劉垚，王展，李鑫江，劉湘銘，呂和孺，王寒梅，趙雪*

（1.中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島 266003；2.青島市中心醫(yī)院內(nèi)鏡中心，山東青島 266042）

目前研究發(fā)現(xiàn)，廣譜抗生素（甲硝唑、環(huán)丙沙星、青霉素、克林霉素）的濫用會(huì)導(dǎo)致腸道微生物群紊亂，增加炎癥性腸病和致病性細(xì)菌感染的風(fēng)險(xiǎn)，尤其是艱難梭菌感染，占抗生素相關(guān)腹瀉病例的10%～20%[1]。艱難梭菌毒素A（Clostridium difficiletoxin A，TcdA）和艱難梭菌毒素B（Clostridium difficiletoxin B，TcdB）是艱難梭菌產(chǎn)生的主要毒力因子，它可以促進(jìn)腸道炎癥[2]，從而導(dǎo)致腹瀉、假膜性結(jié)腸炎、毒性巨結(jié)腸和結(jié)腸穿孔。使用萬(wàn)古霉素和甲硝唑等抗生素進(jìn)行治療會(huì)進(jìn)一步破壞腸道微生態(tài)，進(jìn)而引發(fā)復(fù)發(fā)率更高和癥狀更嚴(yán)重的結(jié)腸炎[3-4]，給病人造成極大痛苦和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此預(yù)防艱難梭菌感染對(duì)抗生素治療的病人至關(guān)重要。目前，艱難梭菌疫苗、腸道菌群移植、益生菌、噬菌體治療法等生物治療方法均存在著一定的不足和危險(xiǎn)[5]。因此尋找一種安全、無(wú)副作用的抗艱難梭菌侵染的活性物質(zhì)是目前研究的熱點(diǎn)。

巖藻聚糖是一種天然的由巖藻糖和硫酸根組成的復(fù)雜硫酸多糖，具有抗凝血、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗炎癥、抑制細(xì)胞凋亡和抑制病毒感染等生物活性[6-8]。有研究表明，來(lái)自?shī)W氏海藻（Cladosiphon okamuranus）和墨角藻（Fucus vesiculosus）的巖藻聚糖在小鼠慢性結(jié)腸炎和葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium salt，DSS）誘導(dǎo)的急性結(jié)腸炎中表現(xiàn)出優(yōu)異的抗炎活性，同時(shí)對(duì)腸上皮屏障功能和細(xì)胞旁通透性具有良好的保護(hù)作用[9-11]。Barreto 等[12]發(fā)現(xiàn)，在由艱難梭菌毒素A 而引發(fā)的結(jié)腸炎中，巖藻聚糖可以使結(jié)腸組織中炎癥水平顯著降低。相關(guān)研究表明，巖藻聚糖的活性與其腸道菌群代謝產(chǎn)物（尤其是短鏈脂肪酸）密切相關(guān)，巖藻聚糖在結(jié)腸部位被腸道微生物酵解會(huì)產(chǎn)生乙酸、丙酸、丁酸等短鏈脂肪酸，提高腸道中的乳酸桿菌、腸桿菌、異丙戊酸桿菌和反芻菌科的數(shù)量，減少機(jī)會(huì)致病菌的數(shù)量，從而調(diào)節(jié)腸道菌群[13-15]。因此，巖藻聚糖在調(diào)節(jié)腸道菌群、預(yù)防和治療腸道炎癥方面具有較好的潛質(zhì)。但是抗生素會(huì)嚴(yán)重破壞腸道菌群，導(dǎo)致擬桿菌、鼠桿菌等多糖利用菌的相對(duì)豐度顯著下降，進(jìn)而改變巖藻聚糖在腸道中的代謝產(chǎn)物[16-17]。但目前沒(méi)有相關(guān)研究證明，在抗生素造成的腸道菌群紊亂從而導(dǎo)致的艱難梭菌腸炎中，巖藻聚糖是否仍有活性作用。

本研究使用頭孢哌酮誘導(dǎo)的腸道紊亂小鼠模型，探究巖藻聚糖對(duì)艱難梭菌感染和產(chǎn)毒、腸道菌群紊亂和炎癥因子表達(dá)的影響，旨在揭示巖藻聚糖對(duì)抗生素相關(guān)艱難梭菌結(jié)腸炎的預(yù)防作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

海帶：市售；葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品、單糖標(biāo)準(zhǔn)品、頭孢哌酮、克林霉素：美國(guó)Sigma 公司；乙腈（色譜純）：德國(guó)Merck 公司；艱難梭菌VPI 10463（ATCC43255）：美國(guó)ATCC 菌種保藏中心；萬(wàn)古霉素：大連美侖生物技術(shù)有限公司；磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）：武漢賽維爾生物科技有限公司；PowerFecalTMDNA 分離試劑盒：美國(guó)MoBio 公司；小鼠TcdA、TcdB 酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒：江蘇晶美生物科技有限公司；總RNA抽提試劑盒：上海生工生物工程股份有限公司；熒光定量轉(zhuǎn)錄試劑盒：上海Abcam 公司；TruSeqTMDNA 樣本制備試劑盒：美國(guó)Illumina 公司；醋酸、無(wú)水乙醇、硫酸鈉（Na2SO4）、氫氧化鉀（KOH）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Nicolet-Nexus 470 型傅里葉紅外光譜儀、Q Exactive Plus LCMS 質(zhì)譜儀、Ul-tiMate 3000 型高效液相色譜儀、電噴霧LTQ-Orbitrap XL 型質(zhì)譜儀、IonPac AS11-HC 分離柱（4 mm×250 mm）：美國(guó)Thermo Fisher 公司；1260 型高效液相色譜儀器、ZORBAX EC-C18 分離柱（4.6 mm×150 mm，2.7 μm）：美國(guó)Agilent 公司；ICS-2000 型離子色譜儀：美國(guó)Dionex 公司；TSK-gel G3000 PWx 分析柱（8.0 mm×300 mm，10 μm）：日本東曹株式會(huì)社；855-AC 型厭氧操作箱：美國(guó)Plas-Labs 公司；Eclipse E10 正置光學(xué)顯微鏡：日本Nikon 公司；SIGMA 1-1 型高速冷凍離心機(jī)：美國(guó)Sigma 公司；FQD-96C 型熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：杭州博日科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 巖藻聚糖的制備

以海帶為原料，用酸浸泡、熱水提取和醇沉淀，得到巖藻聚糖粗糖[18]，經(jīng)10 kDa 的透析袋透析，直至透析液pH 值為7 左右，收集透袋內(nèi)液體，冷凍干燥，得到試驗(yàn)所需巖藻聚糖。

1.3.2 巖藻聚糖的化學(xué)性質(zhì)檢測(cè)

1.3.2.1 巖藻聚糖分子量的測(cè)定

采用高效凝膠排阻色譜法（high perfomance size exclusion chromatography，HPSEC）測(cè)定巖藻聚糖的分子量。高效液相色譜儀為Agilent 1260，分析柱為TSK-gel G3000 PWx（8.0 mm×300 mm，10 μm），流動(dòng)相為0.1 mol/L Na2SO4。使用分子量為5 220、11 600、48 600、147 600、273 000 Da 的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品，以葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品分子量的對(duì)數(shù)（lgM）和保留時(shí)間（t）作圖，得到回歸方程（y=-0.156 1x+7.181 6，R2=0.980 5），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中硫酸多糖的重均分子量（weight-average molecular weight，Mw）、數(shù)均分子量（number-average molecular weight，Mn）和分散系數(shù)[19]。分散系數(shù)的計(jì)算公式如下。

I=W/N

式中：I為分散系數(shù)；W為重均分子量，kDa；N為數(shù)均分子量，kDa。

1.3.2.2 巖藻聚糖硫酸根含量的測(cè)定

采用高效陰離子交換色譜法測(cè)定巖藻聚糖中硫酸根含量，分離柱為IonPac AS11-HC（4 mm×250 mm），淋洗液及流速為9 mmol/L KOH、1.0 mL/min。

1.3.2.3 巖藻聚糖單糖組成的測(cè)定

采用PMP 柱前衍生高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）法測(cè)定巖藻聚糖的單糖組成，色譜柱為分離柱ZORBAX EC-C18（4.6 mm×150 mm，2.7 μm）。流動(dòng)相A 為18%乙腈（0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液溶解），流動(dòng)相B 為35%乙腈（0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液溶解）[20]。

1.3.2.4 巖藻聚糖的紅外光譜掃描

將KBr 在110 ℃烘箱內(nèi)烘干5 h 徹底脫水后，與巖藻聚糖樣品磨粉、壓制成片，利用傅里葉紅外光譜掃描儀掃描4 000～500 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)的光譜吸收值[21]。

1.3.3 艱難梭菌腸炎小鼠模型的建立和給藥方式

無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)，將艱難梭菌加入腦心浸液肉湯培養(yǎng)基（brain heart infusion ，BHI）中，于37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h 后復(fù)蘇。將復(fù)蘇菌懸液加入BHI 中進(jìn)行37 ℃厭氧培養(yǎng)36 h 活化。將菌液進(jìn)行1 000×g離心10 min，取沉淀，加入生理鹽水重懸成4×107cfu/mL 懸濁液，待用。

六周齡的SPF 級(jí)C57BL/6J 雌性小鼠標(biāo)準(zhǔn)喂食適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d 后開(kāi)始正式實(shí)驗(yàn)。小鼠隨機(jī)分為6 組，分別為空白組、艱難梭菌模型組（簡(jiǎn)稱模型組）、萬(wàn)古霉素組、100、300、500 mg/kg 巖藻聚糖。每組8 只，每籠內(nèi)不超過(guò)4 只，每籠的體質(zhì)量為（18±2）g。本研究中所有方案和程序由中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理倫理委員會(huì)的審批通過(guò)。

1～10 d，空白組、模型組和萬(wàn)古霉素組口服10 mL/kg純凈水，巖藻聚糖組分別口服100、300 和500 mg/kg的巖藻聚糖。11～20 d，每次給予巖藻聚糖1 h 后，模型組和萬(wàn)古霉素組、巖藻聚糖組分別口服280 mg/kg 頭孢哌酮溶液，而空白組口服0.2 mL 超純水。第21 天，休整1 d，空白組、模型組和萬(wàn)古霉素組口服0.2 mL 超純水，而巖藻聚糖組繼續(xù)口服0.2 mL 100、300、500 mg/kg 的巖藻聚糖。第22 天，模型組、萬(wàn)古霉素組、巖藻聚糖組注射100 mg/kg 克林霉素。注射克林霉素1 h 后，巖藻聚糖組繼續(xù)口服100、300 和500 mg/kg 的巖藻聚糖。第23 天，模型組、萬(wàn)古霉素組、巖藻聚糖組口服0.2 mL 4×107cfu/mL艱難梭菌菌液，建立艱難梭菌腸炎模型。24～28 d，萬(wàn)古霉素組口服0.2 mL 50 mg/kg 的萬(wàn)古霉素，其余各組口服0.2 mL 超純水。第29 天，處死各組小鼠[22]。

在艱難梭菌腸炎小鼠模型的建立期間，每日觀察小鼠狀態(tài)、體質(zhì)量，在給予艱難梭菌后，觀察小鼠癥狀、體質(zhì)量、存活率。艱難梭菌侵染5 d 后，用乙醚安樂(lè)死小鼠。

1.3.4 結(jié)腸組織病理學(xué)觀察

取小鼠結(jié)腸組織1 cm 放入4%甲醛固定24 h，石蠟切片脫蠟至水，蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin staining，H＆E）染色處理，脫水封片，正置光學(xué)顯微鏡鏡檢，在成像系統(tǒng)（NIKON DS-U3）進(jìn)行圖像采集分析[17，22]。

1.3.5 盲腸內(nèi)容物中艱難梭菌毒素A 和毒素B 的測(cè)定

用1×磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）稀釋收集到的小鼠50～100 mg 盲腸內(nèi)容物，1 800×g離心20 min 后收集上清液。根據(jù)小鼠毒素TcdA 和TcdB 的酶聯(lián)免疫吸附試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定毒素TcdA 與TcdB 的水平。

1.3.6 結(jié)腸組織中F4/80 和Ly-6G 的熒光雙標(biāo)檢測(cè)

取小鼠50～100 mg 結(jié)腸組織用4%甲醛固定24 h后，石蠟包埋切片，脫蠟至水后進(jìn)行抗原修復(fù)，雙氧水、血清封閉后，加入第一種一抗、對(duì)應(yīng)的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗、Cyanine 3 Tyramide CY3-TSA，在中火8 min 停火8 min 轉(zhuǎn)中低火7 min 的條件下進(jìn)行微波處理。加入第二種一抗和對(duì)應(yīng)的二抗。利用4’6-二脒基-2 苯基吲哚（4'6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）復(fù)染細(xì)胞核，避光室溫孵育10 min 后，加入自發(fā)熒光淬滅劑5 min，流水沖洗10 min。甩干后，用抗熒光淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.3.7 結(jié)腸組織中炎癥因子mRNA 表達(dá)的測(cè)定

取小鼠結(jié)腸組織50～100 mg，采用Trizol 法提取結(jié)腸組織中的總mRNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，獲得cDNA。以逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA 為模板，實(shí)時(shí)熒光定量PCR（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）以GAPDH基因?yàn)槎績(jī)?nèi)參，使用熒光定量試劑盒分別對(duì)促炎癥細(xì)胞因子腫瘤壞死因子-α（tumour necrosis factor alpha，TNF-α）、干擾素-γ（interferon gama，IFN-γ）、白介素-1β（interleukin 1 beta，IL-1β）、白介素-6（interleukin 6，IL-6）和抑炎癥因子白介素-4（interleukin 4，IL-4）、白介素-10（interleukin 10，IL-10）進(jìn)行相對(duì)定量并統(tǒng)計(jì)。RT-PCR 反應(yīng)體系：cDNA 1 μg；primer 1 0.8 μL；primer 2 0.8 μL；SYBR Green I 2 μL；dd H2O 加至20 μL；40 個(gè)循環(huán)數(shù)：95 ℃15 s、60 ℃60 s。小鼠引物的序列如表1所示。炎癥相關(guān)基因表達(dá)的相對(duì)定量根據(jù)2-ΔCt法[23]。

1.3.8 小鼠盲腸菌群結(jié)構(gòu)的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[24]的方法，取小鼠盲腸內(nèi)容物0.1 mg置于無(wú)菌管中，使用PowerFecalTMDNA 分離試劑盒提取結(jié)腸基因組DNA，純化后測(cè)序。使用TruSeqTMDNA樣本制備試劑盒中提供的說(shuō)明生成測(cè)序文庫(kù)。文庫(kù)質(zhì)量檢測(cè)后，在Illumina MiSeqPE250 平臺(tái)進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序。原始DNA 片段用FLASH（v1.2.7）進(jìn)行讀取、合并，QIIME2 （2019.4）軟件去噪，Vsearch （v2.13.4_ linux_x86_64），cutadapt（v2.3）軟件在97%相似度水平對(duì)高質(zhì)量序列聚類。使用RDP 分類器（v2.2），應(yīng)用70%置信閾值分析每個(gè)16S rRNA 基因序列的分類。通過(guò)對(duì)去除singleton 后的特征表進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，實(shí)現(xiàn)各樣本在門、綱、目、科、屬、種6 個(gè)分類水平上的組成分布可視化。利用QIIME2（2019.4）軟件進(jìn)行alpha 多樣性分析。使用R packages 2.15 和VennDiagram_（1.6.20）生成韋恩圖。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示。利用SPASS Statistics（v22）進(jìn)行單向方差分析（ANOVA）分析各組間的差異，使用Tukey 進(jìn)行顯著性差異檢驗(yàn)，顯著性設(shè)置為p<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 巖藻聚糖化學(xué)性質(zhì)檢測(cè)結(jié)果

巖藻聚糖的高效凝膠排阻色譜圖如圖1A所示，傅里葉紅外光譜官能團(tuán)分析結(jié)果如圖1B所示。

圖1 巖藻聚糖化學(xué)性質(zhì)檢測(cè)結(jié)果Fig.1 The chemical properties results of fucoidan

由圖1A 可知，巖藻聚糖的重均分子量（Mw）為126.65 kDa，數(shù)均分子量（Mn）為28.46 kDa，其分散系數(shù)為4.45。由圖1B 可知，在1 250 cm-1（S=O 拉伸振動(dòng)）和845 cm-1（C-O-S 拉伸振動(dòng)）處有吸收峰，證實(shí)巖藻聚糖中巖藻糖殘基存在大量的硫酸根。

巖藻聚糖硫酸根含量及單糖組成見(jiàn)表2。

表2 巖藻聚糖硫酸根含量和單糖組成結(jié)果Table 2 The results of fucoidan sulfate content and monosaccharide composition %

由表2 可知，巖藻聚糖中含有硫酸根（25.93±0.17）%，單糖組成結(jié)果得出，巖藻聚糖中巖藻糖（52.57±2.10）%和半乳糖（26.41±3.31）%的含量較高，還含有少量的甘露糖、葡萄糖醛酸、鼠李糖、木糖、葡萄糖、氨基葡萄糖、氨基半乳糖。

2.2 巖藻聚糖對(duì)艱難梭菌腸炎小鼠腹瀉程度的影響

巖藻聚糖對(duì)艱難梭菌腸炎小鼠的體質(zhì)量和結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)的影響見(jiàn)圖2。

圖2 巖藻聚糖對(duì)艱難梭菌腸炎小鼠的體質(zhì)量和結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)的影響Fig.2 Effects of fucoidan on the bodyweight and histopathology of C.difficile-infected mice

實(shí)驗(yàn)期間，正常組小鼠給予艱難梭菌后，沒(méi)有出現(xiàn)腹瀉的癥狀，體質(zhì)量正常。說(shuō)明小鼠體內(nèi)正常的腸道菌群對(duì)感染艱難梭菌有很好的防御作用，不會(huì)發(fā)生艱難梭菌侵染和腹瀉。模型組小鼠在服用頭孢哌酮10 d 后，體質(zhì)量沒(méi)有明顯下降，精神狀態(tài)良好。但是，在艱難梭菌侵染第2 天，8 只小鼠均出現(xiàn)腹瀉癥狀，并伴隨體質(zhì)量急劇下降，糞便呈水樣，毛發(fā)豎立，精神狀態(tài)不佳，然而未出現(xiàn)死亡。說(shuō)明頭孢哌酮破壞了腸道菌群，造成了艱難梭菌侵染和腹瀉。在服用10 d 頭孢哌酮期間，同時(shí)分別給予小鼠10 d 100、300、500 mg/kg 的巖藻聚糖，然后再進(jìn)行艱難梭菌侵染。在艱難梭菌侵染后第2 天，100 mg/kg 巖藻聚糖組的8 只小鼠中，有7 只小鼠出現(xiàn)了腹瀉。而在300、500 mg/kg 巖藻聚糖組的小鼠中，分別有3 只和1 只出現(xiàn)腹瀉癥狀，其余小鼠均不腹瀉，體質(zhì)量保持穩(wěn)定；在艱難梭菌侵染后第5天，模型組小鼠腹瀉繼續(xù)加重，體質(zhì)量下降。而萬(wàn)古霉素治療5 d 后，僅有2 只小鼠輕微腹瀉，6 只小鼠由腹瀉轉(zhuǎn)為軟便，腹瀉情況得到緩解。100 mg/kg 巖藻聚糖組的小鼠中，仍有7 只小鼠嚴(yán)重腹瀉，情況并未好轉(zhuǎn)。而300、500 mg/kg 巖藻聚糖組小鼠的腹瀉情況明顯好轉(zhuǎn)，都僅有1 只小鼠產(chǎn)生腹瀉。說(shuō)明巖藻聚糖可以很好地緩解由感染艱難梭菌引起的腹瀉癥狀。

由圖2A 可知，30 d 時(shí)，與模型組相比，萬(wàn)古霉素組小鼠體質(zhì)量顯著上升（p＜0.05），但仍有2 只小鼠輕微腹瀉。與模型組相比，口服300、500 mg/kg 巖藻聚糖均能夠顯著提高腸炎小鼠的體質(zhì)量（p＜0.05），而100 mg/kg巖藻聚糖對(duì)小鼠體質(zhì)量沒(méi)有顯著影響（p>0.05）。

采用H＆E 染色技術(shù)分析巖藻聚糖對(duì)結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)的保護(hù)作用，由圖2B 可知，正常組小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)表現(xiàn)為組織黏膜、隱窩和黏膜下層完整，杯狀細(xì)胞排列整齊，無(wú)或稍有炎癥浸潤(rùn)現(xiàn)象。而模型組小鼠結(jié)腸組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)嚴(yán)重，并伴隨著隱窩丟失，杯狀細(xì)胞明顯減少，上皮層不完整。說(shuō)明艱難梭菌侵染造成結(jié)腸腸黏膜嚴(yán)重炎癥和黏膜結(jié)構(gòu)損傷。與模型組相比，萬(wàn)古霉素組小鼠結(jié)腸組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯緩解，隱窩較為完整，杯狀細(xì)胞數(shù)量增加并且排列整齊。300、500 mg/kg 巖藻聚糖組小鼠結(jié)腸組織中杯狀細(xì)胞明顯增多，且排列整齊，隱窩、上皮層和黏膜下層相對(duì)完整，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況明顯緩解。100 mg/kg 巖藻聚糖組小鼠結(jié)腸組織中杯狀細(xì)胞明顯增多，但是上皮層和黏膜仍然有嚴(yán)重?fù)p傷。結(jié)果表明，預(yù)先口服300、500 mg/kg 巖藻聚糖可以有效地減輕艱難梭菌造成的腸道黏膜損傷和炎癥浸潤(rùn)。

2.3 巖藻聚糖對(duì)艱難腸炎小鼠腸道菌群的影響

上述結(jié)果表明，口服300 mg/kg 巖藻聚糖對(duì)艱難梭菌誘導(dǎo)的結(jié)腸炎具有顯著的保護(hù)作用。利用16s RNA 基因檢測(cè)技術(shù)，進(jìn)一步分析300 mg/kg 巖藻聚糖對(duì)腸道菌群的豐度和結(jié)構(gòu)的影響。實(shí)驗(yàn)中收集了一個(gè)由1 014 883 個(gè)序列組成的數(shù)據(jù)集，每個(gè)樣品的平均讀數(shù)為70 486±15 264。巖藻聚糖對(duì)艱難梭菌腸炎小鼠盲腸菌群多樣性的影響見(jiàn)表3。

表3 巖藻聚糖對(duì)艱難梭菌腸炎小鼠盲腸菌群多樣性的影響Table 3 Analysis of fucoidan on microbial diversity in cecum of C.difficile infected mice

由表3所示，Good's coverage 指數(shù)可以看出測(cè)序?qū)θ郝渲形锓N的覆蓋度很高，幾乎沒(méi)有未檢測(cè)出的物種。與正常組相比，模型組OTUs 由7570 下降至699，約為正常組的9.2%，且Chao 1 指數(shù)、Observed_species指數(shù)、Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)均顯著下降（p＜0.05），這說(shuō)明抗生素的使用和艱難梭菌感染造成腸道菌群完全紊亂。而口服萬(wàn)古霉素和巖藻聚糖5 d 后，OTUs 分別上升至933（正常組的12.3%）和1 146（正常組的15.1%）。與模型組相比，萬(wàn)古霉素組和巖藻聚糖組Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)均顯著上升（p＜0.05）。但是，巖藻聚糖組小鼠的OTUs 與正常組相差較大，說(shuō)明雖然巖藻聚糖對(duì)腸道菌群有一定程度的保護(hù)作用，但是不能夠使腸道菌群的豐度和多樣性很好的恢復(fù)。

從門水平觀察巖藻聚糖巖藻聚糖對(duì)腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

由圖3 可知，與正常組相比，模型組的厚壁菌門（88.28%）和變形菌門（11.28%）的相對(duì)豐度明顯上升，而擬桿菌門（0.30%）明顯下降，軟壁菌門和埃普西隆桿菌門完全消失。與模型組相比，萬(wàn)古霉素治療使厚壁菌門（13.17%）的相對(duì)豐度明顯下降，變形菌門（38.56%）和擬桿菌門（12.21%）明顯上升，并且出現(xiàn)了較高豐度的軟壁菌門（14.57%）和埃普西隆桿菌門（21.19%）。與模型組相比，預(yù)先口服巖藻聚糖可以使厚壁菌門（52.85%）的相對(duì)豐度明顯下降，與正常組厚壁菌門的相對(duì)豐度相似，菌群中變形菌門上升至20.1%，擬桿菌門（0.65%）也略有上升。

圖3 巖藻聚糖在門水平上對(duì)艱難梭菌腸炎小鼠盲腸內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)的影響（n=5）Fig.3 Effects of fucoidan on the structure of the cecal microbiota in C.difficile-infected mice at the phylum level（n=5）

進(jìn)一步從屬水平分析巖藻聚糖對(duì)腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響，對(duì)不同組小鼠的相對(duì)豐度最高的50 個(gè)屬進(jìn)行分析比較，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 巖藻聚糖在屬水平上對(duì)艱難梭菌腸炎小鼠盲腸菌群結(jié)構(gòu)的影響Fig.4 Effects of fucoidan on the structure of the cecal microbiota in C.difficile-infected mice at the genus level

由圖4 可知，正常組盲腸中鼠李桿菌和毛螺菌NK4A136 為主要優(yōu)勢(shì)菌，分別占30.52%和17.38%，還含有乳酸桿菌（7.41%）、布勞特氏菌屬（2.09%）、瘤胃球菌_UCG-014（1.72%）、脫硫弧菌（1.53%）、Candidatus_Saccharimonas（1.31%）、另枝菌屬（1.26%）、普瑞沃特菌屬（1.20%）、腸桿菌屬（1.09%）等。服用頭孢哌酮和艱難梭菌侵染后，小鼠盲腸中與腸炎相關(guān)的腸球菌（45.53%）、艱難梭菌（15.71%）、梭菌_vadinBB60（15.18%）、變形桿菌屬（10.44%）變成了優(yōu)勢(shì)菌屬。而有益菌鼠李桿菌（0.08%）、毛螺菌NK4A136（0.02%）、瘤胃球菌_UCG-014（0.01%）均明顯下降，脫硫弧菌、普瑞沃特菌屬和Candidatus_Saccharimonas完全消失。此外，艱難梭菌的相對(duì)豐度增長(zhǎng)到15.71%，這說(shuō)明艱難梭菌在盲腸中大量繁殖。

萬(wàn)古霉素治療5 d 后，發(fā)現(xiàn)小鼠盲腸中優(yōu)勢(shì)菌變?yōu)橛拈T螺桿菌（21.19%）、Parasutterella（17.83%）、支原體（14.56%）、擬桿菌（11.99%）、乳酸桿菌（9.25%）、大腸桿菌志賀菌（7.67%）、腸桿菌（2.07%）、Erysipelatoclostridium（1.82%），而艱難梭菌未檢出。以上結(jié)果表明，萬(wàn)古霉素雖然可以有效殺死艱難梭菌，但是會(huì)造成幽門螺旋桿菌、大腸桿菌志賀菌等有害菌的增長(zhǎng)，小鼠菌群的單一也會(huì)造成支原體感染。

預(yù)先口服巖藻聚糖使盲腸內(nèi)腸道菌群的OUTs上升至1 146，細(xì)菌結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化。其中支原體（25.61%）、Parasutterella（18.05%）、活潑瘤胃球菌（13.46%）、乳酸桿菌（8.17%）、布勞特氏菌屬（6.28%）、腸球菌（5.80%）、Erysipelatoclostridium（5.44%）成為優(yōu)勢(shì)菌。與模型組相比，腸炎相關(guān)致病菌腸球菌和艱難梭菌的相對(duì)豐度明顯下降，而有益菌扭鏈瘤胃球菌（0.47%）、鼠李桿菌（0.39%）、高氏瘤胃球菌（0.29%）、羅姆布茨菌（0.18%）、不動(dòng)桿菌（0.13%）、假交替單胞菌屬（0.12%）的相對(duì)豐度明顯上升。以上結(jié)果說(shuō)明，口服巖藻聚糖可以提高有益菌的相對(duì)含量，降低腸炎和腹瀉相關(guān)的有害細(xì)菌的相對(duì)含量。但是，口服巖藻聚糖無(wú)法避免頭孢哌酮對(duì)腸道細(xì)菌的傷害，腸道菌群的豐度和多樣性均明顯低于正常組小鼠，這說(shuō)明巖藻聚糖只能有限地保護(hù)腸道菌群的豐度和多樣性。

2.4 巖藻聚糖對(duì)艱難梭菌腸炎小鼠盲腸內(nèi)艱難梭菌毒素A 和毒素B 含量的影響

圖5 顯示了300 mg/kg 巖藻聚糖對(duì)艱難梭菌腸炎小鼠盲腸中毒素TcdA 和TcdB 水平的影響。

圖5 巖藻聚糖對(duì)艱難梭菌腸炎小鼠盲腸中毒素Tcd A 和Tcd B含量的影響Fig.5 Effect of fucoidan on Tcd A and Tcd B toxins content in the cecum of mice with C.difficile colitis

由圖5 可知，與正常組相比，小鼠艱難梭菌感染后盲腸中毒素TcdA 和TcdB 水平顯著升高（p＜0.05），說(shuō)明模型組小鼠遭到了艱難梭菌的侵染，并且產(chǎn)生毒素。與模型組相比，萬(wàn)古霉素和巖藻聚糖巖藻聚糖均可以使毒素TcdA 和TcdB 水平顯著降低（p＜0.05），說(shuō)明口服萬(wàn)古霉素和巖藻聚糖均可以抑制盲腸中艱難梭菌毒素TcdA 和TcdB 的產(chǎn)生。

2.5 巖藻聚糖對(duì)艱難梭菌腸炎小鼠結(jié)腸組織中巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)的影響

圖6 為巖藻聚糖對(duì)結(jié)腸中F4/80 和Ly-6G 水平的影響。

圖6 巖藻聚糖對(duì)艱難梭菌腸炎小鼠結(jié)腸中F4/80 和Ly-6G 水平的影響Fig.6 Effect of fucoidan on the level of F4/80 and Ly-6G in C.difficile infected mice

通過(guò)免疫熒光雙標(biāo)法檢測(cè)巨噬細(xì)胞標(biāo)記物F4/80和中性粒細(xì)胞標(biāo)記物L(fēng)y-6G 相對(duì)熒光強(qiáng)度，來(lái)反映巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)情況。由圖6 可知，與正常組相比，模型組小鼠結(jié)腸組織中F4/80 和Ly-6G 的相對(duì)熒光強(qiáng)度顯著增加（p＜0.05），說(shuō)明艱難梭菌侵染導(dǎo)致巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞數(shù)量增加。與模型組相比，萬(wàn)古霉素和巖藻聚糖組小鼠結(jié)腸組織的F4/80 和Ly-6相對(duì)熒光強(qiáng)度均顯著降低（p＜0.05），其中，巖藻聚糖組F4/80 明顯低于萬(wàn)古霉素組，說(shuō)明巖藻聚糖可以顯著抑制艱難梭菌侵染導(dǎo)致的結(jié)腸組織中巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)，尤其對(duì)巨噬細(xì)胞有很好的抑制作用。

2.6 巖藻聚糖對(duì)艱難梭菌腸炎小鼠結(jié)腸組織中炎癥因子mRNA 相對(duì)表達(dá)水平的影響

圖7 為q-PCR 對(duì)4 種促炎癥因子TNF-α、IL-1β、IFN-γ、IL-6以及2 種抗炎因子IL-10、IL-4的mRNA表達(dá)的影響。

圖7 巖藻聚糖對(duì)艱難梭菌腸炎小鼠盲腸組織中炎癥因子mRNA 水平表達(dá)的影響Fig.7 Effect of fucoidan on the mRNA expression of inflammatory cytokines in the colon of C.difficile infected mice

由圖7 可知，與正常組相比，模型組結(jié)腸組織中TNF-α、IL-1β、IFN-γ 3 種炎癥因子mRNA 表達(dá)量均顯著升高（p＜0.05），但是炎癥因子IL-6的mRNA 表達(dá)量沒(méi)有顯著變化。與模型組相比，萬(wàn)古霉素組TNF-α 和IL-1β 的mRNA 表達(dá)量均顯著下降（p＜0.05），IL-4的mRNA 表達(dá)量顯著上升，而IFN-γ 和IL-6的mRNA表達(dá)量沒(méi)有顯著差異。這說(shuō)明萬(wàn)古霉素有一定的抑制結(jié)腸炎癥因子基因過(guò)度表達(dá)的作用。與模型組相比，巖藻聚糖組小鼠結(jié)腸組織中的TNF-α、IL-1β、IFN-γ 和IL-64 種炎癥因子的mRNA 表達(dá)量均顯著下降（p＜0.05），這說(shuō)明預(yù)先口服巖藻聚糖可以有效地抑制艱難梭菌所造成的結(jié)腸炎癥因子的過(guò)度表達(dá)。與正常組相比，模型組結(jié)腸中抗炎癥因子IL-10下降，IL-4無(wú)顯著性變化（p>0.05）。與模型組相比，萬(wàn)古霉素組IL-10上升顯著（p＜0.05），且高于正常組，而IL-4無(wú)顯著性變化（p>0.05）。與模型組相比，巖藻聚糖組IL-10和IL-4的mRNA 表達(dá)量均顯著增加，尤其是IL-4的表達(dá)量顯著高于正常組。這說(shuō)明預(yù)先口服巖藻聚糖可以顯著提高抗炎因子IL-10和IL-4的基因表達(dá)。

3 討論

頭孢哌酮是目前臨床常用的抗生素，會(huì)造成的腸道微生物紊亂的時(shí)間長(zhǎng)達(dá)4～6 個(gè)月[22]。本研究利用頭孢哌酮誘導(dǎo)的腸道菌群紊亂小鼠模型，評(píng)價(jià)巖藻聚糖預(yù)防艱難梭菌侵染和腸炎的活性。在服用頭孢哌酮期間，每日口服300 mg/kg 巖藻聚糖可以顯著緩解艱難梭菌引起的腹瀉，結(jié)腸黏膜損傷和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，降低艱難梭菌、腸球菌的相對(duì)豐度，增加盲腸中的有益細(xì)菌Parasutterella、活潑瘤胃球菌、乳酸桿菌和布勞特氏菌屬，并使艱難梭菌毒素TcdA 和TcdB 含量下降。這說(shuō)明巖藻聚糖能夠抑制艱難梭菌侵染和毒素，調(diào)整腸道菌群結(jié)構(gòu)。但是，巖藻聚糖組小鼠的腸道菌群的OUTs 從9.2%增加到15.1%，菌群多樣性仍然很低，而且支原體和腸球菌等有害細(xì)菌的相對(duì)豐度仍然很高，說(shuō)明巖藻聚糖對(duì)腸道菌群的保護(hù)有限，并不能恢復(fù)正常的腸道菌群。有研究表明，巖藻聚糖可以通過(guò)與細(xì)胞表面硫酸乙酰肝素（heparan sulfate，HS）競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合病毒來(lái)抑制細(xì)胞的病毒感染[8]。由此推測(cè)巖藻聚糖可以直接抑制艱難梭菌對(duì)腸上皮細(xì)胞的感染，或抑制艱難梭菌毒素的產(chǎn)生，從而預(yù)防艱難梭菌腸炎。

本研究發(fā)現(xiàn)，口服巖藻聚糖在艱難梭菌腸炎小鼠中表現(xiàn)出很好的抗炎癥作用，顯著降低結(jié)腸組織中巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，抑制TNF-α、IFN-γ 和IL-1β 基因過(guò)度表達(dá)，促進(jìn)抗炎因子IL-10和IL-4的基因表達(dá)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與巖藻聚糖抑制DSS 和艱難梭菌毒素A 誘導(dǎo)的腸道炎癥效果相似[10，12]。綜合研究結(jié)果推測(cè)，巖藻聚糖預(yù)防頭孢哌酮誘導(dǎo)的艱難梭菌感染和結(jié)腸炎的機(jī)制，與其直接抑制艱難梭菌侵染和毒素產(chǎn)生、抗炎活性、保護(hù)腸道黏膜結(jié)構(gòu)有關(guān)。因此，巖藻多糖有潛力成為抗生素治療患者避免艱難梭菌相關(guān)性結(jié)腸炎的功能性食品。

4 結(jié)論

在口服頭孢哌酮導(dǎo)致的腸道菌群失調(diào)小鼠中，預(yù)先口服巖藻聚糖可以有預(yù)防艱難梭菌侵染和毒素TcdA 和TcdB 的產(chǎn)生，同時(shí)，巖藻聚糖可有效抑制盲腸中結(jié)腸炎相關(guān)細(xì)菌艱難梭菌和腸球菌等細(xì)菌的相對(duì)豐度，促進(jìn)有益菌的生長(zhǎng)，從而預(yù)防艱難梭菌誘導(dǎo)的腹瀉和結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)損傷，但是不能夠完全恢復(fù)腸道菌群的豐度和結(jié)構(gòu)。巖藻聚糖具有較好的抗炎活性，能夠抑制炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，下調(diào)炎性因子的基因表達(dá)，上調(diào)抗炎因子的基因表達(dá)。因此，巖藻聚糖在預(yù)防抗生素相關(guān)艱難梭菌腸炎方面具有很好的潛質(zhì)。