彭岳　楊妙　林江　趙鐵建　劉鵬　劉茜玉　郭偉倩

摘要：目的 探討珍珠水解液對肝纖維化時肝竇毛細血管化病變的干預作用及機制。方法 合浦珍珠水解液與肝竇內(nèi)皮細胞（HSEC）和肝星狀細胞（HSC-LX2）共同孵育，采用MTT比色法測定HSEC和HSC-LX2的細胞增殖抑制率，流式細胞術測定HSC-LX2的細胞周期及細胞凋亡情況，透射電鏡觀察HSEC的窗孔及基底膜等微結構的變化情況。結果 瘦素激活后，HSC-LX2細胞活性顯著增高（P=0.041），HSEC則出現(xiàn)細胞活性顯著降低（P=0.004）、窗孔數(shù)量減少、窗孔直徑下降、連續(xù)基底膜形成等肝竇毛細血管化現(xiàn)象。瘦素干預后給予低、中、高不同濃度珍珠水解液治療，各濃度組均可使縮小及消失了的HSEC窗孔發(fā)生增多和擴大（低濃度組：P=0.020；中濃度組：P=0.028；高濃度組：P=0.032），使HSEC外成片的基膜變得稀薄甚至消失（低濃度組：P=0.020；中濃度組：P=0.028；高濃度組：P=0.032）；使活化的HSC-LX2活力下降（低濃度組：P=0.018；中濃度組：P=0.013；高濃度組：P=0.009），并誘導其發(fā)生細胞凋亡（低濃度組：P=0.012；中濃度組：P=0.006；高濃度組：P=0.005）。隨著珍珠水解液給藥濃度上升，干預肝竇毛細血管化的效果有梯度增高，具有劑量依賴性（低濃度組：P=0.020；中濃度組：P=0.028；高濃度組：P=0.032）。高濃度珍珠水解液干預肝竇毛細血管化的效果強于治療劑量的秋水仙堿（P=0.034）和丹參酚酸B（P=0.038）。結論 合浦珍珠水解液可使HSEC細胞的活性增加、窗孔面積恢復、基底膜消失，使激活的HSC-LX2細胞喪失活力并發(fā)生凋亡，具有針對HSEC及HSC-LX2的顯著的抗肝竇毛細血管化藥理學作用。

關鍵詞：珍珠水解液；抗肝纖維化；肝竇毛細血管化；窗孔；基底膜

中圖分類號： R333.4文獻標志碼： A文章編號：1000-503X（2023）02-0185-08

DOI：10.3881/j.issn.1000-503X.15204

Effects of Pearl Hydrolysate on Hepatic Sinusoidal Endothelial Cell Viability and Capillarization in Liver Fibrosis

PENG Yue YANG Miao LIN Jiang ZHAO Tiejian LIU Peng4，LIU Qianyu GUO Weiqian2

ABSTRACT：Objective To study the effect and mechanism of pearl hydrolysate on hepatic sinusoidal capillarization in liver fibrosis.Methods Hepatic sinusoidal endothelial cells （HSEC） and hepatic stellate cells （HSC-LX2） were incubated with Hepu pearl hydrolysate.The proliferation of HSEC and HSC-LX2 was examined by MTT colorimetry.The cell cycle and apoptosis of HSC-LX2 were measured by flow cytometry.The changes of the microstructures such as fenestra and basement membrane of HSEC were observed by transmission electron microscopy.Results The intervention with leptin increased the viability of HSC-LX2 （P=0.041），decreased the viability of HSEC （P=0.004），and caused capillarization signs such as decreased number and diameter of fenestrae and formation of continuous basement membrane.The treatment with pearl hydrolysate at different doses increased and expanded the fenestrae of HSEC （low dose：P=0.020；medium dose：P=0.028；high dose：P=0.032），disintegrated the extracellular basement membrane of HSEC （low dose：P=0.020；medium dose：P=0.028；high dose：P=0.032），decreased the viability of HSC-LX2 （low dose：P=0.018；medium dose：P=0.013；high dose：P=0.009），and induced the apoptosis of HSC-LX2 （low dose：P=0.012；medium dose：P=0.006；high dose：P=0.005）.Pearl hydrolysate exerted therapeutic effect on capillarization in a dose-dependent manner （low dose：P=0.020；medium dose：P=0.028；high dose：P=0.032）.Moreover，high-dose pearl hydrolysate showed stronger effect on capillarization of hepatic sinuses than colchicine （P=0.034） and salvianolic acid B （P=0.038）.Conclusion Hepu pearl hydrolysate can increase the viability of HSEC，restore the area of fenestrae，disintegrate the basement membrane，and decrease the viability and induce the apoptosis of HSC-LX2，demonstrating significant pharmacological effects on the capillarization of HSEC and HSC-LX2.

Key words：pearl hydrolysate；anti-hepatic fibrosis；hepatic sinusoidal capillarization；fenestrae；basement membrane

Acta Acad Med Sin，2023，45（2）：185-192

肝纖維化時，肝臟受到各種理化因素持續(xù)性損傷刺激，肝臟產(chǎn)生慢性炎癥，肝細胞變性壞死。同時，肝細胞也在發(fā)生自我修復，肝組織不規(guī)則地重建及增生，形態(tài)紊亂，造成肝臟內(nèi)血液循環(huán)被顯著改變。肝纖維化階段有兩個特點：（1）各類型慢性肝病發(fā)展中后期的共同病變和共同歸途；（2）其早期階段具有較確切的可干預性、可逆性［1］。研究顯示發(fā)生肝纖維化時，血液與肝細胞之間進行物質交換的關鍵屏障—肝竇內(nèi)皮細胞（hepatic sinusoidal endothelial cell，HSEC）的特征性結構窗孔數(shù)量發(fā)生減少、直徑顯著縮??；HSES與肝細胞之間則出現(xiàn)連續(xù)成片的基底膜［2］。窗孔的縮小或消失、連續(xù)性基底膜形成如果合并 肝星狀細胞（hepatic stellate cell，HSC）的活化增殖，三者合稱為肝竇毛細血管化，是肝纖維化和肝硬化疾病過程中較獨特的、標志性的病理變化過程［3］；該病變可導致肝臟的血液循環(huán)進一步受阻惡化，肝臟與血液之間的物質交換不利，加速肝纖維化的進程［4］。

珍珠性寒，味甘、咸，歸心、肝經(jīng)。是治療心經(jīng)、肝經(jīng)疾病的常用中藥。珍珠具有平肝潛陽、清肝明目、清熱化瘀、寧心安神、美容養(yǎng)顏的臨床療效［5］。其中以南珠粒大、珠圓、珠層厚、色粉，嫩而晶瑩，藥用價值高。我國北部灣一帶所產(chǎn)的珍珠就屬于南珠范疇，以合浦珍珠最負盛名，是南珠的優(yōu)質代表［6］?，F(xiàn)代藥理學研究顯示，合浦珍珠水解液可對肝纖維化病變的核心細胞—HSC的增殖活力產(chǎn)生顯著抑制，并可誘導該細胞發(fā)生早期、晚期凋亡，進而產(chǎn)生抑制肝臟纖維結締組織增生與變質，改善組織微循環(huán)障礙的作用［7］。本研究對廣西合浦珍珠水解液的抗肝纖維化作用、改善肝臟微循環(huán)作用及其機制進行探索，旨在了解合浦珍珠是否具有抑制肝竇毛細血管化的病變過程，進而干預肝纖維化發(fā)展的作用。

材料和方法

材料 細胞株：人HSC-LX2細胞株由上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院肝病研究所徐列明教授提供，大鼠HSEC細胞株（批號：MIC-iCell-d019）為上海賽百慷生物技術有限公司產(chǎn)品。儀器：CO2恒溫培養(yǎng)箱（型號：MCO-15AC）為日本SANYO公司產(chǎn)品，倒置顯微鏡（型號：ECLIPSE Ts2）為日本Nikon公司產(chǎn)品，低速離心機（型號：5702R）為德國Eppendorf公司產(chǎn)品，流式細胞儀（型號：CxtoFLEX）為美國BECKMAN公司產(chǎn)品，透射電子顯微鏡（型號：H-7650）為日本HITACHI公司產(chǎn)品，數(shù)碼相機（型號：5D mark2）為日本Canon公司產(chǎn)品。試劑：秋水仙堿（批號：191003）為西雙版納藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，丹參酚酸B（批號：20191220）為西安金綠生物工程技術有限公司產(chǎn)品，四甲基噻唑藍（批號：191M2466W）為美國Sigma公司產(chǎn)品，異硫氰酸熒光素、碘化丙啶雙標記細胞凋亡測試盒（批號：E-CK-A211）為Elabscience公司產(chǎn)品。

合浦珍珠水解液的制備 合浦珍珠水解原液由北海市寶珠林海洋科技有限公司提供，按《中國藥品專利》的配制方法以生物酶低溫水解珍珠技術生產(chǎn)［8］，原液經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學藥物分析教研室鑒定，100 g中含鈣64.2 mg、鋅2.1 mg。原液以無血清DMEM培養(yǎng)基將濃度為1 g/L的60 ml珍珠水解液稀釋定容至100 ml，制備得100 ml（600 mg/L）的珍珠水解液，過濾除菌后備用。實驗中根據(jù)各實驗組的藥物濃度設計，將水解液稀釋為相應的工作液。

實驗細胞分組 將HSC-LX2、HSEC各自混勻至含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基中，分別接種入培養(yǎng)瓶中，置入37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在細胞長勢良好、密度至培養(yǎng)瓶底80％左右、貼壁狀況佳（對數(shù)生長期）時，以0.25%胰蛋白酶將細胞消化，制成單細胞懸液，新鮮培養(yǎng)液將其重新懸浮，按檢測項目需要，將細胞懸液接種入6孔或96孔培養(yǎng)板。置入CO2培養(yǎng)箱中孵育48 h（細胞完全貼壁），以培養(yǎng)板的孔為單位進行實驗分組。

將HSC-LX2、HSEC細胞分別按下述方法分為7組：（1）空白對照組：標準方法培養(yǎng)細胞，不添加干預因素；（2）瘦素激活對照組：培養(yǎng)液中滴加終濃度為100 μg/L的瘦素，病理激活細胞；（3）珍珠水解液低濃度組：先以瘦素激活細胞，再滴加終濃度為30 mg/L的珍珠水解液進行干預；（4）珍珠水解液中濃度組：先以瘦素激活細胞，再滴加終濃度為60 mg/L的珍珠水解液進行干預；（5）珍珠水解液高濃度組：先以瘦素激活細胞，再滴加終濃度為120 mg/L的珍珠水解液進行干預；（6）秋水仙堿干預對照組：先以瘦素激活細胞，再滴加終濃度6.25 μg/ml的秋水仙堿進行干預；（7）丹參酚酸B干預對照組：先以瘦素激活細胞，再滴加終濃度為1×10-6 mmol/L的丹參酚酸B進行干預。

每項檢測重復3次。

MTT比色法檢測HSC-LX2、HSEC的增殖抑制率 用0.25%胰蛋白酶液消化對數(shù)生長期的HSC-LX2、HSEC，以DMEM培養(yǎng)液（含10%胎牛血清）重懸細胞，分別制備成5×104個/ml的細胞懸液。向96孔培養(yǎng)板的每孔內(nèi)滴加細胞懸液200 μl，置入37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，細胞貼壁狀況良好后，將96孔培養(yǎng)板以孔為單位分成7組，每組設12個復孔。棄舊培養(yǎng)液后，分別按兩種細胞的7個組的相應給藥要求，在每組細胞的每個孔內(nèi)滴加對應的工作液200 μl，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h。每孔滴加200 μl的MTT試劑，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)6 h；棄舊培養(yǎng)液后，每孔滴加二甲基亞砜 200 μl，超聲振蕩器搖勻2 min。酶標儀測定各組細胞的吸光值。參數(shù)調(diào)節(jié)：波長570 nm，參比波長450 nm。細胞增殖抑制率=（1-藥物吸光值/對照吸光值）×100%

流式細胞術（Annexin V-FITC/PI雙染色法）檢測HSC-LX2凋亡 用0.25%胰蛋白酶液消化對數(shù)生長期的HSC-LX2，以DMEM培養(yǎng)液（含10%胎牛血清）重懸細胞，制備成5×105個/ml的細胞懸液。向6孔培養(yǎng)板的每孔內(nèi)滴加細胞懸液1.5 ml，置入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，細胞貼壁狀況良好后，將6孔培養(yǎng)板以孔為單位分成7組。棄舊培養(yǎng)液后，分別按兩種細胞的7個組的相應給藥要求，在每組細胞的每個孔內(nèi)滴加相應的工作液2 ml；培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h。胰酶將細胞消化并收集于離心管中，1000 r/min（r=7.7 cm）離心5 min；以500 μl的1倍濃度結合緩沖液重懸細胞，將細胞濃度調(diào)整至1×106個/ml。取細胞懸液100 μl滴入離心管。滴加5 μl的異硫氰酸熒光素入離心管，室溫孵育5 min。滴加5 μl的碘化丙啶入離心管，室溫孵育15 min。滴加500 μl的1倍濃度結合緩沖液，混勻。離心管置入流式細胞儀進行檢測。參數(shù)調(diào)節(jié)：氬離子氣體激光器波長488 nm，阻斷濾片用530 nm長波通濾片。

透射電鏡觀察HSEC細胞的窗孔及基底膜等微結構 以DMEM培養(yǎng)液將HSEC制備為細胞濃懸液（1.5×106個/ml），以1%四氧化鋨進行細胞固定（20 min，4 ℃），用不同濃度丙酮溶液按50%濃度1次、70%濃度1次、90%濃度2次、100%濃度3次的順序將細胞脫色（每次10 min）。細胞標本浸泡并封裝、過夜，制成細胞薄膜。先后用蘇木精-伊紅染色、電子染色和檸檬酸鉛染色。透射電子顯微鏡上機觀察并拍照。從每組細胞中隨機選擇3張透射電鏡照片，在每張照片的細胞中隨機選擇10個有意義的觀察視野，得到黑白圖像。為了能最大排除每張照片的拍攝光線明暗度不同對觀察者造成的干擾，能更直觀確定每張照片中HSEC內(nèi)窗孔區(qū)（透亮區(qū)域）和深色區(qū)域（篩板區(qū)、細胞內(nèi)容物區(qū)）的所占比例，以aoi圖像軟件系統(tǒng)對每張黑白圖像進行灰度值分析。軟件有0～255級灰度等級（0級為最暗的黑色：HSEC中不通透的篩板區(qū)域為黑色；255級為最亮的白色：HSEC中交換旺盛的窗孔區(qū)域為白色）。將各組細胞所得灰度值進行比較，可直觀判斷每組細胞的窗孔數(shù)量和窗孔面積（淺色區(qū)域）及不利于通透物質的篩板區(qū)（深色區(qū)域）的大小。

統(tǒng)計學處理 采用PEMS 3.1統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。所得數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示，不同組別樣本均數(shù)比較采用方差分析（F檢驗），如果涉及多重比較，采用方差分析中的Newman-Keuls檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

細胞增殖抑制率

HSC-LX2增殖抑制情況：與空白對照組（增殖抑制率0.08%）相比，瘦素激活對照組（增殖抑制率0.01%）的增殖活力顯著增強（P=0.041）。與瘦素激活對照組相比，珍珠水解液低濃度組（增殖抑制率13.50%，P=0.018）、珍珠水解液中濃度組（增殖抑制率18.40%，P=0.013）、珍珠水解液高濃度組（增殖抑制率23.60%，P=0.009）、秋水仙堿干預對照組（增殖抑制率40.60%，P=0.006）、丹參酚酸B干預對照組（增殖抑制率39.20%，P=0.008）的增殖活力均發(fā)生顯著抑制。同時，HSC-LX2的增殖活性隨著珍珠水解液的藥物濃度升高而降低（珍珠水解液低濃度組比珍珠水解液中濃度組：P=0.025；珍珠水解液中濃度組比珍珠水解液高濃度組：P=0.030）。

HSEC增殖抑制情況：與空白對照組（增殖抑制率0.05%）相比，瘦素激活對照組（增殖抑制率24.20%）的增殖活力顯著減弱（P=0.004）。與瘦素激活對照組的高增殖抑制率相比，珍珠水解液各濃度組對HSEC的增殖活力均有明顯恢復作用（低濃度組增殖抑制率19.30%，P=0.038；中濃度組增殖抑制率15.50%，P=0.027；高濃度組增殖抑制率12.60%，P=0.021）。同時，HSEC的增殖抑制率隨著藥物濃度升高而降低（珍珠水解液低濃度組比珍珠水解液中濃度組：P=0.021，珍珠水解液中濃度組比珍珠水解液高濃度組：P=0.028）。高濃度珍珠水解液的HSEC細胞增殖抑制率顯著強于秋水仙堿干預對照組（增殖抑制率20.50%，P=0.022）和丹參酚酸B干預對照組（增殖抑制率19.10%，P=0.028）。

細胞凋亡 二維散點圖檢測結果顯示，與瘦素激活對照組的總體凋亡率（早期凋亡率+晚期凋亡率）相比，各濃度珍珠水解液組的HSC-LX2的總體凋亡率均有明顯升高（低濃度組：P=0.012；中濃度組：P=0.006；高濃度組：P=0.005）。且隨著珍珠水解液藥物濃度的升高，細胞的總體凋亡率均顯著上升（珍珠水解液低濃度組比珍珠水解液中濃度組：P=0.031，珍珠水解液中濃度組比珍珠水解液高濃度組：P=0.044）。并且高濃度珍珠水解液的誘導HSC-LX2發(fā)生凋亡的能力比秋水仙堿（P=0.029）和丹參酚酸B（P=0.036）更強（表1、圖1）。

細胞窗孔及基底膜的變化情況 透射電鏡下可見空白對照組的HSEC內(nèi)密布淺色通透的窗孔區(qū)域，窗孔數(shù)量多、面積大，細胞膜為單層的薄層狀，細胞外無基底膜結構存在（圖2A）。瘦素激活對照組的HSEC細胞與空白對照組相比，細胞內(nèi)出現(xiàn)成片的深色無通透區(qū)域，窗孔區(qū)閉合、消失，細胞膜增厚，呈現(xiàn)2、3層的結構狀態(tài)，細胞外缺乏基底膜的區(qū)域，有膜狀物形成，著色深，并連接成片（圖2B）。珍珠水解液低濃度組與瘦素激活對照組相比，HSEC內(nèi)出現(xiàn)一定的淺色通透區(qū)域，窗孔數(shù)量、面積有所恢復，而較多的細胞中仍可觀察到明顯的兩層細胞膜，細胞外缺乏基底膜的區(qū)域，有膜狀物沉積，著色變淺（圖2C）。珍珠水解液中濃度組與瘦素激活對照組相比，HSEC內(nèi)的淺色通透區(qū)域出現(xiàn)進一步擴大，窗孔數(shù)量和面積明顯增高，部分細胞仍可看到兩層細胞膜結構，細胞外基底膜區(qū)域的膜狀物著色進一步變淺，不明顯，膜狀物連接成片情況消失（圖2D）。珍珠水解液高濃度組與瘦素激活對照組相比，HSEC內(nèi)的淺色通透區(qū)域面積顯著擴大，窗孔空洞密集、直徑大，細胞膜恢復為薄層結構（單層），細胞外區(qū)域、基底膜結構基本消失（圖2E）。秋水仙堿干預對照組、丹參酚酸B干預對照組與瘦素激活對照組相比，可見HSEC內(nèi)的淺色通透區(qū)域均出現(xiàn)顯著擴大，窗孔數(shù)量和面積均有明顯的恢復，部分細胞仍可觀察到兩層細胞膜，部分細胞外的基底膜區(qū)域仍可見淺色的膜狀物，膜狀物連接成片情況基本消失。與珍珠水解液高濃度組相比，秋水仙堿干預對照組、丹參酚酸B干預對照組的HSEC內(nèi)的淺色通透區(qū)域數(shù)量較少，面積較?。ㄐ⌒痛翱?、中型窗孔為主），細胞膜較厚，分層情況更為明顯，細胞外的基底膜著色更深、分布范圍更廣（圖2）。將各組HSEC細胞圖像灰度值進行比較，結果顯示瘦素激活對照組（85.25±9.52）與空白對照組（142.46±17.27）相比，灰度值明顯降低，即瘦素激活對照組細胞的窗孔區(qū)域發(fā)生明顯縮小，篩板區(qū)明顯增大（P=0.008）；與瘦素激活對照組相比，珍珠水解液低濃度組（101.64±20.37，P=0.032）、珍珠水解液中濃度組（112.37±21.16，P=0.028）、珍珠水解液高濃度組（129.90±15.89，P=0.020）灰度值均顯著上升，即各組珍珠水解液均能使HSEC的窗孔區(qū)域重新開放，使篩板區(qū)發(fā)生縮小。

討論

肝纖維化是多種慢性肝臟疾病共同具有的病理變化過程，不是一種獨立的疾病，這個過程中肝臟組織結構、肝臟功能和肝臟微循環(huán)均發(fā)生顯著變化［9］。肝竇是血液與肝細胞之間發(fā)生物質交換的關鍵屏障，在實現(xiàn)肝臟生化功能、維持肝臟正常血液循環(huán)中發(fā)揮重要作用。HSEC是肝竇最主要的細胞，其有兩個異于普通血管內(nèi)皮細胞的顯著結構特征，一是細胞表面有大量呈篩狀排列的窗孔，窗孔面積占細胞面積達6%～8%；二是細胞膜外無阻擋物，缺乏一般內(nèi)皮細胞具有的基膜結構［10］。這兩個結構特征使眾多物質得以順暢高速地通過HSEC的竇周隙，在血液與肝細胞之間進行高效交換［11］。而肝纖維化時可出現(xiàn)明顯的肝竇毛細血管化病變［12］，造成肝臟的血液流通、物質交換不順暢，嚴重影響肝臟功能和微循環(huán)狀況，成為加速肝纖維化病變發(fā)展的重要一環(huán)；而基底膜形成后又可儲存、結合大量的致纖維化細胞因子，間接促進肝纖維化的核心細胞—HSC-LX2的增殖活化過程，進一步促進肝臟纖維化的病程發(fā)展［13-15］。Majumder等［16］證實肝纖維化發(fā)生前大多都有肝竇毛細血管化改變，該改變可以顯著加速肝纖維化病程。另有研究指出HSEC的結構改變是激發(fā)HSC-LX2活化的必須條件及關鍵因素，去除肝竇毛細血管化病因后，部分纖維化病變可自行減輕［15，17］。因此，如何干預肝竇毛細血管化進程、恢復肝臟正常的微循環(huán)，對肝纖維化的防治具有重要意義。

珍珠歷代皆被譽為國寶，自秦漢時期即為皇家貢品，名揚天下。珍珠在我國入藥已有2000年歷史，是中醫(yī)治療心經(jīng)、肝經(jīng)疾病的常用藥物。珍珠主要分為東珠、西珠、南珠，歷來有“西珠不如東珠、東珠不如南珠”［18］的說法；南珠中，廣西合浦盛產(chǎn)的珍珠作為中國國家地理標志產(chǎn)品最負盛名，具有良好的活血散瘀、治療肝經(jīng)疾病的藥用價值［19］。其性寒，味甘、咸，歸心、肝經(jīng)；主產(chǎn)于廣西、廣東、海南［20］；《名醫(yī)別錄》《本草經(jīng)集》《雷公藥性賦》等醫(yī)藥古籍都對珍珠的療效有明確的記載?！侗静菥V目》云：“珍珠，安神定魄、養(yǎng)顏、活血散瘀、點目去翳、塞耳去聾、去腐生肌、催生死胎”“入厥陰肝經(jīng)”。《本草匯言》：“珍珠鎮(zhèn)心，定志，安魂，解結毒，化惡瘡，收內(nèi)潰破爛”。以上認識，對合浦珍珠干預肝竇毛細血管化進程、治療肝纖維化疾病提供了強有力的中醫(yī)理論依據(jù)［21-24］。

有報道瘦素可以病理性刺激HSEC和HSC-LX2顯著促進HSC-LX2的活化［25］，同時抑制HSEC細胞增殖，并誘發(fā)其發(fā)生凋亡［26］，對肝纖維化病理變化可起到很好的模擬效果。本研究以MTT法檢測HSEC細胞的增殖活力，結果顯示瘦素病理激活后，HSEC細胞出現(xiàn)明顯的增殖抑制情況，可見肝纖維化病變可降低HSEC的細胞增殖活力，使肝臟的物質交換和微循環(huán)狀況惡化，從而進一步加快肝纖維化病程發(fā)展。而合浦珍珠水解液干預后HSEC細胞的增殖活力恢復，呈現(xiàn)顯著的HSEC保護作用。以MTT法檢測肝纖維化的核心細胞—HSC-LX2細胞的增殖活力，結果顯示合浦珍珠水解液對HSC-LX2具有明顯的增殖抑制作用，出現(xiàn)較強的細胞毒性；隨著給藥濃度升高，細胞增殖活性明顯下降，且珍珠的細胞毒性具有劑量依賴性。推測合浦珍珠水解液干預肝纖維化的藥理作用與其能夠抑制HSC-LX2增殖活力的能力有關。

細胞生物學理論指出，某種細胞出現(xiàn)過度積聚，是由于細胞增殖增加和/或凋亡減少。本研究肝纖維化時HSC-LX2的數(shù)量和活性異常上升的原因，除了由細胞活化增殖過度引起，細胞凋亡的不足也不可排除。研究表明誘導已經(jīng)病理激活的HSC-LX2發(fā)生凋亡，不失為一種阻止HSC-LX2激活的方法，可以干預肝纖維化病程發(fā)展［27］。Friedman ［28］認為HSC-LX2發(fā)生病理活化后，很難再被逆轉回到靜息狀態(tài)，而從基因層面誘導HSC-LX2發(fā)生凋亡，成為干預肝纖維化進程的良好方法［29］。本研究用流式細胞術檢測HSC-LX2的凋亡狀況，結果顯示珍珠水解液可使HSC-LX2的早、晚期凋亡百分比明顯升高，而將給藥濃度上調(diào)后，HSC-LX2的凋亡率也隨之上升，表明珍珠水解液誘導細胞凋亡的能力具有顯著的劑量依賴性。同時，研究顯示高濃度的珍珠水解液誘導HSC-LX2發(fā)生凋亡的能力明顯高于秋水仙堿和丹參酚酸B。推測珍珠水解液的抗肝纖維化作用與其抗HSC-LX2活化增殖的能力有關，并且該能力通過誘導HSC-LX2發(fā)生凋亡達到。

本研究針對肝竇毛細血管化中的各項微結構的改變［30］進行深入研究，以透射電鏡觀察各組HSEC的情況，結果顯示被瘦素病理激活后，HSEC窗孔的數(shù)量發(fā)生明顯減少，窗孔的直徑明顯縮小，細胞外出現(xiàn)連接成片的基膜結構。結合本研究觀察到的HSC-LX2活化現(xiàn)象，推測肝纖維化病變時有明顯的肝竇毛細血管化發(fā)生，使肝臟的物質交換和微循環(huán)狀況惡化，加快肝纖維化病程發(fā)展。進行合浦珍珠水解液干預后，HSEC關閉了的窗孔被重新開放，窗孔的直徑出現(xiàn)顯著擴大。細胞外連接成片的基膜結構變得稀薄甚至消失。結合HSC-LX2活力下降及發(fā)生凋亡，可確證合浦珍珠水解液具有針對HSEC及HSC-LX2的顯著的抗肝竇毛細血管化藥理學作用，且隨著給藥濃度升高，HSEC細胞的窗孔面積恢復、基膜消失、抑制HSC-LX2細胞活力的作用明顯增強，表明珍珠水解液的抗肝竇毛細血管化作用具有劑量依賴性。

綜上，珍珠水解液的活血化瘀、干預肝纖維化作用與其顯著的抗肝竇毛細血管化、恢復HSEC增殖活力的藥理學作用密切相關。本研究對認識和開發(fā)廣西道地藥材合浦珍珠用于防治肝纖維化、血瘀型肝臟疾病具有重要的價值及意義。

參 考 文 獻

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（收稿日期：2022-07-13）

基金項目：國家自然科學基金（81960761、82060825、81960751）、廣西自然科學基金（2020GXNSFAA297119）、中醫(yī)學廣西一流學科（桂教科研〔2022〕1號）、廣西名中醫(yī)林江傳承工作室（桂中醫(yī)藥科教發(fā)〔2021〕6號）、廣西一流學科建設項目（2018XK020）、廣西研究生教育創(chuàng)新計劃項目（YCSZ2022002）和依托廣西高發(fā)傳染病中西醫(yī)結合轉化醫(yī)學重點實驗室項目；第一、二位作者對本文貢獻一致