傅秋滿 李元君 盧穎 胡涂 尹葉薇 杜凱旋 孟書涵 張艷妮 趙立婷 文丹

作者單位：中南大學(xué)湘雅醫(yī)院眼科中心 眼科學(xué)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙 410008

日益增長(zhǎng)的近視發(fā)病率是全球性的公共衛(wèi)生問題[1]。近視尤其是高度近視可以導(dǎo)致黃斑變性、視網(wǎng)膜脫離、青光眼和白內(nèi)障等并發(fā)癥[2]，危害公共健康，造成社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)日益加重。因此探尋近視發(fā)生發(fā)展的相關(guān)機(jī)制成為目前研究的熱點(diǎn)[3-5]。研究發(fā)現(xiàn)在近視進(jìn)展過程中伴隨視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜厚度的下降及血流的減弱[6-9]。由此研究者們聚焦于近視脈絡(luò)膜、視網(wǎng)膜，尤其關(guān)注脈絡(luò)膜的厚度和血流，并希望在近視動(dòng)物模型中獲得視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜血流及厚度的數(shù)據(jù)來模擬人類在體中的結(jié)果，以期進(jìn)一步對(duì)結(jié)果進(jìn)行深入的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)性研究。其中近視動(dòng)物模型中小鼠由于其易得性及作為模式動(dòng)物的基因編輯便利性等，成為研究近視的常用動(dòng)物[10]。光學(xué)相干斷層掃描血流成像（Optical coherence tomography angiography，OCTA）技術(shù)憑借其非接觸式、非入侵性和較高成像分辨率為近視研究中關(guān)注在體脈絡(luò)膜、視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)及血流情況提供了便利，成為目前重要且常用的觀測(cè)手段[11-13]。而小鼠由于眼球小，脈絡(luò)膜、視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)微小，光學(xué)相干斷層掃描成像（OCT）分辨率不夠等原因，未見其近視脈絡(luò)膜、視網(wǎng)膜在體測(cè)量研究。本研究采用全域掃頻高分辨率OCTA量化分析離焦性近視小鼠模型視網(wǎng)膜及脈絡(luò)膜的厚度與血流變化，以小鼠作為模型，為在體探索視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜改變及其與近視的關(guān)系提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

2022 年11—12 月，22 只雄性3 周齡（體質(zhì)量10～15 g）C57BL/6J小鼠，購(gòu)自中南大學(xué)動(dòng)物中心[許可證號(hào)：SCUD（長(zhǎng)沙）2011-0004]。所有動(dòng)物飼養(yǎng)在清潔環(huán)境中，濕度為（55±5） %，溫度為（22±1） ℃，光照/黑暗12 h交替的條件下，自由獲得食物和水。檢查并排除眼部異常后，應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠分為2組：正常對(duì)照組（I組）、離焦近視組（II組），每組11只。I組不做任何處理，飼養(yǎng)4周；II組以右眼作為實(shí)驗(yàn)眼，左眼作為自身對(duì)照，在右眼建立離焦性近視模型，左眼不予處理，飼養(yǎng)4周。本研究所有實(shí)驗(yàn)流程均由中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心動(dòng)物保護(hù)與使用委員會(huì)審核通過（批號(hào)：CSU-2022-0001-0292）。

1.2 離焦性近視模型建立

小鼠用1%戊巴比妥鈉（0.01 mL/g）麻醉后，用5-0滌綸編織線將自制-10.00 D光學(xué)離焦透鏡間斷縫合于右眼眼瞼周圍皮膚組織，左眼自然暴露。配戴自制塑料脖套，以防小鼠抓撓透鏡。術(shù)前用0.5 g/L聚維酮碘消毒眼周皮膚，用左氧氟沙星滴眼液（3 mg/L）點(diǎn)眼預(yù)防感染。每日觀察小鼠的眼部情況，檢查是否有感染、異常分泌物、透鏡的緊密度和清潔度。如發(fā)現(xiàn)透鏡松脫或臟污，則及時(shí)加固和清洗，確保光學(xué)離焦?fàn)顟B(tài)不變。如果在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)有角膜炎、角膜白斑、瞳孔閉鎖、白內(nèi)障、玻璃體出血或其他導(dǎo)致屈光介質(zhì)混濁的情況，則將小鼠排除。離焦28 d后摘除透鏡，進(jìn)行后續(xù)指標(biāo)測(cè)量。左眼沒有接受任何處理。

1.3 屈光度及眼軸長(zhǎng)度測(cè)量

在實(shí)驗(yàn)開始前及28 d后，用0.1%戊巴比妥鈉（0.1 mL/10 g）麻醉及0.5%阿托品進(jìn)行睫狀肌麻痹后，每只鼠由同一名視光醫(yī)師進(jìn)行3 次檢影驗(yàn)光，驗(yàn)光結(jié)果取平均值，獲得屈光狀態(tài)。

使用光譜域光學(xué)相干斷層掃描儀（北溟·鯤 BM 400K，中國(guó)圖湃醫(yī)療），以12.00 mm×3.00 mm高清輻射模式獲取眼軸平面的，經(jīng)軟件校正后的OCT圖像并用儀器自帶軟件測(cè)量眼軸長(zhǎng)度（Axial length，AL），即從角膜前表面的高反射信號(hào)到視網(wǎng)膜色素上皮的高反射信號(hào)之間的距離為AL[17]，由同一研究人員測(cè)量3次，取平均值。

1.4 視網(wǎng)膜厚度及血流密度測(cè)量

以24 mm×20 mm黃斑OCTA模式同時(shí)捕獲視網(wǎng)膜圖像并利用基于深度學(xué)習(xí)的分割算法，對(duì)視網(wǎng)膜各層邊界進(jìn)行自動(dòng)三維精確分割和人工分層確認(rèn)。通過儀器自帶軟件將視網(wǎng)膜均分為9 個(gè)區(qū)域：顳上、上、鼻上、顳、中央、鼻、顳下、下、鼻下及3 個(gè)層次：視網(wǎng)膜內(nèi)層（內(nèi)界膜—內(nèi)叢層下界）、外層（內(nèi)叢層下界—Bruch膜）、全層（內(nèi)界膜—Bruch膜）。分別測(cè)量各個(gè)區(qū)域、層次的厚度及血流密度并計(jì)算全區(qū)域平均值。視網(wǎng)膜血流密度為指定區(qū)域內(nèi)血管投影到視網(wǎng)膜平面后計(jì)算血管投影面積與指定區(qū)域投影面積的比值，以%表示。

1.5 脈絡(luò)膜厚度和血流密度測(cè)量

以24 mm×20 mm黃斑OCTA模式捕獲脈絡(luò)膜圖像，獲得通過視神經(jīng)的水平橫截面圖像，并采用Image J軟件分析距離視神經(jīng)鼻側(cè)及顳側(cè)1 000、2 000、3 000 μm，共6個(gè)點(diǎn)處脈絡(luò)膜中大血管血流信號(hào)的厚度以代表小鼠脈絡(luò)膜厚度。儀器自帶軟件將脈絡(luò)膜均分為9個(gè)區(qū)域并測(cè)量血流密度。脈絡(luò)膜血流密度為指定區(qū)域內(nèi)脈絡(luò)膜血管體積與脈絡(luò)膜體積的比值，以%表示。所有小鼠均在19:00—20:00時(shí)間段內(nèi)使用OCTA儀器完成AL、視網(wǎng)膜及脈絡(luò)膜各參數(shù)測(cè)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)研究。采用GraphPad Prism 9.00軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布，均以±s表示。組間AL、屈光度及同一區(qū)域同一分層組間厚度及血流數(shù)據(jù)的比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 屈光度及AL變化

造模0 d，I組、II組屈光度分別為（+4.80±1.03） D、（+5.00±1.05）D，AL分別為（3 245±106）μm、（3 252±116）μm，組間屈光度和AL差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.42，P=0.673；t=0.14，P=0.894）。造模28 d后，I組、II組屈光度分別為（+6.13±1.60） D、（-0.14±2.80）D。AL分別為（3 329±112）μm、（3 438±35）μm。與I組相比，II組屈光度向近視發(fā)展、AL增長(zhǎng)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.47，P＜0.001；t=2.91，P=0.009）。

2.2 脈絡(luò)膜厚度及血流變化

II組在各測(cè)量點(diǎn)及6點(diǎn)平均值的脈絡(luò)膜厚度均低于I組。I組鼻側(cè)1 000 μm為（89.5±16.2）μm，II組為（61.2±17.1）μm，I組6點(diǎn)平均值為（77.5±16.6）μm，II組為（60.2±7.3）μm，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.00，P=0.011；t=3.80，P=0.001），其余區(qū)域差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。II組各個(gè)分區(qū)及全區(qū)域平均的脈絡(luò)膜血流密度均低于I組，其中鼻下區(qū)域I組為（48.4±2.3）%，II組為（44.7±3.7）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.67，P=0.018），余區(qū)域及均值差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 視網(wǎng)膜厚度及血流變化

II組視網(wǎng)膜內(nèi)層厚度各個(gè)分區(qū)及全區(qū)域均值與I組相比變薄，鼻上、中央、鼻、顳下、下、鼻下及全區(qū)域均值的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.36～3.92，均P＜0.05）。II組視網(wǎng)膜外層厚度各個(gè)區(qū)域及全區(qū)域均值與I組相比變厚，顳上、上、鼻上、中央、鼻、顳下、下、鼻下，及全區(qū)域均值差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.26～4.02，均P＜0.05）。II組視網(wǎng)膜全層厚度與I組相比變化不明顯，在顳側(cè)區(qū)域稍高（t=2.45，P=0.025），在鼻下區(qū)域稍低（t=2.61，P=0.018）。見表1。

表1.I組與II組視網(wǎng)膜內(nèi)層、外層及全層厚度（μm）比較Table 1.Comparison of inner, outer and full-thickness retina thickness (μm) of group I and group II

II組視網(wǎng)膜內(nèi)層血流密度各個(gè)分區(qū)及全區(qū)域均值與I組相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）；II組視網(wǎng)膜外層血流密度在鼻區(qū)域增大且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.70，P=0.015），其余分區(qū)及全區(qū)域均值與I組相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）；II組視網(wǎng)膜全層血流密度各個(gè)分區(qū)及全區(qū)域均值與I組相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。見表2。

表2.I組與II組視網(wǎng)膜內(nèi)層、外層及全層的血流密度（%）比較Table 2.Comparison of inner, outer and full-thickness retina blood flow density (%) of group I and group II

3 討論

近視尤其是病理性近視，可以出現(xiàn)視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜的拉伸變薄，出現(xiàn)近視性視網(wǎng)膜病變，如中周部常見的漆裂紋和周邊部常見的格子樣變性、豹紋狀眼底改變甚至脈絡(luò)膜缺損等。有研究認(rèn)為人類近視進(jìn)展過程中伴隨的脈絡(luò)膜及視網(wǎng)膜改變可能在近視進(jìn)展過程中發(fā)揮一定作用。保金華等[14]在前瞻性研究中發(fā)生近視兒童脈絡(luò)膜厚度變薄，脈絡(luò)膜及視網(wǎng)膜血流密度降低。多項(xiàng)基于OCT測(cè)量?jī)和巳褐忻}絡(luò)膜厚度的研究發(fā)現(xiàn)，與近視眼和遠(yuǎn)視眼相比，近視眼的脈絡(luò)膜更薄[15]，而紅光照射后可以見到脈絡(luò)膜增厚，AL變短[16]。這提示近視脈絡(luò)膜不僅會(huì)由于AL增長(zhǎng)而被動(dòng)拉伸變薄，還可能通過其血流及厚度的改變而影響眼球生長(zhǎng)從而參與近視的發(fā)生。因此研究者希望能開展對(duì)脈絡(luò)膜的研究來探索近視病因?qū)W機(jī)制并嘗試予以藥物等措施干預(yù)近視發(fā)生發(fā)展，而這些探索均需要在近視動(dòng)物模型中予以驗(yàn)證。

目前常用的動(dòng)物近視模型包括形覺剝奪及離焦，常用的動(dòng)物有小鼠、豚鼠、雞、樹鼩、猴等[10]。其中小鼠因易得性、對(duì)近視造模的良好反應(yīng)及其作為模式動(dòng)物的基因編輯便利性，成為了重要且常用的近視模型動(dòng)物。在近視豚鼠[17]、雞[18]、狨猴[19]、獼猴[20]等動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，研究者們發(fā)現(xiàn)也有脈絡(luò)膜厚度變薄、血流密度減小等與人類類似的改變，并且一些能夠抑制眼球生長(zhǎng)的藥物也能夠影響脈絡(luò)膜的厚度與血流情況[21]。此外，Wu等[22]的研究發(fā)現(xiàn)可能是脈絡(luò)膜血流減少導(dǎo)致的鞏膜缺血缺氧最終造成了鞏膜重塑。

OCTA技術(shù)憑借其非接觸式、非侵入性和優(yōu)秀的組織成像分辨率，成為了目前近視研究中關(guān)注脈絡(luò)膜、視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)的重要且常用的觀測(cè)手段[12-14,16]。由于小鼠視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜結(jié)構(gòu)微小，常規(guī)OCTA儀器分辨率欠佳及分析軟件算法不夠完善等原因，雖有研究使用OCT觀察近視小鼠眼前節(jié)、晶狀體厚度、玻璃體腔深度和AL等[23]，但目前沒有使用OCTA技術(shù)對(duì)近視小鼠脈絡(luò)膜、視網(wǎng)膜厚度及血流改變進(jìn)行的研究。目前，單細(xì)胞RNA測(cè)序、基因編輯、藥物干預(yù)及多組學(xué)檢測(cè)等多種實(shí)驗(yàn)手段均被廣泛用于小鼠近視模型的研究，但OCTA在體觀察脈絡(luò)膜厚度、血流情況的參考數(shù)據(jù)仍然缺乏。因此本研究通過小鼠離焦性近視模型，使用配備自動(dòng)分析軟件且軸向分辨率達(dá)3.8 μm，橫向光學(xué)分辨率達(dá)10 μm；高追蹤頻率達(dá)128 Hz；掃描區(qū)域?qū)掃_(dá)24 mm×20 mm的全域掃頻高分辨率OCTA儀器，量化觀察離焦性近視小鼠模型的視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜厚度及血流情況，這將為深入研究近視小鼠模型脈絡(luò)膜、視網(wǎng)膜在近視病因?qū)W中的作用及相關(guān)機(jī)制探索提供一定的科學(xué)基礎(chǔ)。

本研究中II組小鼠脈絡(luò)膜較I組厚度變薄、血流密度減小，且厚度變薄在鼻側(cè)1 000 μm最明顯且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，血流密度減弱在鼻下區(qū)域最明顯且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這與之前在人類及其他動(dòng)物上的研究發(fā)現(xiàn)[24]相符合，既往研究不僅發(fā)現(xiàn)近視動(dòng)物和人類出現(xiàn)脈絡(luò)膜變薄，部分研究還發(fā)現(xiàn)人類近視過程中鼻側(cè)區(qū)域最先出現(xiàn)脈絡(luò)膜變薄及血流減弱，且隨近視發(fā)展這一區(qū)域改變更明顯[25]。這可能說明小鼠離焦性近視產(chǎn)生過程中，同人類相似，脈絡(luò)膜最先出現(xiàn)厚度及血流改變的區(qū)域也是鼻側(cè)、鼻下。

我們還發(fā)現(xiàn)II組視網(wǎng)膜較I組視網(wǎng)膜內(nèi)層變薄，而視網(wǎng)膜外層相對(duì)增厚。視網(wǎng)膜外層增厚與既往近視雛雞模型中的研究結(jié)果一致，這可能是由于散焦導(dǎo)致光信號(hào)變化減弱使得光感受器膜盤脫落變慢、膜盤堆積，外節(jié)段變長(zhǎng)[26]。本研究發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜總厚度差異不大，這與1項(xiàng)用OCT測(cè)量成年人的前瞻性病例對(duì)照研究一致，其顯示正視眼與近視眼之間沒有發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜厚度差異[27]。另有趙桂玲[28]研究了近視與黃斑厚度的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)低、中、高度近視與正視相比較,黃斑中心區(qū)厚度和黃斑中心凹厚度差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1.29、1.04，P=0.28、0.38），本研究與其相符。還有文丹等[29]的研究發(fā)現(xiàn)造模2周或3周的形覺剝奪性近視豚鼠視網(wǎng)膜外層、內(nèi)層及全層皆變薄。我們的研究結(jié)果與之不同，可能是由造模動(dòng)物的不同或近視模型不同造成差異。近視對(duì)視網(wǎng)膜各象限、各層次的影響及其具體機(jī)制有待未來深入探索研究。

此外，II組視網(wǎng)膜外層鼻側(cè)區(qū)域血流密度較I組增高且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，推測(cè)可能由于鼻側(cè)區(qū)域脈絡(luò)膜變薄、脈絡(luò)膜血流密度減低，鼻側(cè)區(qū)域視網(wǎng)膜來自脈絡(luò)膜的血液供應(yīng)減少，形成相對(duì)缺血，致使來自視網(wǎng)膜中央動(dòng)脈系統(tǒng)的血流代償性增加。最終表現(xiàn)為視網(wǎng)膜外層鼻側(cè)區(qū)域血流密度的增大。在小鼠出生3～7周進(jìn)行近視造模，可能相當(dāng)于人類的青春期，這或許提示在此發(fā)育階段，近視造成的視網(wǎng)膜缺血、缺氧還在代償期，假若及時(shí)阻止近視發(fā)展，近視帶來的視網(wǎng)膜損傷就可中止甚至恢復(fù)，當(dāng)然這有待未來建立不同時(shí)段的近視模型進(jìn)一步驗(yàn)證。

有研究表明，脈絡(luò)膜鞏膜缺血缺氧微環(huán)境是近視發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素[30]。本研究使用全域掃頻高分辨率OCTA儀器對(duì)離焦性近視小鼠脈絡(luò)膜及視網(wǎng)膜進(jìn)行掃描，發(fā)現(xiàn)近視小鼠脈絡(luò)膜厚度變薄、血流減弱；視網(wǎng)膜厚度總體無(wú)顯著變化，內(nèi)層變薄、外層變厚、內(nèi)層鼻側(cè)區(qū)域血流密度增大。這提示近視時(shí)小鼠視網(wǎng)膜及脈絡(luò)膜厚度、血流改變與人類具有一定一致性，為小鼠作為造模動(dòng)物進(jìn)行近視相關(guān)研究，尤其是脈絡(luò)膜相關(guān)的近視機(jī)制研究提供了理論依據(jù)及基礎(chǔ)。

利益沖突申明 本研究無(wú)任何利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明 傅秋滿：收集數(shù)據(jù)，參與選題設(shè)計(jì)及資料的分析和解釋；撰寫論文；對(duì)編輯部的修改意見進(jìn)行修改。文丹、李元君、盧穎：參與實(shí)施研究、收集數(shù)據(jù)，修改論文中關(guān)鍵性結(jié)果、結(jié)論，對(duì)編輯部的修改意見進(jìn)行核修。胡涂、尹葉薇：對(duì)文章的知識(shí)性內(nèi)容做批判性審閱和指導(dǎo)。杜凱旋：參與研究實(shí)施、數(shù)據(jù)采集。孟書涵、張艷妮、趙立婷：參與選題及資料的分析和解釋