賴巧玲 謝婷 黃焱

福建醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)與工程學(xué)院眼視光學(xué)系,福州 350004

謝婷現(xiàn)在福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院,福州 350004

對(duì)于長(zhǎng)期血糖控制欠佳的糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy,DR)患者,即使后期嚴(yán)格控制血糖,既往高血糖對(duì)視網(wǎng)膜的損傷仍可持續(xù)進(jìn)展,即存在代謝記憶現(xiàn)象[1]?？梢姼哐羌捌浯x產(chǎn)物所致的代謝記憶現(xiàn)象可繼續(xù)損傷視網(wǎng)膜并抑制其自我修復(fù)能力,這可能是DR持續(xù)進(jìn)展的原因之一。核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor-E2-related factor 2,Nrf2)及其靶基因血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)、醌氧化還原酶1(NAD(P)H dehydrogenase[quinone]1,NQO1)是體內(nèi)強(qiáng)抗氧化因子[2]。研究發(fā)現(xiàn),DR發(fā)展過程中隨著高血糖及其代謝產(chǎn)物的刺激可能會(huì)破壞Nrf2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能,而保護(hù)Nrf2可恢復(fù)并改善視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的正常生理功能[3-5]。另有研究發(fā)現(xiàn),Nrf2是微小RNA-27b-3p(microRNA-27b-3p,miR-27b-3p)的下游靶基因[6],后者不僅與DR的發(fā)生和發(fā)展相關(guān),還參與糖脂代謝、調(diào)節(jié)葡萄糖耐量及胰島素敏感性[7-9]。在糖尿病小鼠模型中發(fā)現(xiàn)利拉魯肽可促進(jìn)Nrf2及下游靶基因表達(dá)增加,可能對(duì)Nrf2起到激活和保護(hù)作用[10]。因此,推測(cè)利拉魯肽可能通過調(diào)節(jié)miR-27b-3p/Nrf2減輕代謝記憶損傷。本研究擬探討miR-27b-3p/Nrf2對(duì)人RPE細(xì)胞代謝記憶損傷的影響及其調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞來源 人RPE細(xì)胞系A(chǔ)RPE-19購(gòu)自上海翼和應(yīng)用生物技術(shù)有限公司。

1.1.2主要試劑及儀器 青-鏈霉素(美國(guó)HyClone公司);DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司);蛋白Marker(美國(guó)Thermo公司);胎牛血清、0.25%胰蛋白酶(德國(guó)PAN公司);D-葡萄糖、BSA粉劑(美國(guó)Sigma公司);Bluge-LooPTMmiRNA qRT-PCR Starter Kit、miR-27b-3p/U6引物(廣東銳博生物科技有限公司);TB GreenTMPremix Ex TaqTM、PrimeScriPtTMRT Reagent Kit with gDNA(日本TaKaRa公司);Nrf2、NQO1、HO-1、β-actin PCR擴(kuò)增引物,兔抗人β-actin多克隆抗體(上海生工生物工程股份有限公司);慢病毒載體miR-27b-3p抑制劑(上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司);RIPA蛋白裂解液、Trizol細(xì)胞裂解液、SDS-PAGE凝膠試劑盒、脫脂奶粉、HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗(EM-35111-01)、HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗(EM-35110-02)(北京依瑪博科技有限公司);核蛋白提取試劑盒、抗熒光衰減封片劑(含DAPI)(北京索萊寶科技有限公司);超強(qiáng)顯色液(美國(guó)Genview公司);PVDF膜(美國(guó)Merck公司);兔抗人Nrf2單克隆抗體(ab62352)、兔抗人NQO1多克隆抗體(ab80588)、兔抗人HO-1多克隆抗體(ab13243)、Alexa fluor標(biāo)記羊抗兔多克隆抗體IgG(ab150083)(英國(guó)Abcam公司);鼠抗人H3多克隆抗體(100005-MM01,北京義翹神州科技股份有限公司);細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8(cell counting kit-8,CCK-8)(上海碧云天生物科技有限公司);二氫乙錠(dihydroethidium,DHE)/PD-MY 003(美國(guó)MCE生物科技有限公司);利拉魯肽(大連美侖生物技術(shù)有限公司)。7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司);凝膠成像儀(美國(guó)Bio-Rad公司);熒光顯微鏡(BX53,日本Olympus公司);多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及分組處理 將ARPE-19細(xì)胞株置于含有10%胎牛血清、100 IU/ml(商品單位)青霉素和100 μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng),待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞,加入培養(yǎng)基制備細(xì)胞懸液并接種于培養(yǎng)板中,將細(xì)胞置于5.5 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)6 d作為正常對(duì)照組;于30 mmol/L高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d后,換成5.5 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)3 d作為代謝記憶組;經(jīng)慢病毒miR-27b-3p抑制劑轉(zhuǎn)染成功,將其置于30 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d后換成5.5 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)3 d作為miR-27b-3p抑制劑組;細(xì)胞于30 mmol/L高糖+利拉魯肽培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d后換成5.5 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)3 d作為利拉魯肽組。

1.2.2CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增生率 調(diào)整細(xì)胞密度為2×104個(gè)/ml,按每孔200 μl置于96孔板中,每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,加入過濾除菌后的D-葡萄糖溶液,調(diào)整培養(yǎng)基糖濃度為5.5、25、30、35、40 mmol/L,并設(shè)置無細(xì)胞培養(yǎng)基作為空白組,培養(yǎng)3 d后加入CCK-8試劑10 μl/孔繼續(xù)孵育2 h,采用多功能酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處讀取吸光度(absorbance,A)值,以細(xì)胞增生率降至接近正常對(duì)照組一半的糖濃度為最適高糖濃度。此外,將細(xì)胞分為正常對(duì)照組、代謝記憶組和利拉魯肽組(10、20、30 nmol/L),即細(xì)胞分別置于培養(yǎng)基糖濃度為5.5 mmol/L、30 mmol/L和30 mmol/L+不同濃度利拉魯肽中培養(yǎng)3 d,細(xì)胞活力檢測(cè)操作步驟同上,選取細(xì)胞活力最佳組為最適利拉魯肽給藥濃度。隨后將細(xì)胞分為正常對(duì)照組、代謝記憶組、利拉魯肽組(20 nmol/L)于96孔板中培養(yǎng),6 d后根據(jù)上述步驟檢測(cè)A值并計(jì)算各組細(xì)胞增生率。細(xì)胞增生率=(A檢測(cè)組-A空白組)/(A對(duì)照組-A空白組)。

1.2.3慢病毒miR-27b-3p轉(zhuǎn)染細(xì)胞 構(gòu)建含有嘌呤霉素抗性基因的慢病毒載體miR-27b-3p抑制劑(1×108TU/ml),取原液10 μl加入90 μl培養(yǎng)基配成稀釋液,ARPE-19常規(guī)培養(yǎng)并以4×104個(gè)/ml細(xì)胞懸液100 μl接種于96孔板,8 h后加入慢病毒稀釋液4、8、12、16 μl及HitransG P增強(qiáng)劑,使感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection,MOI),即感染時(shí)病毒與細(xì)胞數(shù)量的比值梯度達(dá)到10、20、30、40,轉(zhuǎn)染96 h,綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)表達(dá)豐度較高時(shí)用熒光顯微鏡觀察,轉(zhuǎn)染效率為80%左右且細(xì)胞生長(zhǎng)良好組所對(duì)應(yīng)的最適MOI和轉(zhuǎn)染條件即為后續(xù)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。配制嘌呤霉素,使終質(zhì)量濃度為1 μg/ml。將細(xì)胞分為正常對(duì)照組、miR-27b-3p對(duì)照組和miR-27b-3p抑制劑組,調(diào)整細(xì)胞密度為5×105個(gè)/ml接種于培養(yǎng)瓶中,轉(zhuǎn)染72 h后慢病毒轉(zhuǎn)染效率達(dá)80%且細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好,加入嘌呤霉素,篩選轉(zhuǎn)染成功、含抗性基因的細(xì)胞,未被轉(zhuǎn)染細(xì)胞大量破裂死亡,繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞傳代。將轉(zhuǎn)染細(xì)胞誘導(dǎo)為代謝記憶空載病毒模型、代謝記憶病毒模型,并設(shè)置正常對(duì)照組、代謝記憶組進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miR-27b-3p、Nrf2、NQO1、HO-1 mRNA水平 調(diào)整細(xì)胞密度為3×105個(gè)/孔并置于6孔板中分組處理培養(yǎng)6 d,收集各組細(xì)胞后使用Trizol提取RNA,引物序列見表1。參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA,采用TB GreenTM Premix Ex TaqTM實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)Nrf2、NQO1、HO-1 mRNA水平,以β-actin為內(nèi)對(duì)照,反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃變性5 s,60 ℃退火/延伸34 s,40個(gè)循環(huán)。根據(jù)Bluge-LoopTMmiRNA qRT-PCR試劑盒說明書進(jìn)行miRNA逆轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè),以U6為內(nèi)源性對(duì)照,反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性10 min;95 ℃變性2 s,60 ℃退火/延伸30 s,40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算各目的基因相對(duì)表達(dá)量。

表1 逆轉(zhuǎn)錄PCR引物序列Table 1 Primer sequences of reverse transcription PCR引物名稱引物序列Nrf2正向:5'-ATCAACTACCCGTTCGAGAAG-3'反向:5'-ACTTGGTCATGTCGATTCATA-3'NQO1正向:5'-AGTATCCTGCCGAGTCTGTTCTGG-3'反向:5'-AATATCACAAGGTCTGCGGCTTCC-3'HO-1正向:5'-CCTCCCTGTACCACATCTATGT-3'反向:5'-GCTCTTCTGGGAAGTAGACAG-3'β-actin正向:5'-CTCGCCTTTGCCGATCC-3'反向:5'-GAATCCTTCTGACCCATGCC-3'miR-27b-3p正向:5'-GCGCGTTCACAGTGGCTAAG-3'反向:5'-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3'U6正向:5'-AGAGAAGATTAGCATGGCCCCTG-3'反向:5'-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3' 注:PCR:聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng);Nrf:核因子E2相關(guān)因子;NQO:醌氧化還原酶;HO:血紅素加氧酶;β-actin:β-肌動(dòng)蛋白;miR:微小RNA Note:PCR:polymerase chain reaction;Nrf:nuclear factor-E2-related fac-tor;NQO:NAD(P)H ehydrogenase[quinone];HO:heme oxygenase;miR:microRNA

1.2.5Western blot法檢測(cè)Nrf2核蛋白和總蛋白表達(dá)水平 調(diào)整細(xì)胞密度為5×105個(gè)/孔,置于培養(yǎng)皿中分組培養(yǎng)6 d,收集各組細(xì)胞并在預(yù)冷RIPA裂解液和核蛋白試劑盒中分別提取總蛋白和核蛋白并配置成5倍蛋白上樣緩沖液。取等蛋白量緩沖液在SDS-PAGE中電泳并轉(zhuǎn)印至PVDF膜上,經(jīng)脫脂牛奶封閉后與Nrf2、H3和β-actin抗體(均1∶1 000稀釋)稀釋液在4 ℃下孵育過夜,充分漂洗后加入二抗(1∶1 000)在室溫下孵育2 h,加入ECL混合液,暗室曝光、顯影。β-actin和H3蛋白水平分別作為總蛋白及核蛋白的內(nèi)參。采用ImageJ軟件分析各目的條帶的灰度值。

1.2.6細(xì)胞免疫熒光染色檢測(cè)Nrf2、NQO1和HO-1蛋白表達(dá)水平 調(diào)整細(xì)胞密度為3×104個(gè)/孔,在專用爬片培養(yǎng)6 d,收集爬片后加入4%多聚甲醛固定15 min,用1% Triton X-100破膜15 min,加入5%牛血清白蛋白封閉1 h,加入Nrf2、NQO1和HO-1抗體(1∶500)稀釋液,4 ℃孵育過夜,充分漂洗后在室溫下加入熒光二抗(1∶500)避光孵育2 h。置于載玻片上,將熒光猝滅劑覆蓋表面,暗室中于正置熒光顯微鏡下觀察并拍照,每片不少于6個(gè)視野(200倍),采用ImageJ軟件分析目的蛋白熒光強(qiáng)度。

1.2.7DHE檢測(cè)細(xì)胞活性氧含量 將細(xì)胞以4×104個(gè)/孔接種于12孔板中分組培養(yǎng)6 d后去除培養(yǎng)基,磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution,PBS)洗滌3次,將配制好的2 μmol/L DHE反應(yīng)液1 ml加入細(xì)胞中,繼續(xù)培養(yǎng)30 min后PBS洗滌3次,在倒置熒光顯微鏡下任意選取6個(gè)視野(100倍),采用ImageJ分析活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)熒光強(qiáng)度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 糖濃度及藥物濃度篩選

CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示,正常對(duì)照組和25、30、35、40 mmol/L高糖組的細(xì)胞增生率分別為1.000±0.000、0.832±0.040、0.582±0.042、0.548±0.048、0.444±0.031,組間總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=115.611,P<0.001),其中25、30、35、40 mmol/L高糖組細(xì)胞增生率均低于正常對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.001);葡萄糖濃度為30 mmol/L時(shí)細(xì)胞增生率明顯下降,選擇最低有效葡萄糖濃度30 mmol/L進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)(圖1A)。正常對(duì)照組、高糖組和利拉魯肽10、20、30 nmol/L組細(xì)胞增生率分別為1.000±0.000、0.480±0.030、0.445±0.021、0.621±0.023、0.562±0.025,組間總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=303.883,P<0.001),其中高糖組細(xì)胞增生率低于利拉魯肽20 nmol/L、30 nmol/L組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.001);利拉魯肽20 nmol/L組細(xì)胞增生率最高,因此選擇利拉魯肽20 nmol/L為最佳濃度(圖1B)。

圖1 不同葡萄糖和利拉魯肽濃度干預(yù)下人RPE細(xì)胞增生率的比較 A:不同葡萄糖濃度干預(yù)下人RPE細(xì)胞增生率比較 F=115.611,P<0.001.與正常對(duì)照組比較,aP<0.001(單因素方差分析,LSD-t檢驗(yàn),n=3) 1:正常對(duì)照組;2:25 mmol/L高糖組;3:30 mmol/L高糖組;4:35 mmol/L高糖組;5:40 mmol/L高糖組 B:不同利拉魯肽濃度干預(yù)高糖誘導(dǎo)的人RPE細(xì)胞增生率比較 F=303.883,P<0.001.與高糖組比較,aP<0.001(單因素方差分析,LSD-t檢驗(yàn),n=3) 1:正常對(duì)照組;2:高糖組;3:利拉魯肽10 mmol/L組;4:利拉魯肽20 mmol/L組;5:利拉魯肽30 mmol/L組Figure 1 Comparison of human RPE cell proliferation rate treated with different glucose and liraglutide concentrations A:Comparison of human RPE cell proliferation rate treated with different glucose concentrations F=115.611,P<0.001.Compared with normal control group,aP<0.001 (One-way ANOVA,LSD-t test,n=3) 1:normal control group;2:25 mmol/L high glucose group;3:30 mmol/L high glucose group;4:35 mmol/L high glucose group;5:40 mmol/L high glucose group B:Comparison of human RPE cell proliferation rate induced by high glucose with different liraglutide concentrations F=303.883,P<0.001.Compared with high glucose group,aP<0.001 (One-way ANOVA,LSD-t test,n=3) 1:normal control group;2:high glucose group;3:Liraglutide 10 mmol/L group;4:Liraglutide 20 mmol/L group;5:Liraglutide 30 mmol/L group

2.2 慢病毒轉(zhuǎn)染條件篩選

在熒光顯微鏡下觀察GFP綠色熒光表達(dá)的細(xì)胞,轉(zhuǎn)染條件為miR-27b-3p對(duì)照組MOI=40、miR-27b-3p抑制劑組MOI=30時(shí)熒光最強(qiáng),此為最佳轉(zhuǎn)染條件(圖2A)。miR-27b-3p抑制劑組慢病毒載體包含嘌呤霉素抗性基因,慢病毒轉(zhuǎn)染72 h加入1.0 μg/ml嘌呤霉素繼續(xù)培養(yǎng)至96 h,篩選已轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞,GFP表達(dá)效率超過80%(圖2B)。

圖2 慢病毒miR-27b-3p轉(zhuǎn)染細(xì)胞熒光圖(×200,標(biāo)尺=50 μm) A:MOI:10、20、30、40條件下人RPE細(xì)胞轉(zhuǎn)染慢病毒miR-27b-3p抑制劑和miR-27b-3p對(duì)照組的明場(chǎng)和GFP綠色熒光圖 B:人RPE細(xì)胞轉(zhuǎn)染慢病毒miR-27b-3p抑制劑和miR-27b-3p對(duì)照組48、72、96 h后的明場(chǎng)和GFP綠色熒光圖 MOI:感染復(fù)數(shù);miR:微小RNA;GFP:綠色熒光蛋白Figure 2 Cell fluorescence images of miR-27b-3p lentivirus transfection (×200,bar=50 μm) A:Bright field and GFP green fluorescence images of human RPE cells transfected with miR-27b-3p-inhibitor and miR-27b-3p-control lentivirus in MOI (10,20,30,40) B:Bright field and GFP green fluorescence images of human RPE cells transfected with miR-27b-3p-inhibitor and miR-27b-3p-control lentivirus at 48,72,and 96 hours after transfection MOI:multiplicity of infection;miR:microRNA;GFP:green fluorescent protein

2.3 轉(zhuǎn)染后各組miR-27b-3p、Nrf2、NQO1、HO-1 mRNA和蛋白表達(dá)量比較

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,正常對(duì)照組、代謝記憶組、miR-27b-3p對(duì)照組、miR-27b-3p抑制劑組miR-27b-3p、Nrf2、NQO1、HO-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量組間總體比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=850.815、329.653、876.195、439.192,均P<0.001),其中代謝記憶組miR-27b-3p mRNA相對(duì)表達(dá)量高于正常對(duì)照組,Nrf2、NQO1、HO-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量均低于正常對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01);miR-27b-3p抑制劑組miR-27b-3p mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯低于miR-27b-3p對(duì)照組,Nrf2、NQO1、HO-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于miR-27b-3p對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)(表2)。

表2 各組細(xì)胞miR-27b-3p、Nrf2、NQO1、HO-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較(x±s)Table 2 Comparison of miR-27b-3p,Nrf2,NQO1,and HO-1 mRNA relative expressions among different groups (x±s)組別樣本量miR-27b-3pNrf2NQO1HO-1正常對(duì)照組31.000±0.0001.000±0.0001.000±0.0001.000±0.000代謝記憶組31.881±0.034a0.432±0.032a0.420±0.024a0.409±0.056amiR-27b-3p對(duì)照組31.683±0.0880.401±0.0440.497±0.0530.386±0.046miR-27b-3p抑制劑組30.111±0.008b1.576±0.091b1.575±0.023b1.427±0.041bF值850.815329.653876.195439.192P值<0.001<0.001<0.001<0.001 注:與正常對(duì)照組相比,aP<0.01;與miR-27b-3p對(duì)照組相比,bP<0.01(單因素方差分析,Dunnett-T3檢驗(yàn)及LSD-t檢驗(yàn)) miR:微小RNA;Nrf:核因子E2相關(guān)因子;NQO:醌氧化還原酶;HO:血紅素加氧酶 Note:Compared with normal control group,aP<0.01;compared with miR-27b-3p control group,bP<0.01 (One-way ANOVA,Dunnett-T3 test and LSD-t test) miR:microRNA;Nrf:nuclear factor-E2-related factor;NQO:NAD(P)H dehydrogenase[quinone];HO:heme oxygenase

代謝記憶組Nrf2總蛋白、核蛋白表達(dá)條帶均較正常對(duì)照組減弱,miR-27b-3p抑制劑組各條帶較miR-27b-3p對(duì)照組明顯增強(qiáng)(圖3)。正常對(duì)照組、代謝記憶組、miR-27b-3p對(duì)照組、miR-27b-3p抑制劑組Nrf2總蛋白、核蛋白相對(duì)表達(dá)水平總體比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=86 757.666、11 504.213,均P<0.001),其中代謝記憶組Nrf2總蛋白、核蛋白相對(duì)表達(dá)水平較正常對(duì)照組下降,miR-27b-3p抑制劑組較miR-27b-3p對(duì)照組明顯上升,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)(表3)。

圖3 Western blot檢測(cè)總蛋白及核蛋白Nrf2蛋白電泳圖 1:正常對(duì)照組;2:代謝記憶組;3:miR-27b-3p對(duì)照組;4:miR-27b-3p抑制劑 Nrf:核因子E2相關(guān)因子;H3:組蛋白3Figure 3 Electrophoretogram of total and nuclear Nrf2 protein expressions by Western blot 1:normal control group;2:metabolic memory group;3:miR-27b-3p control group;4:miR-27b-3p inhibitor group Nrf:nuclear factor-E2-related factor;H3:histone 3

表3 各組細(xì)胞Nrf2總蛋白和核蛋白相對(duì)表達(dá)量比較(x±s)Table 3 Comparison of relative expressions of total and nuclear Nrf2 protein among different groups (x±s)組別樣本量總蛋白Nrf2核蛋白Nrf2正常對(duì)照組31.000±0.0001.000±0.000代謝記憶組30.175±0.001a0.538±0.003amiR-27b-3p對(duì)照組30.237±0.0020.690±0.008miR-27b-3p抑制劑組31.266±0.006b2.990±0.036bF值86 757.66611 504.213P值<0.001<0.001 注:與正常對(duì)照組相比,aP<0.01;與miR-27b-3p對(duì)照組相比,bP<0.01(單因素方差分析,Dunnett-T3檢驗(yàn)) Nrf:核因子E2相關(guān)因子;miR:微小RNA Note:Compared with normal control group,aP<0.01;compared with miR-27b-3p control group,bP<0.01 (One-way ANOVA,Dunnett-T3 test) Nrf:nuclear factor-E2-related factor;miR:microRNA

細(xì)胞免疫熒光圖顯示Nrf2、NQO1、HO-1在細(xì)胞核細(xì)胞質(zhì)均可見表達(dá),相較正常對(duì)照組及miR-27b-3p抑制劑組,代謝記憶組Nrf2、NQO1、HO-1細(xì)胞免疫熒光強(qiáng)度均明顯減弱(圖4)。正常對(duì)照組、代謝記憶組、miR-27b-3p對(duì)照組、miR-27b-3p抑制劑組Nrf2、NQO1、HO-1細(xì)胞免疫熒光強(qiáng)度總體比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=464.178、83.959、37.831,均P<0.001),其中代謝記憶組Nrf2、NQO1、HO-1熒光強(qiáng)度均低于正常對(duì)照組,miR-27b-3p抑制劑組Nrf2、NQO1、HO-1熒光強(qiáng)度均高于miR-27b-3p對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)(表4)。

圖4 各組細(xì)胞Nrf2、NQO1、HO-1免疫熒光圖(×200,標(biāo)尺=50 μm) 相較正常對(duì)照組及miR-27b-3p抑制劑組,代謝記憶組Nrf2、NQO1、HO-1細(xì)胞免疫熒光強(qiáng)度均明顯減弱 Nrf2、NQO1、HO-1表達(dá)于胞核胞質(zhì)中,呈紅色熒光;細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光(含DAPI) A:Nrf2 B:NQO1 C:HO-1 1:正常對(duì)照組 2:代謝記憶組;3:miR-27b-3p對(duì)照組;4:miR-27b-3p抑制劑組 Nrf:核因子E2相關(guān)因子;NQO:醌氧化還原酶;HO:血紅素加氧酶Figure 4 Cellular immunofluorescence pictures of Nrf2,NQO1,and HO-1 in different groups (×200,bar=50 μm) Compared with normal control group and miR-27b-3p inhibitor group,the immunofluorescence intensity of Nrf2,NQO1 and HO-1 in metabolic memory group was significantly decreased.Nrf2,NQO1,and HO-1 were expressed in cytoplasm and nuclei,showing red fluorescence.The nuclei showed blue fluorescence (containing DAPI) A:Nrf2 B:NQO1 C:HO-1 1:normal control group 2:metabolic memory group 3:miR-27b-3p control group 4:miR-27b-3p inhibitor group Nrf:nuclear factor-E2-related factor;NQO:NAD(P)H dehydrogenase[quinone];HO:heme oxygenase

表4 各組Nrf2、NQO1、HO-1細(xì)胞免疫熒光強(qiáng)度比較(x±s)Table 4 Comparison of Nrf2,NQO1,and HO-1 cellular immunofluorescence intensity among different groups (x±s)組別樣本量Nrf2NQO1HO-1正常對(duì)照組31.000±0.0001.000±0.0001.000±0.000代謝記憶組30.796±0.033a0.735±0.080a0.765±0.058amiR-27b-3p對(duì)照組30.686±0.0790.721±0.1020.849±0.056miR-27b-3p抑制劑組31.622±0.042b1.261±0.043b1.028±0.055bF值464.17883.95937.831P值<0.001<0.001<0.001 注:與正常對(duì)照組相比,aP<0.01;與miR-27b-3p對(duì)照組相比,bP<0.01(單因素方差分析,Dunnett-T3檢驗(yàn)) Nrf:核因子E2相關(guān)因子;NQO:醌氧化還原酶;HO:血紅素加氧酶;miR:微小RNA Note:Compared with normal control group,aP<0.01;compared with miR-27b-3p control group,bP<0.01 (One-way ANOVA,Dunnett-T3 test) Nrf:nuclear factor-E2-related fac-tor;NQO:NAD(P)H dehydrogenase[quinone];HO:heme oxygenase;miR:microRNA

2.4 利拉魯肽干預(yù)后各組miR-27b-3p、Nrf2、NQO1、HO-1 mRNA及蛋白表達(dá)量比較

利拉魯肽干預(yù)后正常對(duì)照組、代謝記憶組、利拉魯肽組miR-27b-3p、Nrf2、NQO1、HO-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量總體比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=300.050、657.987、33.092、500.841,均P<0.001),其中代謝記憶組miR-27b-3p相對(duì)表達(dá)量高于正常對(duì)照組,Nrf2、NQO1、HO-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量低于正常對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05);利拉魯肽組miR-27b-3p相對(duì)表達(dá)量低于代謝記憶組,Nrf2、NQO1、HO-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量高于代謝記憶組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)(表5)。

表5 利拉魯肽干預(yù)后各組細(xì)胞miR-27b-3p、Nrf2、NQO1、HO-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較(x±s)Table 5 Comparison of miR-27b-3p、Nrf2,NQO1,and HO-1 mRNA relative expressions in liraglutide-treated cells among different groups (x±s)組別樣本量miR-27b-3pNrf2NQO1HO-1正常對(duì)照組31.000±0.0001.000±0.0001.000±0.0001.000±0.000代謝記憶組31.747±0.105a0.287±0.047a0.568±0.047a0.389±0.064a利拉魯肽組30.489±0.033b1.142±0.026b0.991±0.120b1.435±0.030bF值300.050657.98733.092500.841P值<0.001<0.0010.038<0.001 注:與正常對(duì)照組相比,aP<0.05;與代謝記憶組相比,bP<0.05(單因素方差分析,LSD-t檢驗(yàn)及Dunnett-T3檢驗(yàn)) miR:微小RNA;Nrf:核因子E2相關(guān)因子;NQO:醌氧化還原酶;HO:血紅素加氧酶 Note:Compared with normal control group,aP<0.05;compared with metabolic memory group,bP<0.01 (One-way ANOVA,LSD-t test and Dunnett-T3 test) miR:microRNA;Nrf:nuclear factor-E2-related factor;NQO:NAD(P)H dehydrogenase[quinone];HO:heme oxygenase

與正常對(duì)照組相比,代謝記憶組Nrf2總蛋白、核蛋白條帶較弱,利拉魯肽組Nrf2總蛋白、核蛋白條帶明顯增強(qiáng)(圖5)。正常對(duì)照組、代謝記憶組、利拉魯肽組Nrf2總蛋白、核蛋白相對(duì)表達(dá)量總體比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=12 391.714、458.465,均P<0.001),其中代謝記憶組Nrf2總蛋白、核蛋白相對(duì)表達(dá)量均低于正常對(duì)照組,利拉魯肽組Nrf2總蛋白、核蛋白相對(duì)表達(dá)量均較代謝記憶組升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)(表6)。

圖5 利拉魯肽干預(yù)后各組總蛋白及核蛋白Nrf2蛋白電泳圖 1:正常對(duì)照組;2:代謝記憶組;3:利拉魯肽組 β-actin:β-肌動(dòng)蛋白;Nrf:核因子E2相關(guān)因子;H3:組蛋白3Figure 5 Electrophoretogram of total and nuclear Nrf2 protein expressions after liraglutide treatment 1:normal control group;2:metabolic memory group;3:liraglutide group Nrf:nuclear factor-E2-related factor;H3:histone 3

表6 利拉魯肽干預(yù)后各組細(xì)胞Nrf2總蛋白和核蛋白相對(duì)表達(dá)量比較(x±s)Table 6 Comparison of total and nuclear Nrf2 proteinexpressions after liraglutide treatment among differentgroups (x±s)組別樣本量總蛋白Nrf2核蛋白Nrf2正常對(duì)照組31.000±0.0001.000±0.000代謝記憶組30.247±0.009a0.732±0.028a利拉魯肽組31.156±0.010b1.625±0.058bF值12 391.714458.465P值<0.001<0.001 注:與正常對(duì)照組相比,aP<0.01;與代謝記憶組相比,bP<0.01(單因素方差分析,LSD-t檢驗(yàn)及Dunnett-T3檢驗(yàn)) Nrf:核因子E2相關(guān)因子 Note:Compared with normal control group,aP<0.01;compared with meta-bolic memory group,bP<0.01 (One-way ANOVA,LSD-t test and Dunnett-T3 test) Nrf:nuclear factor-E2-related factor

細(xì)胞免疫熒光染色可見,Nrf2、NQO1、HO-1在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)中均有表達(dá),與正常對(duì)照組相比,代謝記憶組Nrf2、NQO1、HO-1熒光均減弱,代謝記憶組熒光均明顯增強(qiáng)(圖6)。正常對(duì)照組、代謝記憶組、利拉魯肽組Nrf2、NQO1、HO-1熒光強(qiáng)度總體比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=10.392、44.351、47.217,均P<0.01),其中代謝記憶組Nrf2、NQO1、HO-1熒光強(qiáng)度均低于正常對(duì)照組,利拉魯肽組熒光強(qiáng)度均高于代謝記憶組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)(表7)。

圖6 利拉魯肽干預(yù)后各組Nrf2、NQO1、HO-1免疫熒光圖(×200,標(biāo)尺=50 μm) 與正常對(duì)照組相比,代謝記憶組Nrf2、NQO1、HO-1熒光均減弱,利拉魯肽組熒光均明顯增強(qiáng) Nrf2、NQO1、HO-1表達(dá)于細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)中,呈紅色熒光;細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光(含DAPI) A:Nrf2 B:NQO1 C:HO-1 1:正常對(duì)照組;2:代謝記憶組;3:利拉魯肽組 Nrf:核因子E2相關(guān)因子;NQO:醌氧化還原酶;HO:血紅素加氧酶Figure 6 Nrf2,NQO1,and HO-1 immunofluorescence images of liraglutide-treated cells (×200,bar=50 μm) Compared with the normal control group,the fluorescence of Nrf2,NQO1 and HO-1 in metabolic memory group was decreased,and the fluorescence of the liraglutide group was significantly enhanced.Nrf2,NQO1,and HO-1 were expressed in cytoplasm and nuclei,showing red fluorescence.The nuclei showed blue fluorescence (containing DAPI) A:Nrf2 B:NQO1 C:HO-1 1:normal control group;2:metabolic memory group;3:liraglutide group Nrf:nuclear factor-E2-related factor;NQO:NAD(P)H dehydrogenase[quinone];HO:heme oxygenase

2.5 利拉魯肽干預(yù)后各組細(xì)胞增生率及ROS含量比較

CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示,正常對(duì)照組、代謝記憶組、利拉魯肽組細(xì)胞增生率總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=73.209,P<0.001),其中與正常對(duì)照組相比,代謝記憶組細(xì)胞增生率下降,利拉魯肽組細(xì)胞增生率高于代謝記憶組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(表8)。DHE檢測(cè)結(jié)果顯示,代謝記憶組ROS熒光強(qiáng)度較正常對(duì)照組及利拉魯肽組增強(qiáng)(圖7)。正常對(duì)照組、代謝記憶組、利拉魯肽組ROS熒光強(qiáng)度總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=739.668,P<0.001),其中代謝記憶組ROS相對(duì)含量高于正常對(duì)照組和利拉魯肽組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)(表8)。

表8 利拉魯肽干預(yù)后各組細(xì)胞增生率及ROS相對(duì)含量比較(x±s)Table 8 Comparison of proliferation rate and ROS contentof liraglutide-treated cells among different groups (x±s)組別樣本量細(xì)胞增生率ROS相對(duì)含量正常對(duì)照組31.000±0.0001.000±0.000代謝記憶組30.786±0.021a4.182±0.132a利拉魯肽組30.842±0.026b3.723±0.224bF值73.209739.668P值<0.001<0.001 注:與正常對(duì)照組相比,aP<0.01;與代謝記憶組相比,bP<0.01(單因素方差分析,LSD-t檢驗(yàn)及Dunnett-T3檢驗(yàn)) ROS:活性氧 Note:Compared with normal control group, aP<0.01;compared with meta-bolic memory group,bP<0.01 (One-way ANOVA,LSD-t test and Dunnett-T3 test) ROS:reactive oxygen species

圖7 利拉魯肽干預(yù)后各組細(xì)胞ROS熒光圖(×100,標(biāo)尺=100 μm) 代謝記憶組ROS熒光強(qiáng)度較正常對(duì)照組及利拉魯肽組增強(qiáng) A:正常對(duì)照組 B:代謝記憶組 C:利拉魯肽組Figure 7 ROS fluorescence images of liraglutide-treated cells (×100,bar=100 μm) The fluorescence intensity of ROS was stronger in metabolic memory group than in normal control group and liraglutide group A:Normal control group B:Metabolic memory group C:Liraglutide group

3 討論

代謝記憶是高血糖的延續(xù)性損傷現(xiàn)象,參與氧化應(yīng)激、糖代謝異常等病理過程[11-12]。本研究發(fā)現(xiàn)代謝記憶引起人RPE細(xì)胞中ROS大量堆積,ROS是氧自由基的主要成分之一。大量研究已證實(shí)氧自由基可引起氧化應(yīng)激損傷,抑制細(xì)胞的正常代謝功能及活性,其機(jī)制涉及Nrf2、NF-κB、GLP1R、PI3K/AKT等相關(guān)通路,其中Nrf2是體內(nèi)強(qiáng)抗氧化因子,可激活HO-1、NQO1、GCLC等相關(guān)抗氧化靶基因,降低細(xì)胞中ROS水平,清除代謝產(chǎn)物[13-16]。本研究發(fā)現(xiàn)人RPE細(xì)胞在去除高糖后,Nrf2表達(dá)仍受到抑制,對(duì)下游靶基因激活作用減弱。Bollong等[17]研究發(fā)現(xiàn),Nrf2在細(xì)胞質(zhì)中主要與Keap1結(jié)合失活,受到內(nèi)外源刺激后立即與Keap1解離,并轉(zhuǎn)入胞核內(nèi)激活下游靶基因,完成信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。本研究證實(shí)Nrf2在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)中均有表達(dá),代謝記憶可抑制總蛋白及核蛋白Nrf2表達(dá)水平。細(xì)胞形成代謝記憶后,細(xì)胞核內(nèi)Nrf2含量減少,對(duì)HO-1和NQO1的激活作用也相應(yīng)減弱。HO-1是清除氧自由基的主要酶之一,NQO1主要清除外源性代謝產(chǎn)物,當(dāng)HO-1和NQO1表達(dá)水平不足以清除ROS及糖代謝產(chǎn)物時(shí),將引起氧化應(yīng)激反應(yīng),RPE細(xì)胞的代謝功能也隨之減弱。

在長(zhǎng)期高血糖狀態(tài)下,糖與蛋白質(zhì)或脂質(zhì)結(jié)合產(chǎn)生難以降解的代謝產(chǎn)物,刺激細(xì)胞釋放氧自由基,形成代謝記憶后仍繼續(xù)促進(jìn)糖代謝產(chǎn)物堆積,導(dǎo)致細(xì)胞持續(xù)性氧化損傷,影響細(xì)胞代謝功能[18-20]。因此,在代謝記憶形成過程中,促進(jìn)Nrf2表達(dá)并維持活性狀態(tài)可能有利于清除代謝產(chǎn)物、對(duì)抗代謝記憶損傷。本實(shí)驗(yàn)評(píng)估了代謝記憶對(duì)miR-27b-3p的作用,結(jié)果證明miR-27b-3p與Nrf2呈現(xiàn)相反趨勢(shì),可見miR-27b-3p極有可能通過調(diào)節(jié)Nrf2參與代謝記憶形成。通過慢病毒轉(zhuǎn)染抑制miR-27b-3p表達(dá),結(jié)果驗(yàn)證了在人RPE細(xì)胞中Nrf2是miR-27b-3p的下游靶基因之一。在此基礎(chǔ)上,本研究發(fā)現(xiàn)抑制miR-27b-3p不僅解除了代謝記憶對(duì)細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)中Nrf2表達(dá)的抑制,也促進(jìn)了Nrf2對(duì)HO-1和NQO1的激活,一定程度上保護(hù)細(xì)胞免受代謝記憶損傷。

臨床隨訪病例顯示利拉魯肽可延緩DR進(jìn)展[21]。本研究發(fā)現(xiàn)采用利拉魯肽干預(yù)高糖誘導(dǎo)的RPE細(xì)胞,細(xì)胞活性有所恢復(fù),所釋放的ROS也相應(yīng)減少,可見利拉魯肽具有清除氧自由基,改善細(xì)胞增生活力的作用,因此,我們推測(cè)利拉魯肽具有抗氧化作用,其機(jī)制可能與miR-27b-3p/Nrf2途徑相關(guān)。本研究結(jié)果證實(shí)了這一假設(shè),利拉魯肽干預(yù)后細(xì)胞中miR-27b-3p表達(dá)受到抑制,對(duì)下游靶基因Nrf2的負(fù)性調(diào)節(jié)作用減弱,促進(jìn)細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)中Nrf2表達(dá),這可能與減少Nrf2與Keap1結(jié)合或促進(jìn)兩者解離相關(guān)[17]。利拉魯肽提高了細(xì)胞核中Nrf2含量,也相應(yīng)增強(qiáng)了對(duì)下游靶基因NQO1、HO-1的激活作用。隨著NQO1、HO-1表達(dá)增加,細(xì)胞清除高糖和代謝記憶所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物能力增強(qiáng),修復(fù)并改善細(xì)胞功能及活性,緩解了細(xì)胞的持續(xù)性氧化損傷。清除氧自由基還可保護(hù)RPE細(xì)胞的線粒體酶活性[22],因此利拉魯肽不僅具有降糖作用,還可通過miR-27b-3p/Nrf2途徑激活抗氧化通路,改善人RPE代謝功能,達(dá)到抑制代謝記憶形成的目的。

綜上所述,在人RPE細(xì)胞中Nrf2是miR-27b-3p的下游靶基因之一,代謝記憶對(duì)人RPE細(xì)胞的損傷可能與miR-27b-3p上調(diào)促進(jìn)了Nrf2失活或抑制其解離相關(guān)。而利拉魯肽可逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象,其抗氧化機(jī)制可通過抑制miR-27b-3p同時(shí)提高細(xì)胞核中Nrf2含量進(jìn)而逆轉(zhuǎn)細(xì)胞代謝記憶現(xiàn)象。因此,miR-27b-3p和Nrf2有可能成為DR的治療靶點(diǎn),本研究也為利拉魯肽的臨床治療提供理論基礎(chǔ)及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在任何利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明賴巧玲:醞釀和設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、實(shí)施研究、采集數(shù)據(jù)、統(tǒng)計(jì)分析、分析/解釋數(shù)據(jù)、起草文章;謝婷:實(shí)施研究、采集數(shù)據(jù)、統(tǒng)計(jì)分析;黃焱:指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)、文章審閱、修改及定稿