許心蕊，高 照，張晴玥，楊漫芳，孫 浩，馮 露，王添鈺，李 洋，婁利霞，吳愛明，聶 波，

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院中醫(yī)內(nèi)科學(xué)教育部和北京市重點實驗室，北京 100700；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院，上海200032；3.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100029；4.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院病理科，北京 100700）

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是脂質(zhì)驅(qū)動的慢性炎癥反應(yīng)，是心血管疾病的主要病理基礎(chǔ)，其特征是脂質(zhì)代謝紊亂、內(nèi)膜下氧化低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL）沉積和炎癥反應(yīng)，泡沫細(xì)胞積聚和斑塊形成［1］。Ox-LDL 被認(rèn)為是AS 進展的主要觸發(fā)因素之一［2］。過氧化物酶體增殖物激活受體γ （peroxisome proliferator-activated receptor γ， PPAR-γ）信號通路能夠調(diào)控脂代謝使其成為治療代謝性疾病的關(guān)鍵靶點。在AS 進展中，通過改善ox-LDL 脂質(zhì)代謝紊亂，發(fā)揮穩(wěn)定粥樣斑塊作用，是防治AS 的重要機制之一［3］。本研究團隊前期實驗證實四妙勇安湯通過激活PPAR-γ，抑制FABP-4 表達(dá)，拮抗ox-LDL 脂代謝途徑，從而穩(wěn)定斑塊，具有AS 保護作用［4］。采用UHPLC-LTQ-Orbitrap 技術(shù)在四妙勇安湯及其入血成分中均鑒定有異甘草素等原型成分［5］。在篩選的PPAR-γ 激動劑四妙勇安湯活性部位CS05中鑒定得到異甘草素［6］，經(jīng)過分子對接驗證異甘草素具有較強激活PPAR-γ 的活性。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選出異甘草素是四妙勇安湯發(fā)揮抗炎作用的主要成分［5］，文獻報道異甘草素的研究主要集中在抗腫瘤方面［7］，對AS 的藥理作用及機制報道很少。因此，本研究在前期實驗初步驗證異甘草素具有抗AS 的作用基礎(chǔ)上，從PPAR-γ 信號通路調(diào)控ox-LDL 代謝途徑探討異甘草素對于ApoE-/-小鼠AS的作用機制。

1 材料與方法

1.1 一般材料

1.1.1 實驗動物與飼料 C57BL/6J 小鼠，雄性，7周齡；ApoE-/-小鼠，雄性，7 周齡，體重（20±2） g，由北京維通利華實驗動物中心提供［許可證號：SCXK（京）2021-0011］。動物飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院屏障級動物房（動物房編號：SYXK（京）2020-0013），飼養(yǎng)環(huán)境：溫度恒定22～24 ℃，濕度50%，明暗交替12 h 一次。

高脂飼料配方由15% 脂肪、0.25% 膽固醇及84.75%基礎(chǔ)飼料組成，購買于北京華阜康科技有限公司，其許可證號為：SCXK（京）2014-0008。

1.1.2 藥物與試劑 異甘草素（批號：Y-008-181216），購買于成都瑞芬思生物科技有限公司。小鼠ox-LDL ELISA 檢測試劑盒（貨號：E-ELM0066c）購買于武漢Elabscience 生物科技有限公司。飽和油紅O 染色液（貨號：G1260）、改良Masson 三色染色試劑盒（貨號：G1346-50）均購自北京索萊寶科技有限公司。 抗體α-SMA（貨號：ab124964）、MOMA-2（貨號：ab33451）、PPAR-γ（貨號：ab45036）、LXR-α（貨號：ab106464）、FABP-4（貨號：ab92501）、MMP-2（貨號：ab37150）、MMP-9（貨號：ab38898）、GAPDH（貨號：ab9485）均購自英國Abcam 公司。HRP 羊抗兔IgG 抗體（貨號：C1309）、BCA 蛋白定量試劑盒（貨號：P1511）、RIPA 裂解液（貨號：C1053）、脫脂奶粉（貨號：P1622）均購于北京普利萊基因技術(shù)有限公司。一步法PAGE 凝膠快速制備試劑盒（貨號：PG212）購自上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司。

1.1.3 主要儀器 AU5800 全自動生化測定儀（美國BECKMAN COULTER 公司）；EG1150 組織包埋機（德國Arcadia 公司）；RM2135 組織切片機（德國Arcadia 公司）；MK3 全自動酶標(biāo)儀（美國Thermo公司）；LF-mini 3 小型垂直電泳槽、LF-ZY01 小型轉(zhuǎn)印電泳槽（北京龍方科技有限公司）；Tanon-5200 凝膠成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 模型制備及分組給藥 參照文獻［8］，采用高脂飼料喂養(yǎng)聯(lián)合右側(cè)頸總動脈外置套管術(shù)（perivascular carotid collar placement，PCCP）制備AS 模型。20 只ApoE-/-小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，高脂喂養(yǎng)2 周，實行PCCP 術(shù)。小鼠麻醉后，頸部至腋下脫毛，于頸右側(cè)部剪開約2 cm 切口，暴露右側(cè)頸總動脈，將長度約2.5 mm，內(nèi)徑為0.3 mm 的硅膠套管套置于血管外周，并固定套管的上下端。術(shù)后將小鼠隨機分為模型組和異甘草素組，每組10 只。PCCP 術(shù)后當(dāng)天起，異甘草素組小鼠以40 mg/kg 的給藥劑量每天灌胃給藥1 次，連續(xù)灌胃8 周，同時高脂飼料喂養(yǎng)。模型組給予相同劑量的去離子水灌胃。10 只C57BL/6J 小鼠設(shè)為正常組，基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，灌胃相同劑量的去離子水，飼養(yǎng)周期與造模小鼠一致。

1.2.2 全自動生化儀檢測血清中血脂含量 造模完成后對小鼠進行取材，以摘眼球取血的方式收集小鼠血液，4 ℃，3 000 r/min，離心15 min 后收集血清，采用全自動生化儀檢測血清中總膽固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）含量。

1.2.3 酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）檢測血清中ox-LDL水平 按照ELISA 試劑盒操作說明，檢測血清中ox-LDL 水平。

1.2.4 頸動脈斑塊病理形態(tài)特征 小鼠取血后，取右側(cè)頸動脈，經(jīng)4% 多聚甲醛固定后，脫水后行OCT 包埋和石蠟包埋。HE 染色觀察斑塊病理形態(tài)。油紅O 染色和Masson 染色用于斑塊內(nèi)脂質(zhì)和膠原含量分析。MOMA-2 和α-SMA 免疫組化染色用于巨噬細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞分析。應(yīng)用Image Pro Plus 6.0 圖像處理軟件測量血管內(nèi)膜厚度（IT）、中膜厚度（MT）、斑塊面積（PA）和血管管腔面積（LA），并計算IT/MT 以及PA/LA［9］，并對斑塊內(nèi)脂質(zhì)、膠原、MOMA-2 和α-SMA 含量進行測定，計算易損指數(shù)，易損指數(shù)（%）=（MOMA-2 陽性面積百分比+脂質(zhì)陽性面積百分比）/（膠原陽性面積百分比+α-SMA 陽性面積百分比）×100%。

1.2.5 Western blot 檢 測 主 動 脈PPAR-γ、LXR-α、FABP-4、及MMP-2、MMP-9 蛋白表達(dá) 主動脈加入適量蛋白酶抑制劑，超聲破碎，離心收集上清液，BCA 法測量蛋白濃度。取等量蛋白上樣進行電泳，蛋白轉(zhuǎn)移至NC 膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入一抗PPAR-γ（1∶1 000）、LXR-α（1∶1 000）、FABP-4（1∶1 000）、MMP-2（1∶1 000）、MMP-9（1∶1 000）、GAPDH（1∶1 000），4 ℃孵育過夜。次日，TBST 洗膜后加入羊抗兔二抗（1∶5 000），室溫?fù)u床1 h，TBST 洗膜后，ECL 發(fā)光液顯色，凝膠程序系統(tǒng)中曝光、拍照。使用Image J 軟件分析條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 23.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，對數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗，符合正態(tài)分布且方差齊的多組間樣本比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD 法。非正態(tài)分布采用非參數(shù)檢驗。P<0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 異甘草素對AS 小鼠血脂的影響

與正常組比較，模型組小鼠TC、TG、LDL-C 和HDL-C 均增加明顯（P<0.01）。與模型組比較，異甘草素組TC、TG 和LDL-C 降低（P<0.05），HDLC 未見明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見圖1。

圖1 異甘草素對AS 小鼠血脂的影響Fig 1 Effect of isoliquiritigenin on lipids in AS mice

2.2 異甘草素對AS 小鼠血清ox-LDL 的影響

與正常組比較，模型組小鼠血清ox-LDL 顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，異甘草素組小鼠血清中ox-LDL 明顯降低（P<0.01），見圖2。

圖2 異甘草素對AS 小鼠ox-LDL 的影響Fig 2 Effect of isoliquiritigenin on ox-LDL in AS mice

2.3 異甘草素對AS 小鼠頸動脈病理形態(tài)的影響

正常組的血管壁完整光滑，內(nèi)中膜結(jié)構(gòu)完整，未見斑塊生成。模型組可見內(nèi)膜不光滑，內(nèi)中膜厚度不均，中膜平滑肌細(xì)胞排列嚴(yán)重紊亂，內(nèi)膜隆起形成斑塊凸向管腔，IT 顯著增厚（P<0.01），IT/MT明顯增加（P<0.01），PA 明顯增加（P<0.01），PA/LA 明顯增加（P<0.01）。與模型組比較，異甘草素組頸動脈內(nèi)膜不光滑，IT 降低（P<0.01），內(nèi)中膜厚度不均，中膜增厚，IT/MT 降低（P<0.01），管腔內(nèi)PA 明顯減?。≒<0.01），管腔阻塞程度降低，見圖3，4。

圖3 異甘草素對AS 小鼠頸動脈病理形態(tài)的影響（HE 染色，×200）Fig 3 Effect of isoliquiritigenin on the pathological morphology of carotid artery in AS mice（HE staining， ×200）

圖4 異甘草素對AS 小鼠頸動脈影響Fig 4 Effect of isoliquiritigenin on carotid in AS mice

2.4 異甘草素對AS 小鼠頸動脈斑塊內(nèi)脂質(zhì)、膠原、MOMA-2、α-SMA 含量的影響

與正常組比較，模型組頸動脈斑塊內(nèi)脂質(zhì)沉積和MOMA-2 含量較多（P<0.01），膠原含量和α-SMA 含量較少（P<0.01），斑塊易損指數(shù)增加（P<0.01）。與模型組比較，異甘草素組斑塊內(nèi)脂質(zhì)和MOMA-2 含量明顯減少（P<0.01），膠原和α-SMA含量增加（P<0.01），斑塊易損指數(shù)降低（P<0.01），見圖5，6。

圖5 異甘草素對AS 小鼠頸動脈斑塊病理形態(tài)的影響（×200）Fig 5 Effect of isoliquiritigenin on pathological morphology of carotid plaque in AS mice（×200）

圖6 異甘草素對AS 小鼠斑塊易損指數(shù)的影響Fig 6 Effect of isoliquiritigenin on plaque vulnerability index in AS mice

2.5 異甘草素對AS 小鼠脂代謝PPAR-γ、LXR-α和FABP-4 蛋白表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組PPAR-γ、LXR-α 蛋白表達(dá)水平明顯減少（P<0.01）。與模型組比較，異甘草素 組PPAR-γ、LXR-α 蛋 白 表 達(dá) 水 平 增 加（P<0.01）。與正常組比較，模型組FABP-4 蛋白表達(dá)水平明顯增加（P<0.01）。與模型組比較，異甘草素組FABP -4 蛋白表達(dá)水平明顯減少（P<0.01），見圖7。

圖7 異甘草素對AS 小鼠PPAR-γ、LXR-α 和FABP-4 蛋白表達(dá)影響Fig 7 Effect of isoliquiritigenin on the expression of PPAR-γ， LXR-α and FABP-4 proteins in AS mice

2.6 異甘草素對AS 小鼠斑塊穩(wěn)定性蛋白MMP-2、MMP-9 表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組MMP-2 和MMP-9 蛋白表達(dá)水平明顯增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01，P<0.05）。與模型組比較，異甘草素組MMP-2 和MMP-9 蛋白表達(dá)水平減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見圖8。

圖8 異甘草素對AS 小鼠MMP-2 和MMP-9 蛋白表達(dá)的影響Fig 8 Effect of isoliquiritigenin on the expression of MMP-2 and MMP-9 proteins in AS mice

3 討論

AS 是心血管疾病發(fā)病和死亡的主要原因［10］，脂質(zhì)代謝紊亂是AS 的病理基礎(chǔ)。異甘草素是甘草中主要的黃酮類化合物［11］，是四妙勇安湯的有效成分，具有抗炎、抗菌、抗氧化，以及免疫調(diào)節(jié)，保護心臟的作用［12］。研究表明異甘草素能夠改善ApoE-/-小鼠血脂情況［13］，本實驗結(jié)果顯示異甘草素能夠降低AS 小鼠血清中TC、TG、LDL-C 和ox-LDL 的含量，改善AS 小鼠血脂情況。病理結(jié)果表明，模型組頸動脈內(nèi)中膜厚度不均，管腔內(nèi)有較大斑塊堵塞。相較于模型組，異甘草素給藥后，小鼠頸動脈血管IT、PA 減少，PA/LA 降低，斑塊面積減小，管腔堵塞減輕，AS 小鼠頸動脈病理形態(tài)得到改善。可見，異甘草素能夠降低血脂水平，減少ox-LDL 的含量，改善血管病理形態(tài)，發(fā)揮對AS 的保護作用。

易損斑塊形成、斑塊出血、破裂及血栓形成是導(dǎo)致急性心血管事件的主要原因［14］。Ox-LDL 與脂質(zhì)壞死核心的形成有關(guān)，是易損斑塊的重要特征［15］。巨噬細(xì)胞攝取ox-LDL 變?yōu)榕菽?xì)胞［16］，泡沫細(xì)胞形成、凋亡并融合演變成脂質(zhì)壞死核心，降低斑塊穩(wěn)定性［17］。清除循環(huán)中ox-LDL 能夠減少壞死核心并增加斑塊穩(wěn)定性，抑制AS 進展［18］。膠原是纖維帽內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)主要組成成分，斑塊膠原含量在阻止斑塊破裂方面具有重要作用，并且可以增加AS 斑塊的穩(wěn)定性［19］。本實驗研究結(jié)果顯示：模型組斑塊內(nèi)含有較多的脂質(zhì)和MOMA-2 含量，而膠原和α-SMA 含量較少，表現(xiàn)出易損斑塊特征。異甘草素能夠降低ox-LDL 含量，減少斑塊內(nèi)脂質(zhì)和MOMA-2 含量，增加膠原和α-SMA 含量，降低斑塊易損指數(shù)，防止斑塊破裂。

異甘草素對AS 的保護作用機制涉及PPAR-γ依賴性信號通路［20］。PPAR-γ 是一類配體激活的核受體，在維持代謝穩(wěn)態(tài)方面起重要作用，能夠促進細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出［21］。巨噬細(xì)胞經(jīng)PPAR-γ 阻斷后增加膽固醇蓄積，誘導(dǎo)泡沫細(xì)胞形成［22］。相反，激活PPAR-γ 增 加 下 游 蛋 白 肝X 受 體α（Liver X Receptor-α，LXR-α）轉(zhuǎn)錄［23］，拮抗ox-LDL 攝入，增強膽固醇外排，減少脂質(zhì)聚積［24］，從而增加斑塊的穩(wěn)定性。脂肪酸結(jié)合蛋白4（Fatty acid binding protein 4，F(xiàn)ABP-4）在脂質(zhì)代謝中起著中心調(diào)節(jié)的作用，通過增加ox-LDL 誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積聚促進泡沫細(xì)胞轉(zhuǎn) 化［25］，是PPAR-γ 的 主 要 靶 基 因，且 負(fù) 向 調(diào) 節(jié)PPAR-γ 表達(dá)，產(chǎn)生與其相反的作用［26］。本實驗結(jié)果顯示：模型組PPAR-γ、LXR-α 表達(dá)降低，F(xiàn)ABP-4表達(dá)增加，斑塊內(nèi)脂質(zhì)增多，不穩(wěn)定性增加。異甘草 素 能 夠 激 活PPAR-γ，增 加LXR-α 表 達(dá)，降 低FABP-4 表達(dá)，減少ox-LDL 攝入，減少斑塊內(nèi)脂質(zhì)含量，從而穩(wěn)定AS 斑塊。

基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）是評價斑塊不穩(wěn)定性的重要指標(biāo)［27］。Ox-LDL 水平升高加劇血管壁的損傷，增加泡沫細(xì)胞不斷聚集，同時增加MMPs 的分泌［28］，增加斑塊不穩(wěn)定性。MMP-2 和MMP-9 是影響斑塊穩(wěn)定性的主要蛋白酶，能降解細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原，使纖維帽變得薄弱而易于破裂［29］。PPAR-γ 在維持AS 斑塊的穩(wěn)定性方面起重要作用，在調(diào)控ox-LDL 的同時，能夠抑制MMP-9 和MMP-2 表達(dá)［30］。本 研究結(jié)果顯示異甘草素能夠激活PPAR-γ，降低MMP-2 和MMP-9 的表達(dá)，從而增加AS 斑塊穩(wěn)定性。

綜上，異甘草素能夠通過激活PPAR-γ，上調(diào)LXR-α，減少FABP-4 表達(dá)，降低血脂和ox-LDL 水平，減少斑塊不穩(wěn)定性相關(guān)蛋白MMP-2 和MMP-9的表達(dá)，降低斑塊易損指數(shù)，從而發(fā)揮抗AS 的作用。

前期的動物實驗，分子對接和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)綜合說明異甘草素具有PPAR-γ 激動作用，并能起到抗AS 的作用。動物實驗主要目的是進一步驗證異甘草素的抗AS 的藥效作用，并探討其作用機制。深入的機制探討將在后面的細(xì)胞實驗中開展，進一步明確異甘草素是通過激活PPAR-γ 發(fā)揮抗AS 的作用機制。

作者貢獻度說明：

聶波：實驗設(shè)計、指導(dǎo)及論文校審；許心蕊：指標(biāo)檢測、數(shù)據(jù)分析、論文撰寫；高照：實驗造模、藥物干預(yù)；孫浩：病理指標(biāo)檢測；張晴玥、馮露、楊漫芳、李洋、王添鈺：實驗取材及指標(biāo)檢測；吳愛明、婁利霞：病理實驗及Western Blot 實驗技術(shù)指導(dǎo)。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。