個(gè)不相鄰的視野進(jìn)行觀察，根據(jù)細(xì)胞質(zhì)中呈現(xiàn)棕色或棕黃色顆粒的數(shù)量來評(píng)估染色強(qiáng)度（0：陰性；1∶弱陽性；2：中等陽性；3：強(qiáng)陽性）；計(jì)算陽性染色細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分比，并計(jì)算分?jǐn)?shù)分（0 分：0；1 分：1%～10%；2 分：11%～50%；3 分：51%～80%；4 分：81%～100%）。每個(gè)切片的染色強(qiáng)度評(píng)分是通過將二者的得分相乘得出的。得分范圍從0 到1 分，表示陰性，用“-”符號(hào)表示；從2 到4 分表示弱陽性，用“+”符號(hào)表示；從5 到8 分表示中等陽性，用“++”符號(hào)表示；從9 到12 分表示較強(qiáng)陽性，用“+++”符號(hào)表示。

1.7 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

細(xì)胞在37 ℃、5% CO2中培養(yǎng)，是含有1%雙抗及10%胎牛血清的MEM 培養(yǎng)基。將UMUC3 和J82 細(xì)胞分別接種到一個(gè)有6 個(gè)孔的培養(yǎng)板中。在細(xì)胞融合率達(dá)到50%～60%時(shí)，根據(jù)nanotrans 說明書將小干擾或質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)胞，6 h 后更換正常完全培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)染分組：siNCvs.siADAM12 或NCvs.oe-ADAM12。

1.8 qRT-PCR 檢測

收集UMUC3 細(xì)胞，使用Trizol 試劑提取各組細(xì)胞總RNA。根據(jù)RNA 的定量結(jié)果，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒MonScriptTMRTlll All-in-One Mix with dsDNase 將總RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA（反應(yīng)條件：37 ℃ 2 min，55 ℃ 15 min，85 ℃ 5 min）。以cDNA 為模板，利用實(shí)時(shí)PCR 試劑盒MonAmpTMChemoHS qPCR Mix 說明書配置反應(yīng)體系，完成qRT-PCR 反應(yīng)（反應(yīng)條件：95 ℃ 30 秒，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，進(jìn)行40 個(gè)循 環(huán)）。采 用2-ΔΔCT法 分 析ADAM12 表 達(dá) 水 平。ADAM12 F：5' - CGAGGGGTGAGCTTATGGAAC-3'；R：5'-GCTTTCCCGTTGTAGTCGAATA-3'。GAPDH F：5'-GAGAAGTATGACAACAGCCTCAA - 3'；R：5' - GCCATCACGCCACAGTTT-3'。

1.9 Western Blot 檢測

將UMUC3 及J82 細(xì) 胞 轉(zhuǎn) 染24 h 后，使 用RIPA提取總蛋白，并使用BCA 試劑盒對(duì)蛋白進(jìn)行定量，將不同樣本進(jìn)行濃度統(tǒng)一化處理。按每孔20～40 μg 總量進(jìn)行上樣，每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，上樣結(jié)束后進(jìn)行電泳（條件：120 mV 2 h）。將電泳好的PAGE 凝膠進(jìn)行轉(zhuǎn)膜（條件：400 mA 1 h），在結(jié)束后，將PVDF 膜放入5%脫脂奶粉中室溫封閉2 h。成功封閉后，使用TBST 清洗膜3 次，然后在4 ℃孵化一抗體過夜。ADAM12、E-cadherin、N-cadherin、vimentin、GAPDH 及二抗的稀釋濃度分別為 1∶500、1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶5 000 和1∶5 000。

1.10 CCK-8 檢測

將各組UMUC3 細(xì)胞鋪至96 孔板中，每組5 個(gè)復(fù)孔，每孔2 000 個(gè)細(xì)胞、100 μL 完全培養(yǎng)基，待細(xì)胞貼壁后，將每個(gè)孔中加入10 μL CCK-8 試劑，隨后放入培養(yǎng)箱中孵育2 h，接著使用酶標(biāo)儀檢測各個(gè)孔在450 nm 波長下的吸光度值（OD 值）。依此類推，在0、24、48 和72 h 連續(xù)記錄各個(gè)孔的數(shù)值。最后，通過酶標(biāo)儀在OD450 波段檢測OD 值，并計(jì)算細(xì)胞的增值率。

1.11 Transwell 檢測

遷移實(shí)驗(yàn)：先取24 孔板，將轉(zhuǎn)染成功的UMUC3 的各組細(xì)胞消化離心，用無血清MEM 重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)，按每孔5×104個(gè)鋪至小室每個(gè)孔都添加了100 μL 無血清培養(yǎng)基，并且小室外部每個(gè)孔添加了500 μL 含有20%血清的完全培養(yǎng)基。每組有3 個(gè)重復(fù)孔，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取出小室，予以4% 多聚甲醛固定2 h，室溫染色1% 結(jié)晶紫15 min，然后拿出小室，用棉簽和PBS 清洗小室內(nèi)部，最后，將放置小室在顯微鏡下拍照計(jì)數(shù)（使用160 倍放大率），以便最終計(jì)算各組細(xì)胞的遷移率。

1.12 劃痕實(shí)驗(yàn)

將UMUC3 細(xì)胞消化離心，加入5 mL 培養(yǎng)基重懸并計(jì)數(shù)，按每孔2×105細(xì)胞數(shù)鋪至6 孔板，在將細(xì)胞培養(yǎng)至密度約60%～70% 左右后，進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，并分別設(shè)立對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。在每個(gè)孔中細(xì)胞密度達(dá)到90%以上時(shí)，使用10 μL 槍頭垂直劃痕，并在顯微鏡下以64 倍放大拍照，記錄0 h、24 h 和48 h的劃痕面積。

1.13 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用Graphpad prism 8.0 軟件和SPSS25.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，使用平均±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）進(jìn)行測量，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，使用spearman 進(jìn)行相關(guān)性檢驗(yàn)，P<0.05 對(duì)差異具有統(tǒng)計(jì)意義。

2 結(jié)果

2.1 ADAM12 在膀胱癌中表達(dá)及預(yù)后

基于TCGA 數(shù)據(jù)庫，配對(duì)與非配對(duì)分析結(jié)果表明，膀胱癌組織中ADAM12 表達(dá)水平明顯高于正常組織（P<0.05，見圖1A-B），且高表達(dá)與預(yù)后呈負(fù)相關(guān)（P=0.007，見圖1C）。qRT-PCR 檢測結(jié)果顯示，ADAM12 在膀胱癌J82 及UMUC3 細(xì)胞系中表達(dá)高于正常膀胱細(xì)胞（t值分別為15.01、19.91，均P<0.05，見圖1D）。泛癌分析結(jié)果表明ADAM12 在泛癌中普遍高表達(dá)，其中膀胱癌組織中的表達(dá)量高于正常組織（P<0.05，見圖1E）。

2.2 免疫組化檢測

免疫組化（IHC）染色圖像表明ADAM12 位于細(xì)胞質(zhì)和質(zhì)膜中。評(píng)分結(jié)果表明，膀胱癌組織中ADAM12 的表達(dá)水平顯著高于鄰近組織（t=8.308，P<0.05，見圖2）。

圖2 IHC 檢測膀胱癌與鄰近組織中ADAM12 表達(dá)量Fig 2 ADAM12 expression in bladder cancer and adjacent tissues detected by IHC

2.3 ADAM12 表達(dá)與膀胱癌患者臨床病理特征相關(guān)性分析

基于TCGA 臨床數(shù)據(jù)，ADAM12 在膀胱癌中表達(dá)與年齡、Grade 分級(jí)、Stage 分期、T 分期和N 分期等有關(guān)（P<0.05），而與性別和M 分期無關(guān)（P>0.05，見圖3）。在單因素COX 回歸分析中，年齡、分期、T 分期、N 分期、ADAM12 均可作為膀胱癌的潛在預(yù)后因素（P<0.05）；Cox 多因素回歸分析結(jié)果提示，ADAM12 可作為膀胱癌的獨(dú)立預(yù)后變量（P<0.05）。見表1。

表1 單因素和多因素回歸分析ADAM12 在膀胱癌中的作用Tab 1 Univariate and multivariate regression analysis of the role of ADAM12 in bladder cancer

圖3 ADAM12 與膀胱癌臨床病理特征關(guān)系Fig 3 Relationship between ADAM12 and clinicopathological features of bladder cancer

2.4 GESA 富集分析

使用GSEA 鑒定響應(yīng)ADAM12 高表達(dá)而富集的相關(guān)基因。在ADAM12 高表達(dá)組中，ADAM12與侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)的腫瘤途徑、細(xì)胞黏附分子、ECM 受體顯著相關(guān)（P<0.05，見圖4A）；另外ADAM12 還參與趨化因子信號(hào)通路、腫瘤發(fā)生、和癌癥相關(guān)多種途徑（P<0.05，見圖4B）。

2.5 敲低ADAM12 抑制膀胱癌細(xì)胞生物學(xué)行為

敲低UMUC3 細(xì)胞ADAM12基因表達(dá)，qRTPCR 檢測結(jié)果顯示，相較于NC 組，siADAM12-2 組（簡稱si2）敲低效率最佳（t=8.676，P<0.05，見圖5A）。Western Blot 檢測進(jìn)一步證實(shí)干擾效率（見圖5B）。對(duì) 比NC 組，CCK8 檢 測 結(jié) 果 顯 示，siADAM12-2 組細(xì)胞活力降低（t=11.64，P<0.05，見圖5C）；Transwell 結(jié)果顯示，siADAM12-2 組細(xì)胞遷移能力顯著降低（t=7.852，P<0.05，見圖5D）；劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，siADAM12-2 組細(xì)胞愈合能力顯著降低（t=8.49，P<0.05，見圖5E）。

圖5 ADAM12 影響膀胱癌細(xì)胞生物學(xué)行為Fig 5 ADAM12 affecting the biological behavior of bladder cancer cells

2.6 ADAM12 通過觸發(fā)EMT 促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞遷移

TCGA 數(shù) 據(jù) 庫 分 析 顯 示，ADAM12 與EMT 相關(guān)標(biāo)志物E-cadherin 負(fù)相關(guān)（r=-0.144，P=0.003）、與N-cadherin 正相關(guān)（r=0.646，P<0.001）、vimentin正 相 關(guān)（r=0.754，P<0.001）、Snail 正 相 關(guān)（r=0.605，P<0.001）、MMP2 正 相 關(guān)（r=0.784，P<0.001）及MMP9 正相關(guān)（r=0.596，P<0.001，見圖6A）。Western Blot 檢測結(jié)果表明，對(duì)比NC 組，敲低組E-cadherin 蛋白表達(dá)增加，N-cadherin、vimentin蛋白表達(dá)降低（見圖6B）；過表達(dá)則結(jié)果相反（見圖6C）。

圖6 ADAM12 促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化Fig 6 ADAM12 promoting epithelial-mesenchymal transformation in bladder cancer cells

2.7 ADAM12 與膀胱TICS 相關(guān)性

CIBERSORT 計(jì)算19 個(gè)正常樣本和412 個(gè)腫瘤樣本，過濾結(jié)果柱狀圖顯示（P<0.05，見圖7A）。根據(jù)CIBERSORT 方法計(jì)算的結(jié)果，ADAM12 的表達(dá)與M1 巨噬細(xì)胞正相關(guān)（r=0.19，P=0.01）、M2 巨噬細(xì)胞正相關(guān)（r=0.46，P<0.000 1）、CD4+記憶靜止T 細(xì)胞正相關(guān)（r=0.16，P=0.03），與樹突狀細(xì)胞負(fù)相關(guān)（r=-0.4，P<0.000 1）、濾泡輔助T 細(xì)胞負(fù)相關(guān)（r=-0.2，P=0.007 6）、調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)（r=-0.16，P=0.032，見圖7B）。接著相關(guān)性分析ADAM12 與免疫檢查點(diǎn)關(guān)系，結(jié)果顯示ADAM12 與 免 疫 檢 查 點(diǎn)CTLA4（r=0.15，P=0.002 7）、PDCD1（r=0.13，P=0.007 9）和LAG3（r=0.1，P=0.038）表達(dá)呈正相關(guān)（見圖7C）。

3 討 論

目前，越來越多的研究表明，上皮間質(zhì)化轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition， EMT）在癌癥的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中起著重要作用［16］。同樣，EMT 是膀胱癌轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵過程。先前研究表明，EMT 是促進(jìn)NMINC 到MIBC 重要的生物過程［17］。因此，需要積極探索到能夠預(yù)測膀胱癌預(yù)后且能成為調(diào)節(jié)膀胱癌轉(zhuǎn)移的靶標(biāo)分子變得尤為重要。

在本研究中，首先利用TCGA 數(shù)據(jù)庫分析表明ADAM12 在膀胱癌中高表達(dá)且與不良預(yù)后相關(guān)，體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)及免疫組織化學(xué)檢測進(jìn)一步證實(shí)ADAM12 在膀胱癌中高表達(dá)。臨床病理特征分析結(jié)果表明ADAM12 與不良分期、分級(jí)顯著相關(guān)。多因素cox 回歸分析表明，ADAM12 可以作為膀胱癌獨(dú)立預(yù)后因子。既往研究也報(bào)道稱ADAM12 有希望作為膀胱癌的預(yù)后標(biāo)志物［18］。這些研究結(jié)果表明ADAM12 可能作為膀胱癌預(yù)后的有力預(yù)測因子。

其次，為進(jìn)一步探索ADAM12 是否影響膀胱癌EMT 發(fā)生，首先利用GSEA 富集分析，結(jié)果表明其主要與“細(xì)胞黏附”、“ECM 受體”和“多種信號(hào)通路”相關(guān)，說明ADAM12 在腫瘤轉(zhuǎn)移和癌癥信號(hào)通路活化中具有潛在作用。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道稱ADAM12 參與細(xì)胞黏附并可以降解各種細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）蛋白，明膠、Ⅳ型膠原和纖維連接蛋白在細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）重塑過程中扮演著重要角色，ECM 重 塑 是 腫 瘤 性 疾 病 的 特 征［19，20］。此 外，ADAM12 與基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）密切相關(guān)，并通過ECM 的切割和生長因子的釋放參與細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的重塑和細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)［21］。已知ECM 改變與EMT 發(fā)生密切相關(guān)，而癌癥中的EMT 與腫瘤侵襲、遷移相關(guān)［22-24］。同樣，在本研究結(jié)果中，ADAM12 與EMT 相 關(guān) 標(biāo) 志 物E-cadherin 負(fù) 相 關(guān)，而 與N-cadherin、vimentin、Snail、MMP2 及MMP9 等呈正相關(guān)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)敲低ADAM12 時(shí)，E-cadherin 表達(dá)增加，N-cadherin 及vimentin 表達(dá)降低；當(dāng)過 表 達(dá)ADAM12 時(shí)，E-cadherin 表 達(dá) 下 降，N-cadherin 及vimentin 表達(dá)增加。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，敲低ADAM12 可抑制膀胱癌細(xì)胞遷移。所有結(jié)果都表明了ADAM12 是膀胱癌細(xì)胞中EMT 的重要調(diào)節(jié)因子。在相關(guān)研究報(bào)道中，稱ADAM12 與EMT 發(fā)生密切相關(guān)，其通過調(diào)控胃癌細(xì)胞EMT 促進(jìn)腫瘤侵襲遷移［25］；在乳腺癌中，甚至將ADAM12 確立為一種新的EMT 標(biāo)志物［26］。這與本研究結(jié)果一致，ADAM12 通過刺激EMT 促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞遷移。

最后，進(jìn)一步探索了ADAM12 是否影響膀胱癌免疫微環(huán)境。相關(guān)文獻(xiàn)表明ADAM12 參與多種腫瘤進(jìn)展，可能通過免疫浸潤影響腫瘤的發(fā)生與發(fā)展［21，27，28］。在這項(xiàng)研究中，發(fā)現(xiàn)了ADAM12 的表達(dá)水平與膀胱癌患者體內(nèi)多種免疫細(xì)胞的浸潤具有顯著的相關(guān)性。其中ADAM12 的表達(dá)與M2 巨噬細(xì)胞有顯著的正相關(guān)。巨噬細(xì)胞是腫瘤轉(zhuǎn)移和免疫抑制的必要因素，巨噬細(xì)胞具有M1 和M2 兩種表型，從而可以分別促進(jìn)腫瘤免疫反應(yīng)或刺激腫瘤發(fā)展［29］。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞主要表現(xiàn)為M2 樣表型，通過促進(jìn)腫瘤免疫抑制刺激腫瘤生長［30］。其中，TAM 的M2 極化通過導(dǎo)致巨噬細(xì)胞產(chǎn)生生長因子和細(xì)胞因子，在調(diào)節(jié)腫瘤生長、遷移和血管生成中起重要作用［31］。最后，我們進(jìn)一步分析了ADAM12與免疫檢查點(diǎn)的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)其與CTLA4、PDCD1 和LAG3 等表達(dá)呈正相關(guān)。這些結(jié)果表明，ADAM12可能通過調(diào)控免疫細(xì)胞浸潤進(jìn)而影響膀胱癌進(jìn)展。

綜上，研究證實(shí)了ADAM12 在膀胱癌中高表達(dá)，與不良預(yù)后相關(guān)。通過生物信息學(xué)及一系列實(shí)驗(yàn)研究表明，ADAM12 通過調(diào)控EMT 發(fā)生從而促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞遷移；另外，ADAM12 可能影響腫瘤免疫微環(huán)境。但本研究仍有不足之處，我們僅僅是基于數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)分析了ADAM12 高表達(dá)與患者的不良預(yù)后相關(guān)，缺乏臨床隨訪數(shù)據(jù)進(jìn)一步佐證。另外，未能深入研究ADAM12 影響EMT 及M2 巨噬細(xì)胞極化的具體機(jī)制，需待未來研究進(jìn)一步探索。總之，ADAM12 可能作為膀胱癌的不良預(yù)后因子和治療靶點(diǎn)。

作者貢獻(xiàn)度說明：

張曉林：完成本文的構(gòu)思和實(shí)驗(yàn)，并對(duì)文章數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；汪盛對(duì)本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行指導(dǎo)及論文修改。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。