武 寒，徐 磊，王苗苗，張睿哲，許曉陽(yáng)，郭寧杰，吳淑華

濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科，山東 濱州 256600

隨著生活環(huán)境及飲食習(xí)慣的改變，結(jié)直腸癌已發(fā)展為全球常見(jiàn)惡性腫瘤的第3位，居腫瘤相關(guān)死亡率的第4位［1］。因此，提高結(jié)直腸癌的療效，改善其預(yù)后，是結(jié)直腸癌研究領(lǐng)域亟待解決的問(wèn)題。腫瘤細(xì)胞免疫逃逸是腫瘤重要的生物學(xué)特性，目前抗腫瘤細(xì)胞免疫逃逸已成為腫瘤治療的研究熱點(diǎn)。有研究［2］已證實(shí)，伴有豐富三級(jí)淋巴結(jié)構(gòu)（tertiary lymphoid structure，TLS）的腫瘤組織對(duì)免疫治療的反應(yīng)率較高，提示TLS可以作為對(duì)腫瘤免疫治療反應(yīng)的預(yù)測(cè)因子。而成熟樹突狀細(xì)胞（mature dendritic cell，mDC）對(duì)腫瘤抗原的提呈作用則是促進(jìn)TLS形成的關(guān)鍵［3］。自噬是細(xì)胞處理自身受損蛋白質(zhì)和細(xì)胞器的重要生物學(xué)現(xiàn)象。本課題組前期研究［4］顯示，結(jié)直腸癌中自噬可誘導(dǎo)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞募集及轉(zhuǎn)化。本研究采用免疫組織化學(xué)EnVision法檢測(cè)結(jié)直腸癌組織中自噬關(guān)鍵因子輕鏈3（light chain 3，LC3）的表達(dá)，并通過(guò)mDC、濾泡DC（follicular DC，F(xiàn)DC）、高內(nèi)皮微靜脈（high endothelial venule，HEV）及CD4+、CD8+、CD20+淋巴細(xì)胞的水平及Ki-67增殖指數(shù)判斷TLS，采用蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）及實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQP C R）檢測(cè)L C 3、N Y-E S O-2、淋巴毒素β（lymphotoxin-beta，LTβ）、CC族趨化因子配體21（CC chemokine ligand 21，CCL21）、CXC族趨化因子配體13（CXC chemokine ligand 13，CXCL13）及白細(xì)胞介素17（interleukin-17，IL-17）的表達(dá)，探討自噬與mDC、TLS及相關(guān)免疫因子的關(guān)系，為進(jìn)一步揭示結(jié)直腸癌腫瘤免疫逃逸機(jī)制、尋找新的治療靶點(diǎn)及預(yù)測(cè)腫瘤免疫治療效果提供新思路。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 組織標(biāo)本

收集2016年1月—2017年6月濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院收治的經(jīng)手術(shù)切除的T2期高危及T3期結(jié)直腸癌患者的臨床病理學(xué)資料。所有病例均為首次發(fā)現(xiàn)，術(shù)前未經(jīng)任何治療，術(shù)后均采用FOLFOX方案化療，并進(jìn)行隨訪，隨訪截至2022年6月，失訪者不予入組。根據(jù)世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）第5版消化系統(tǒng)腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)［5］，由兩名資深病理科醫(yī)師雙盲閱片重新診斷，非腫瘤死亡者予以排除。納入結(jié)直腸癌患者179例，其中男性83例，女性96例，平均年齡61歲。組織學(xué)類型：管狀腺癌143例，黏液腺癌36例。腫瘤直徑＜5 cm者74例，≥5 cm者105例。分化程度：高分化26例，中分化98例，低分化55例。浸潤(rùn)深度：肌層65例，侵及或浸透外膜者114例。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者90例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者89例。

1.1.2 試劑

LC3、DC-lamp、TLB、NY-ESO-2、CXCL13、CCL21、IL-17和β-actin抗體均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，MECA-79抗體購(gòu)自美國(guó)BD Biosciences公司，即用型抗體CD4 、CD8、CD20、CD21、Ki-67和羊抗兔/鼠Ⅱ抗均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，Western blot檢測(cè)所需試劑購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，RTFQ-PCR實(shí)驗(yàn)試劑盒購(gòu)自日本Takara公司，特異性引物序列由日本Takara公司合成。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)檢測(cè)

應(yīng)用免疫組織化學(xué)EnVision法：3 μm連續(xù)組織切片，將切片脫蠟至水，用3%的H2O2去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，高壓熱修復(fù)抗原，加一抗LC3（1∶100）、DC-lamp（1∶500）、MECA-79（1：100）、即用型CD4、CD8、CD20、CD21、Ki-67抗體4 ℃過(guò)夜，二抗37 ℃溫育30 min，采用二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色，蘇木精復(fù)染，1%鹽酸乙醇分化，脫水透明，中性樹膠封固。用已知LC3蛋白陽(yáng)性的腦組織、DC-lamp蛋白陽(yáng)性的肺組織、CD4蛋白陽(yáng)性的T細(xì)胞淋巴瘤、CD8、CD20、CD21蛋白陽(yáng)性、Ki-67增殖指數(shù)高的扁桃體組織作為陽(yáng)性對(duì)照，用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate-buffered saline，PBS）代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.2.2 免疫組織化學(xué)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

LC3主要表達(dá)于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)中，以出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性標(biāo)志。選取10個(gè)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)最多的高倍鏡下視野，根據(jù)染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞所占比例判定結(jié)果：無(wú)染色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≤5%為0分，6% ～ 25%為1分，26% ～ 50%為2分，51% ～ 75%為3分，＞75%為4分。將兩項(xiàng)評(píng)分結(jié)果相乘：≥4分判定為陽(yáng)性，＜4分判定為陰性。

DC-lamp標(biāo)記mDC主要表達(dá)于mDC細(xì)胞質(zhì)中，每張切片在10倍鏡下觀察10個(gè)獨(dú)立視野，選取5個(gè)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)最多的視野，在高倍鏡下計(jì)數(shù)，取平均值，高于平均值者為陽(yáng)性，低于平均值者為陰性。CD4、CD8、CD20表達(dá)于淋巴細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中；CD21標(biāo)記FDC表達(dá)于FDC細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中；MECA-79標(biāo)記HEV表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞中，均以細(xì)胞膜和（或）細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色為陽(yáng)性標(biāo)志。MECA-79+血管周環(huán)繞Ki-67+B細(xì)胞聚集區(qū)域判定為生發(fā)中心（germinal center，GC）。

根據(jù)結(jié)直腸癌中TLS的形態(tài)特征并輔以DClamp、CD4、CD8、CD20、CD21、Ki-67及MECA-79標(biāo)記判定TLS［6］。觀察腫瘤前沿10個(gè)低倍鏡視野，根據(jù)有無(wú)TLS形成，將其分為TLS+和TLS-。并根據(jù)GC的形成進(jìn)一步將TLS+分為：次級(jí)濾泡樣TLS組（TLS/GC+，GC+及CD21+伴CD4+、CD8+、CD20+淋巴細(xì)胞聚集體形成，TLS計(jì)數(shù)≥1個(gè)）和初級(jí)濾泡樣TLS和早期TLS組（TLS/GC-，GC-、CD21-/CD21+伴CD4+、CD8+、CD20+淋巴細(xì)胞聚集體形成，TLS計(jì)數(shù)≥1個(gè)）。TLS-樣本根據(jù)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)量分為淋巴細(xì)胞彌漫組（diffuse lymphocytic infiltration，DLI；多量彌漫CD4+、CD8+、CD20+淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，無(wú)聚集體形成，淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)＞120個(gè)/高倍視野）和少淋巴細(xì)胞組（sparse infiltration，SLI；少量散在CD4+、CD8+、CD20+淋巴細(xì)胞分布，淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)＜120個(gè)/高倍視野）。本實(shí)驗(yàn)均采用同一樣本連續(xù)切片進(jìn)行上述各指標(biāo)標(biāo)記，并在同一視野下觀察，以確保判讀結(jié)果的準(zhǔn)確性及組間可比 性。

1.2.3 Western blot檢測(cè)

將新鮮組織經(jīng)液氮冷凍研磨破碎后經(jīng)放射免疫沉淀法（radio immunoprecipitation assay，RIPA）裂解，12 000 r/min離心5 min提取上清液，采用二辛可寧酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，樣品煮沸后進(jìn)行電泳。應(yīng)用含有吐溫-20三乙醇胺緩沖鹽溶液（tris-buffered saline Tween，TBST）洗滌3次，每次15 min，5%的脫脂牛奶室溫?fù)u床封閉2 h；一抗4 ℃溫育過(guò)夜；TBST洗滌3次，每次15 min；二抗室溫溫育2 h；TBST洗滌3次，每次15 min，電化學(xué)發(fā)光（electrochemical luminescence，ECL）曝光，應(yīng)用Image J軟件對(duì)目標(biāo)圖像進(jìn)行分析。

1.2.4 RTFQ-PCR

按照TRIzol試劑盒說(shuō)明書提取組織RNA并檢測(cè)其濃度，在37 ℃ 15 min、85 ℃ 5 s條件下將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用SYBR Green相對(duì)定量PCR法，按照試劑盒說(shuō)明書配制25 μL體系反應(yīng)液，在CFX96T RT-PCR Detection System C1000上進(jìn)行擴(kuò)增（表1）。反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s、95 ℃5 s、60 ℃ 30 s，合計(jì)40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

表1 RTFQ-PCR引物序列Tab. 1 RTFQ-PCR primer sequence

表2 結(jié)直腸癌與癌旁組織中LC3與DC-lamp的表達(dá)Tab. 2 The expression of LC3 and DC-lamp in colorectal cancer tissues and para-cancerous tissues

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 27.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。運(yùn)用GraphPad Prism 9.0及Image J軟件進(jìn)行圖像和數(shù)據(jù)處理，組間比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率方法。相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析法。生存分析采用Kaplan-Meier法，并采用log-rank檢驗(yàn)比較組間預(yù)后差異，采用COX比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型進(jìn)行多因素生存分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 結(jié)直腸癌中LC3和DC-lamp的表達(dá)及相關(guān) 性

采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)LC3和DC-lamp的表達(dá)，結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌中LC3的陽(yáng)性表達(dá)高于癌旁組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。同時(shí)，結(jié)直腸癌中DC-lamp的陽(yáng)性表達(dá)高于癌旁組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖1，表 2）。

圖1 結(jié)直腸癌與癌旁組織中LC3與DC-lamp的表達(dá)Fig. 1 The expression of LC3 and DC-lamp in colorectal cancer and para-cancerous tissues

根據(jù)LC3的表達(dá)將179例結(jié)直腸癌分為L(zhǎng)C3+與LC3-組，分別計(jì)數(shù)DC-lamp+DC細(xì)胞。結(jié)果顯示，LC3+組中DC-lamp表達(dá)高于LC3-組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Spearman相關(guān)分析顯示，LC3表達(dá)水平與DC-lamp的表達(dá)呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（r= 0.237，P＜0.05，表3）。

表3 結(jié)直腸癌組織中LC3與DC-lamp表達(dá)的相關(guān)性Tab. 3 Correlation of LC3 and DC-lamp in colorectal cancer tissues

2.2 結(jié)直腸癌中TLS的功能亞型及占比

根據(jù)TLS判斷標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)179例結(jié)直腸癌患者進(jìn)行分組。TLS+組115例，其中TLS/GC+亞型組40例（22.3%），TLS/GC-亞型組75例（41.9%）。TLS-組64例，其中DLI亞組33例（18.5%），SLI亞組31例（17.3%）。TLS+占比（64.2%）高于TLS-組（35.8%），詳見(jiàn)圖2。

圖2 結(jié)直腸癌TLS/GC+、TLS/GC-亞型分組中各相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)Fig. 2 The expression of marker in TLS/GC+, TLS/GC- subtype in colorectal cancer

2.3 不同亞組結(jié)直腸癌中LC3的表達(dá)及相關(guān)性

觀察各亞組中LC3的表達(dá)水平，分析其差異性及相關(guān)性。結(jié)果顯示，TLS/GC+亞型組中LC3表達(dá)水平均明顯高于其余3組，TLS/GC-亞型組中LC3表達(dá)水平則高于DLI組和SLI組，而SLI亞組中LC3表達(dá)水平明顯低于其余3組，組間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Spearman相關(guān)分析顯示，LC3表達(dá)與TLS/GC+、TLS/GC-兩亞型均呈正相關(guān)（r= 0.270，r= 0.230，P＜0.05），而與DLI、SLI均呈負(fù)相關(guān)（r= -0.175，r= -0.443，P＜0.05，表4，圖3）。

圖3 不同亞組結(jié)直腸癌組織中LC3與DC-lamp表達(dá)Fig. 3 The expression of LC3 and DC-lamp at different subgroups in colorectal cancer

表4 不同亞組結(jié)直腸癌中LC3的表達(dá)及相關(guān)性Tab. 4 The expression and correlation of LC3 at difffferent subgroups in colorectal cancer

2.4 不同亞組結(jié)直腸癌中DC-lamp的表達(dá)及相關(guān)性

在各亞組中分別計(jì)數(shù)DC-lamp+細(xì)胞。結(jié)果顯示，TLS/GC+和TLS/GC-亞型組中DC-lamp的表達(dá)水平均高于其余兩組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但兩亞組間比較DC-lamp的表達(dá)水平，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；而SLI組DC-lamp的表達(dá)水平均明顯低于其余3組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Spearman相關(guān)分析顯示，DC-lamp表達(dá)與TLS/GC+、TLS/GC-兩亞型均呈正相關(guān)（r= 0.194，r= 0.227，P＜0.05），而與DLI、SLI均呈負(fù)相關(guān)（r= -0.148，r= -0.358，P＜0.05，表5）。

表5 不同亞組結(jié)直腸癌中DC-lamp的表達(dá)及相關(guān)性Tab. 5 The expression and correlation of DC-lamp in different subgroups in colorectal cancer

2.5 TLS+組與TLS-組中LC3、NY-ESO-2、LTβ、CXCL13、CCL21、IL-17的表達(dá)及結(jié)直腸癌中LC3與各因子的相關(guān)性

分別選取TLS+及TLS-結(jié)直腸癌組織各15例，檢測(cè)LC3、NY-ESO-2、LTβ、CXCL13、CCL21及IL-17的表達(dá)。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，TLS+組中LC3、NY-ESO-2、LTβ、CXCL13及CCL21的表達(dá)量均高于TLS-組，TLS-組中IL-17的表達(dá)量高于TLS+組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。RTFQ-PCR結(jié)果顯示，TLS+組中LC3、NY-ESO-2、LTB、CXCL13及CCL21的mRNA表達(dá)量均高于TLS-組，TLS-組中IL-17 mRNA的表達(dá)量高于TLS+組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖4A ～ 4C）。

圖4 TLS+及TLS-組中LC3、NY-ESO-2、LTβ、CXCL13、CCL21、IL-17的表達(dá)及結(jié)直腸癌中LC3與各因子的相關(guān)性Fig. 4 The expression of LC3, NY-ESO-2, LTβ, CXCL13, CCL21 and IL-17 in TLS+ or TLS- groups and the correlation between LC3 and various factors in colorectal cancer

應(yīng)用Image J軟件進(jìn)行圖像處理，根據(jù)結(jié)直腸癌組織中各因子表達(dá)的灰度值，采用線性回歸的對(duì)數(shù)趨勢(shì)線分析其相關(guān)性。結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌組織中LC3與NY-ESO-2、LTβ、CXCL13和CCL21的表達(dá)均呈正相關(guān)（R2= 0.326、0.271、0.151和0.295），與IL-17的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（R2= -0.150），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖4D ～ 4H）。

2.6 生存分析

179例結(jié)直腸癌患者中的中位生存期為62個(gè)月，平均5年生存率為59.8%。Log-rank檢驗(yàn)結(jié)果顯示，LC3、DC-lamp、TLS及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與結(jié)直腸癌患者預(yù)后密切相關(guān)（P＜0.05，圖5）。COX比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型顯示，LC3、DC-lamp、TLS及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是結(jié)直腸癌的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05，表6）。

圖5 結(jié)直腸癌患者的預(yù)后生存曲線Fig. 5 Prognostic survival curve in colorectal cancer patients

表6 影響結(jié)直腸癌患者預(yù)后多因素生存分析Tab. 6 Multivariable analysis of prognosis in patients with colorectal cancer

3 討 論

自噬是一種高度保守的生物學(xué)行為，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中扮演著重要角色［7］。自噬小體的成熟是自噬過(guò)程的關(guān)鍵階段，它通過(guò)在細(xì)胞質(zhì)中形成的雙層膜結(jié)構(gòu)包裹腫瘤相關(guān)抗原、免疫介質(zhì)和表面標(biāo)志物等待清除物質(zhì)，形成自噬小體并運(yùn)送到溶酶體中降解［8］。當(dāng)這些物質(zhì)被降解后，其中一部分抗原肽可以與MHC分子結(jié)合，形成MHC-抗原肽復(fù)合物，最終通過(guò)抗原提呈細(xì)胞呈遞，從而激活免疫應(yīng)答［8］。因此，自噬與抗原提呈的相關(guān)性受到廣泛關(guān)注。Münz等［9］和Romao等［10］的研究表明，LC3-Ⅱ可以與MHC分子作用，從而影響抗原呈遞的效率和選擇性。Jin等［11］研究證實(shí)，雷帕霉素可通過(guò)與LC3融合，將抗原靶向自噬小體，有效地增強(qiáng)抗原提呈細(xì)胞中MHC-Ⅱ類分子上抗原的呈現(xiàn)。NY-ESO-2是腫瘤抗原中免疫原性最強(qiáng)的CTAG基因家族中的一員，但在結(jié)直腸癌中表達(dá)較低［12］。然而，本研究結(jié)果顯示，在LC3高表達(dá)的結(jié)直腸癌中伴有腫瘤表面抗原NY-ESO-2高表達(dá)，且兩者呈正相關(guān)。結(jié)合本課題組前期研究結(jié)果［13］，提示結(jié)直腸癌中存在自噬異常激活現(xiàn)象，并可增加腫瘤表面抗原暴露，進(jìn)而影響腫瘤免疫。因此，深入研究自噬與腫瘤免疫的關(guān)系，對(duì)于腫瘤防治具有重要意義。

DC家族是免疫系統(tǒng)中功能強(qiáng)大的抗原提呈細(xì)胞［14］，其中mDC在抗原提呈中發(fā)揮關(guān)鍵作用，能夠吞噬、攝取、內(nèi)化和處理抗原，通過(guò)表面的共刺激分子與T細(xì)胞相互作用，使其激活并誘導(dǎo)增殖和分化［15-16］。Fridman等［17］研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞自噬小體作為mDC交叉遞呈的抗原來(lái)源，可有效地提升誘導(dǎo)抗原特異性CD8+T細(xì)胞的應(yīng)答能力。但也有研究［18］表明，高水平的自噬可導(dǎo)致MHC-Ⅰ類分子被選擇性地降解，從而抑制T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，增加腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸能力。Tian等［19］在肝癌細(xì)胞中研究發(fā)現(xiàn)，自噬活性升高會(huì)導(dǎo)致mDC中的氧化應(yīng)激，并加速腫瘤抑制因子的降解，從而抑制其抗原提呈能力。由此可見(jiàn)，自噬與mDC抗原提呈誘導(dǎo)免疫的相關(guān)性還存在爭(zhēng)議，而其在結(jié)直腸癌中的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，LC3蛋白及mDC在結(jié)直腸癌中的表達(dá)率均明顯高于癌旁黏膜，并且LC3表達(dá)與NY-ESO-2及mDC浸潤(rùn)量均呈正相關(guān)，提示結(jié)直腸癌中不僅存在自噬異常激活現(xiàn)象，同時(shí)也是增加腫瘤表面抗原暴露并最終影響mDC細(xì)胞浸潤(rùn)量及激活的重要因素。由此推測(cè)，結(jié)直腸癌中自噬所導(dǎo)致的腫瘤微環(huán)境中抗原的增加，可能是抗腫瘤免疫的始動(dòng)因素之一，而mDC則在有效識(shí)別、呈遞抗原、招募免疫細(xì)胞等方面發(fā)揮抗腫瘤免疫的核心效應(yīng)。

TLS是位于非典型淋巴器官的異位淋巴結(jié)構(gòu)［20］，常發(fā)生于各類腫瘤前沿。TLS的組成成分包括T細(xì)胞區(qū)、B細(xì)胞區(qū)和HEV。T細(xì)胞區(qū)主要由CD4+、CD8+T細(xì)胞及mDC構(gòu)成，B細(xì)胞區(qū)由B細(xì)胞和FDC形成的GC構(gòu)成［19］。TLS為抗腫瘤免疫反應(yīng)提供了局部而關(guān)鍵的微環(huán)境［21］。目前研究發(fā)現(xiàn)，在胰腺導(dǎo)管癌［6］、乳腺癌［22］及非小細(xì)胞肺癌［23］等多鐘實(shí)體腫瘤中均存在TLS結(jié)構(gòu)，并且與腫瘤免疫及患者預(yù)后密切相關(guān)。Ding等［24］對(duì)肝內(nèi)膽管癌的研究結(jié)果顯示，TLS數(shù)量和空間位置與患者預(yù)后顯著相關(guān)，證實(shí)腫瘤內(nèi)TLS是抗腫瘤免疫反應(yīng)的微觀解剖學(xué)位點(diǎn)。Weinstein等［25］將轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)T-bet基因的mDC導(dǎo)入腫瘤微環(huán)境中可促進(jìn)TLS發(fā)展、延緩腫瘤進(jìn)程。Wang等［22］和Halle等［26］研究表明，mDC接受抗原刺激后通過(guò)產(chǎn)生多種細(xì)胞因子和趨化因子，在誘導(dǎo)免疫細(xì)胞異位聚集、促進(jìn)FDC發(fā)育、構(gòu)建TLS形態(tài)并維持其功能方面發(fā)揮重要作用。相關(guān)研究［27-28］表明，TLS/GC+亞型因具有成熟的GC，在維持腫瘤抗原特異性免疫反應(yīng)方面具有最強(qiáng)效力，是最強(qiáng)抗腫瘤作用的“功能亞型”，TLS/GC-者次之，而缺乏TLS者的免疫監(jiān)視能力較弱。有關(guān)結(jié)直腸癌中LC3與mDC對(duì)TLS功能亞型影響的相關(guān)研究較少。本研究的179例結(jié)直腸癌患者中有115例具有TLS結(jié)構(gòu)，其中TLS/GC+亞型占22.3%，TLS/GC-亞型占41.9%，而DLI亞型占18.5%，SLI亞型占17.3%。本研究結(jié)果顯示，TLS兩亞型組中LC3表達(dá)水明顯高于無(wú)TLS組，其中以TLS/GC+亞型組表達(dá)最高，并且LC3表達(dá)與TLS兩功能亞型呈正相關(guān)。同時(shí)TLS兩亞型組中mDC的表達(dá)高于其余組，且與功能亞型形成呈正相關(guān)。提示LC3激活mDC，通過(guò)招募淋巴細(xì)胞，促使TLS形成，在促進(jìn)抗腫瘤免疫的功能中發(fā)揮重要作 用。

TLS對(duì)抗腫瘤免疫的積極作用已在結(jié)直腸癌［29］、乳腺癌［23］及非小細(xì)胞肺癌［24］等惡性腫瘤中被證實(shí)，因而誘導(dǎo)TLS形成已成為抗腫瘤研究的熱點(diǎn)。目前，利用抗原呈遞細(xì)胞、趨化因子或合成支架成為誘導(dǎo)TLS形成的主要方法［2］。因此，深入研究TLS的形成機(jī)制，對(duì)于尋找有效的促TLS形成途徑具有重要意義。為進(jìn)一步證實(shí)LC3、mDC與TLS的形成機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)同步檢測(cè)了CXCL13和CCL21以及LTβ、IL-17等部分細(xì)胞因子，并分析了上述因子與LC3的關(guān)系。結(jié)果顯示，TLS+組中CXCL13與CCL21、LTβ呈高表達(dá)，而IL-17則表達(dá)較低。同時(shí)LC3與NY-ESO-2、LTβ、CXCL13及CCL21的表達(dá)均呈正相關(guān)，而與IL-17的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。提示LC3、mDC對(duì)TLS的影響機(jī)制可能是通過(guò)自噬促使NYESO-2等腫瘤表面抗原釋放，進(jìn)而激活mDC，而由mDC、FDC、T細(xì)胞產(chǎn)生的LTβ、CXCL13及CCL2等細(xì)胞因子的高表達(dá)在調(diào)控免疫細(xì)胞遷徙、歸巢等方面發(fā)揮積極作用［24］，最終促使TLS形成，成為影響腫瘤免疫的重要因素。作為抑制自噬的促炎性細(xì)胞因子IL-17的低表達(dá)也在一定程度上推助了TLS的形成［30］。因此，結(jié)直腸癌的自噬水平可以成為影響TLS形成并向最強(qiáng)功能亞型發(fā)展的重要因素。由此推測(cè)，自噬的異常激活導(dǎo)致腫瘤表面抗原暴露增加，驅(qū)動(dòng)mDC活化，促進(jìn)抗原提呈，進(jìn)而影響TLS發(fā)展與成熟，在抗腫瘤免疫中發(fā)揮重要作用。Dieu-Nosjean等［31］在早期非小細(xì)胞肺癌中發(fā)現(xiàn)mDC的密度及TLS的保護(hù)性免疫作用與良好的臨床預(yù)后高度相關(guān)。Calderaro等［32］研究發(fā)現(xiàn)，肝細(xì)胞癌內(nèi)TLS的存在與早期復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)降低顯著相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，具有TLS結(jié)構(gòu)的115例（64.2%）結(jié)直腸癌患者的預(yù)后優(yōu)于無(wú)TLS結(jié)構(gòu)組，其5年存活率與既往研究［33］結(jié)果相符。COX比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型顯示，LC3、mDC、TLS及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響結(jié)直腸癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，進(jìn)一步證實(shí)TLS在一定程度上維持了免疫應(yīng)答的中心環(huán)節(jié)。由此推測(cè)，在腫瘤微環(huán)境中，激活自噬，增強(qiáng)mDC抗原提呈，誘導(dǎo)TLS形成，有效激活T、B淋巴細(xì)胞，進(jìn)而發(fā)揮抗腫瘤免疫作用，可能成為影響患者生存和預(yù)后的有效途徑。

綜上所述，結(jié)直腸癌的腫瘤細(xì)胞自噬水平的異常激活可使腫瘤抗原增加，腫瘤細(xì)胞表面抗原決定簇暴露，激活mDC，增加抗原識(shí)別及提呈能力，進(jìn)而招募微環(huán)境中的淋巴細(xì)胞，最終形成TLS，通過(guò)多種細(xì)胞因子以增強(qiáng)抗腫瘤免疫反應(yīng)，有效地避免腫瘤免疫逃逸現(xiàn)象的發(fā)生。深入探究自噬與mDC及TLS形成的關(guān)系，研究其在抗腫瘤免疫中的潛在作用，將有助于為發(fā)現(xiàn)腫瘤免疫治療靶點(diǎn)提供新思路。然而本研究?jī)H對(duì)結(jié)直腸癌中自噬與mDC對(duì)TLS的形成關(guān)系進(jìn)行了初步探討，仍需增加樣本量并進(jìn)一步開展實(shí)驗(yàn)研究，從而更深層次地揭示其分子機(jī)制及意義。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。