汪倩如，鐘立璠，黃 凌

（1.海南省藥物臨床前藥理毒理學(xué)研究重點實驗室，海南 ?？?570100；2.海南省創(chuàng)傷與災(zāi)難救援研究重點實驗室，海南 ?？?70100；3.海南醫(yī)學(xué)院海南省藥物安全性評價研究中心，海南 ?？?571199；4.海南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，海南 海口 571199）

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是世界第三大癌癥，發(fā)病率和死亡率逐年上升［1］。結(jié)腸炎相關(guān)性結(jié)腸癌（Colitis-associated colon cancer，CACC）是由活動性結(jié)腸炎發(fā)展而來的，隨著結(jié)腸炎嚴(yán)重程度、患病時長以及結(jié)腸損傷范圍的增加，CACC 的發(fā)病率不斷提高［2，3］。

5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）是一種化療藥物，臨床上用于治療結(jié)直腸癌、乳腺癌、胃癌等癌癥［4，5］。但由于5-FU 首關(guān)效應(yīng)明顯，極易產(chǎn)生不良反應(yīng)及耐藥性［6，7］。因此，5-FU 常與其他藥物聯(lián)合給藥來提高5-FU 對結(jié)腸癌的治療作用。楓蓼腸胃康（Feng-Liao-Chang-Wei-Kang，F(xiàn)LCWK）由牛耳楓和辣蓼草組成，含有許多化學(xué)成分如黃酮類、生物堿類等，具有抗?jié)冃越Y(jié)腸炎、抗炎鎮(zhèn)痛等作用［8，9］，在臨床上主要用于治療結(jié)腸炎、腸易激綜合征等癥［9，10］。

課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，楓蓼腸胃康能通過抑制IL-6/STAT3 通路增效5-FU 抑制結(jié)腸癌細胞的增殖、促進結(jié)腸癌細胞凋亡。本研究采用CACC 小鼠模型，觀察CACC 小鼠在給藥后結(jié)腸組織的病變情況，探討聯(lián)合給藥對IL-6/STAT3 通路的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

楓蓼腸胃康顆粒購自?？谑兄扑帍S有限公司，氟尿嘧啶注射液購自上海旭東海普藥業(yè)有限公司，IL-6、IL-1β、STAT3、P-STAT3 抗體購自Cell Signaling Technology，Cyclin D1、CDK4、Bax、Bcl-2、βactin 抗體購自Abcam 公司，蛋白濃度測定試劑盒、ECL 發(fā)光試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司。

1.2 實驗動物

100 只4～6 周齡BALB/c 小鼠，雄性，購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，許可證號SCXK（滬）2017-0005。

1.3 分組及給藥

取小鼠100 只，隨機分成5 組，空白對照組10只，AOM/DSS 模型組30 只，F(xiàn)LCWK（4 g/kg）組、5-FU（24 mg/kg）組、5-FU（24 mg/kg）+FLCWK（4 g/kg）聯(lián)合給藥組各20 只。FLCWK 組和聯(lián)合給藥組從造模第1 天開始灌胃注射FLCWK 溶液；5-FU組和聯(lián)合給藥組在造模結(jié)束前一周開始尾靜脈注射5-FU，1 d 注射1 次，共7 次。

1.4 建立CACC 動物模型

造模開始時，空白對照組腹腔注射生理鹽水，AOM/DSS 模型組、FLCWK 組、5-FU 組、5-FU+FLCWK 聯(lián)合給藥組小鼠腹腔注射12.5 mg/kg AOM。一周后，除空白對照組以外其他組小鼠飲用含2.5%DSS 飲用水一周、正常飲用水2 周，以此為一個循環(huán)，共反復(fù)3 個循環(huán)建立CACC 小鼠模型（見圖1）。造模結(jié)束后處死小鼠，取盲腸到肛門部位，沿著結(jié)腸組織縱軸方向?qū)⑵淝虚_，用生理鹽水將糞便清洗干凈，觀察腸內(nèi)膜腫瘤病變情況。然后取部分結(jié)腸放入4%中性甲醛固定，其余組織放入-80 ℃保存進行后續(xù)蛋白檢測試驗。

圖1 造模后各組小鼠體重及DAI 變化Fig 1 Changes in body weight and DAI of mice in each group after modeling

1.5 小鼠一般情況觀察

飼養(yǎng)期間每2 日觀察并記錄各組小鼠的飲食、精神、毛發(fā)及活動狀態(tài)，觀察小鼠的疾病活動指數(shù)（DAI）、結(jié)腸長度、成瘤率、腫瘤大小變化等。小鼠疾病活動指數(shù)（DAI）=（體重下降分數(shù)+大便性狀分數(shù)+便血分數(shù)）/3。

表1 DAI 評分標(biāo)準(zhǔn)Tab 1 DAI scoring standard

1.6 Western blot 檢測小鼠結(jié)腸組織IL-6/STAT3通路相關(guān)蛋白的表達

提取蛋白，BCA 蛋白定量后上樣。濃縮膠90 V恒壓，分離膠120 V 恒壓，樣品遷移至底部時切下目的蛋白區(qū)域凝膠，將濾紙、凝膠、PVDF 膜夾成三明治樣子進行轉(zhuǎn)膜。200 mA 恒流轉(zhuǎn)膜1 h 后，將PVDF 膜取出放入5%脫脂奶粉或BSA 中封閉2 h。TBST 洗膜3 次后加入一抗，4 ℃孵育過夜。TBST洗膜3 次，加入二抗孵育1.5 h，TBST 洗膜3 次后進行顯影。

1.7 HE 染色觀察結(jié)腸組織病理學(xué)變化

將固定好的結(jié)腸組織進行脫水、包埋、切片，將載玻片放入60 ℃烘箱中烘烤過夜后進行染色：二甲苯脫蠟、乙醇浸泡、蘇木素染色、鹽酸分化、伊紅染色、脫水、透明、中性樹膠封片。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

利用統(tǒng)計學(xué)分析軟件SPSS26.0、Graph Pad Prism8.0 對實驗數(shù)據(jù)進行分析，結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（Means ± SEM）表示，采用單因素方差分析（One-way ANOVA）對實驗數(shù)據(jù)進行分析，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FLCWK 聯(lián)合5-FU 對小鼠狀態(tài)的影響

如圖1 所示，在飲用DSS 期間，小鼠體重明顯下降，活動減少，嚴(yán)重的出現(xiàn)便血、腹瀉；當(dāng)把DSS換成正常飲用水后，這些癥狀逐漸緩解，體重逐漸恢復(fù)正常。第三個飲用水階段，小鼠體重增加，尾靜脈注射5-FU 后，5-FU 組與聯(lián)合給藥組的小鼠體重均有所下降，而FLCWK 組小鼠則表現(xiàn)出良好的精神狀態(tài)，癥狀也較輕。飲用DSS 期間，除空白組外的各組小鼠疾病活動指數(shù)（DAI）明顯上升，把DSS 換成正常飲用水后，DAI 逐漸下降。

采用AOM/DSS 造模后，第70 天處死小鼠，取盲腸到肛門部位，沿著結(jié)腸組織縱軸方向?qū)⑵淝虚_，用生理鹽水將糞便清洗干凈，測量結(jié)腸長度并觀察腫瘤大小。如圖2 所示，空白組小鼠結(jié)腸腸壁通透，未觀察到腫瘤；模型組小鼠全部成瘤，腸壁增厚，能明顯觀察到有多個腫瘤分布其上，且結(jié)腸長度明顯縮短（P<0.01）；與模型組相比，F(xiàn)LCWK 組、5-FU 組及聯(lián)合給藥組小鼠結(jié)腸長度均顯著增長（P<0.01），全部成瘤但可觀察到腫瘤數(shù)目明顯減少、腫瘤大小相比模型組更小。

圖2 造模后各組小鼠結(jié)腸長度Fig 2 Colonic length of mice in each group after modeling

2.2 FLCWK 聯(lián)合5-FU 對小鼠存活率的影響

如圖3 所示，第一個DSS 飲用期間，模型組小鼠死亡率最高，有近1/3 的小鼠死亡；第二個DSS 飲用期間，各組小鼠均無死亡；第三個DSS 飲用期間，各組小鼠均有死亡。FLCWK 組和5-FU 組小鼠存活率較模型組顯著升高，聯(lián)合給藥組的小鼠存活率較FLCWK 組和5-FU 組高。

圖3 各組小鼠存活率Fig 3 Survival rate of mice in each group

2.3 FLCWK 聯(lián)合5-FU 對IL-6/STAT3 通路相關(guān)蛋白的影響

如圖4 所示，采用AOM/DSS 造模后，模型組小鼠P-STAT3、IL-6、IL-1β 蛋白表達明顯上升； FLCWK 與5-FU 聯(lián)合給藥后，P-STAT3、IL-6、IL-1β 的表達相比模型組明顯下降（P<0.01）。STAT3 的表達在造模及給藥后無明顯差異。實驗結(jié)果表明，F(xiàn)LCWK 聯(lián)合5-FU 給藥能更有效的抑制PSTAT3、IL-6、IL-1β 的表達。

圖4 Western blot 檢測CACC 小鼠結(jié)腸P-STAT3、STAT3、IL-6、IL-1β 的表達Fig 4 Western blot detection of colonic P-STAT3， STAT3， IL-6， IL-1β expression in CACC mice

如圖5 所示，用AOM/DSS 造模后，Cyclin D1、CDK4 以及Bcl-2 的表達上升，Bax 的表達明顯下降。FLCWK 聯(lián)合5-FU 給藥顯著降低了Cyclin D1和 CDK4 的表達（P<0.01）、上調(diào)了Bax 的表達（P<0.01）。

圖5 Western blot 檢測CACC 小鼠結(jié)腸Bax、Bcl-2、Cyclin D1、CDK4 的表達Fig 5 Western blot detection of colonic Bax， Bcl-2， Cyclin D1， CDK4 expression in CACC mice

2.4 FLCWK 聯(lián)合5-FU 對小鼠結(jié)腸病理學(xué)的影響

如圖6 所示，空白對照組細胞排列整齊，無炎性細胞浸潤。模型組可以觀察到結(jié)腸表面有多發(fā)性息肉樣及結(jié)節(jié)狀腫物，杯狀細胞排列不規(guī)則，隱窩結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，核增大，核分裂常見，基底大量淋巴細胞聚集，腸壁增厚，符合CACC 診斷標(biāo)準(zhǔn)。FLCWK 和5-FU 單獨給藥組，細胞排列相比模型組較整齊，炎性細胞浸潤較模型組均有減輕；聯(lián)合給藥組細胞排列明顯整齊，炎性浸潤明顯減輕。

圖6 各組小鼠HE 染色情況示意圖（×200）Fig 6 Schematic diagram of HE staining in each group of mice（×200）

3 討論

結(jié)腸癌發(fā)病率高且死亡率高，年輕人患結(jié)腸癌的概率也在逐年增加，尋找有效的藥物及靶點治療結(jié)腸癌已成為當(dāng)前研究的熱點［11］。結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展，與多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)，其中IL-6/STAT3是一條經(jīng)典的信號通路，激活I(lǐng)L-6/STAT3 信號通路會導(dǎo)致細胞增殖的發(fā)生，促進癌癥的發(fā)展［12］。

有研究表明，IL-6/STAT3 通路的異常激活與CyclinD1、Bcl-2 等過度表達而導(dǎo)致腫瘤細胞過度增殖和凋亡抑制有關(guān)［13］。Bcl-2 及Bax 在細胞凋亡過程中發(fā)揮重要的作用［14］。Bax 與Bcl-2 形成異源二聚體，當(dāng)Bax/Bcl-2 比值下降時，抑制細胞凋亡［15-17］。Cyclin D1 及CDK4 參與腫瘤細胞的發(fā)生與發(fā)展，細胞分裂失調(diào)引起的細胞增殖異常是腫瘤標(biāo)志性特征之一。從細胞周期的一個步驟進行到下一個步驟是由周期蛋白依賴性激酶（CDKs）控制的［18］。當(dāng)受到刺激時，細胞周期蛋白D 會和CDK4 發(fā)生相互作用［19］。腫瘤細胞中，CDK4 與Cyclin D1 的激活導(dǎo)致細胞一直分裂，促進腫瘤生長［20］。

本實驗采用CACC 小鼠模型，觀察FLCWK 聯(lián)合5-FU 給藥后對小鼠的治療作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)LCWK 聯(lián)合5-FU 給藥顯著提高了小鼠的存活率，減輕了小鼠腸壁增厚及間質(zhì)炎癥情況。FLCWK 聯(lián)合5-FU 能夠抑制STAT3 的磷酸化、抑制IL-6 及IL-1β 的表達；同時能夠抑制Cyclin D1、CDK4、Bcl-2 的表達，上調(diào)Bax 的表達。

采用氧化偶氮甲烷/葡聚糖硫酸鈉（AOM/DSS）建立CACC 小鼠模型，HE 染色觀察小鼠結(jié)腸病理變化，Western blot 檢測IL-6/STAT3 通路相關(guān)蛋白的表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)LCWK 聯(lián)合5-FU 能夠抑制IL-6/STAT3 通路來發(fā)揮對CACC 的抑制作用。

作者貢獻度說明：

汪倩如：設(shè)計實驗、進行實驗、分析數(shù)據(jù)、撰寫論文；鐘立璠：設(shè)計實驗、論文修改；黃凌：提供研究思路、指導(dǎo)論文撰寫及修改。所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。