劉思嘉，柴笑玉，程書梅，時子丹，田寒雪，張志勝，饒偉麗*，王媛

（1.河北農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，河北保定 071001；2.衡水志豪畜牧科技有限公司，國家羊肉加工技術(shù)研發(fā)專業(yè)中心，河北衡水 053000）

改善肉制品的感官屬性以滿足消費者對優(yōu)質(zhì)肉質(zhì)的需求，是肉類科學和技術(shù)領(lǐng)域面臨的一個持久挑戰(zhàn)。結(jié)締組織（intramuscular connective tissue，IMCT）是肌肉的重要組成部分，是影響肉品品質(zhì)變化的重要因素之一。在過去的幾十年，嫩度是消費者對牛肉等肉品感官品質(zhì)總體可接受度最重要的貢獻指標，所以大多數(shù)研究更加關(guān)注IMCT 對肉品嫩度變化的影響[1-2]。但有研究表明，牛肉整體接受度最重要的貢獻者已經(jīng)由嫩度轉(zhuǎn)變?yōu)轱L味（39%），其次是嫩度（31%）和多汁性（24%）[3]。對于感官品質(zhì)得分較高的牛排來說，每一個感官指標都會有較高的分數(shù)，對總體接受度的貢獻也更高。因此，本文除關(guān)注IMCT 和肉品嫩度的關(guān)系外，也關(guān)注IMCT 與感官品質(zhì)其他指標的關(guān)系，如與多汁性、風味的關(guān)系，并總結(jié)IMCT 影響肉品多汁性、質(zhì)構(gòu)與風味的可能原因。

TMCT 的主要成分是膠原蛋白，其余包括彈性蛋白、蛋白多糖和糖蛋白等成分，但后者含量較少。本文聚焦于膠原蛋白，總結(jié)加熱工藝、動物年齡、動物種類等對膠原蛋白收縮、熱熔和交聯(lián)等熱特性的影響；分析蛋白聚糖降解和膠原蛋白熱特性的關(guān)系；分析原料肉宰后成熟過程中IMCT 相關(guān)內(nèi)源性降解體系和膠原蛋白熱特性的關(guān)系，以期能夠發(fā)現(xiàn)可以調(diào)控肉品中內(nèi)源酶活性和膠原蛋白熱特性，改善IMCT 收縮和溶解等熱特性的路徑，為提高肉品的感官品質(zhì)指明研究方向。

1 結(jié)締組織熱特性及其對肉品感官品質(zhì)的影響

IMCT 由肌內(nèi)膜、肌束膜和肌外膜3 個主要的組件構(gòu)成，其在加熱時的特性變化對肌肉加工過程中的品質(zhì)變化有重大貢獻[4]。除了對肉的嫩度有直接貢獻[5-6]，IMCT 還通過其在烹飪過程中的收縮作用擠出加熱時肌原纖維中釋放出的液體，間接影響肉品的多汁性、風味和質(zhì)構(gòu)[7]。下文總結(jié)了在不同溫度區(qū)間加熱時，IMCT影響肉品品質(zhì)的機制，其中存在的差異可能與文獻中動物種類、肌肉部位、加熱工藝等因素有關(guān)，需要更多的研究來闡明IMCT 在加熱時的熱特性變化規(guī)律。

在加熱過程中，當溫度達到35～45 ℃時，肌纖維中肌球蛋白發(fā)生變性，導(dǎo)致肌肉發(fā)生垂直于肌纖維方向的橫向收縮[8]，使肌原纖維中水分向胞漿遷移，單位面積中肌纖維的數(shù)量增加，肉品嫩度變差。肉中的脂肪也會在此溫度下發(fā)生溶解，此時由于自由水和液態(tài)脂肪的增加，肉品中汁液開始向肉品外流動。

溫度達到40～55 ℃時，肌束膜拉伸斷裂強度大幅度增加。Christensen 等[7]認為這是由于部分膠原蛋白在50 ℃左右發(fā)生變性，彎曲的膠原蛋白變直，導(dǎo)致單位寬度膠原纖維的有效濃度增加，從而使其承載力增加。Wang 等[9]通過原位成像技術(shù)，發(fā)現(xiàn)在此溫度下僅有肌束膜中膠原蛋白發(fā)生了變性，而肌內(nèi)膜中的膠原蛋白并未發(fā)生變性，這可能是由于肌束膜與肌內(nèi)膜中膠原蛋白的類型不同。在此溫度區(qū)間，肉品剪切力值增加，但從55 ℃左右開始下降。并且肌原纖維中水分繼續(xù)向外遷移，脂肪細胞中脂肪繼續(xù)融化，肉品的汁液流失程度增加。

溫度達到55～64 ℃時，肌肉開始平行于肌纖維方向的縱向收縮，這極有可能是IMCT 收縮造成的。研究表明，在50 ℃結(jié)締組織開始發(fā)生縱向收縮[10]，而分離的肌原纖維碎片在75 ℃左右才開始發(fā)生縱向收縮[8，11]。但通過使用掃描電鏡對肌束膜進行觀察發(fā)現(xiàn)，當處理溫度為60 ℃，加熱時間在60 min 以內(nèi)時，肌束膜結(jié)構(gòu)仍然規(guī)則清晰、連接緊密，沒有發(fā)生顯著的變化。膠原蛋白是肌束膜的主要組成成分，其變化會導(dǎo)致肌束膜的特性變化，而膠原蛋白的變性溫度在65 ℃左右，當膠原蛋白的加熱溫度高于變性所需溫度時，氫鍵遭到破壞，其理化和生物學特性隨之發(fā)生變化[12-13]。膠原蛋白在60 ℃時并未或只有少部分發(fā)生了變性，所以在此時肌束膜沒有發(fā)生顯著變化。但是Purslow[14]發(fā)現(xiàn)低溫（60 ℃）長時（90 min）加熱也會使膠原蛋白發(fā)生變性，即這種方式也會導(dǎo)致氫鍵的斷裂，使膠原纖維結(jié)構(gòu)變得松弛并開始進行收縮，從而引發(fā)肌束膜的收縮。結(jié)締組織的收縮同時也會造成肌內(nèi)脂肪細胞的收縮，導(dǎo)致脂肪從肉品中大量流出，從而影響到肉品的多汁性，風味也會受到一定影響。這對于大理石花紋等級較低的肉品，影響可能更大，但目前尚未發(fā)現(xiàn)相關(guān)的研究來證實。

溫度達到65 ℃及以上，膠原蛋白發(fā)生劇烈變性，膠原纖維的收縮會導(dǎo)致結(jié)締組織發(fā)生強制性的收縮，這種收縮最終會導(dǎo)致肌肉體積的縮小，從而增加肌肉的韌性[15]。Wang 等[9]的研究表明，在50～70 ℃時，肌肉的剪切力下降，這很可能是由此時肌束膜的拉伸斷裂強度逐漸降低導(dǎo)致的[10]，因為膠原蛋白的熱溶解性和可溶性膠原蛋白含量均會隨著溫度的升高與加熱時間的延長而升高[16]，從而影響到結(jié)締組織的強度。此時肉品嫩度得到改善，多汁性進一步下降。

加熱溫度在70～80 ℃時，肌束膜中膠原蛋白的共價化學鍵遭到破壞，呈現(xiàn)出規(guī)則的顆粒狀結(jié)構(gòu)[9]。結(jié)締組織收縮和碎裂明顯增加，膠原纖維溶解度提高，出現(xiàn)凝膠化現(xiàn)象，肌內(nèi)膜收縮加劇，直徑和長度收縮到原來的70%和40%[17]。肌束膜中膠原纖維的降解在70 ℃時開始，在80 ℃時觀察到強烈的崩解，而整個肉塊和肌纖維的收縮比例小于30%。大多數(shù)肌肉的最大橫向收縮率約為10%～11%，因此加熱導(dǎo)致的肌內(nèi)膜的收縮程度大于肌纖維的收縮程度，造成肌纖維之間空隙減小、肉中汁液流失、單位面積的肉品內(nèi)肌纖維密度增大、肉質(zhì)變硬。

加熱溫度達到80 ℃及以上時，肌束膜和肌內(nèi)膜結(jié)構(gòu)幾乎完全被破壞[9]，未被耐熱分子間鍵穩(wěn)定的膠原纖維會溶解并形成明膠，表現(xiàn)出凝膠化現(xiàn)象，肌肉嫩度得到改善。

2 加熱過程中膠原蛋白熱特性影響因素

膠原蛋白是結(jié)締組織的主要結(jié)構(gòu)成分，由長約280 nm、直徑1.4～1.5 nm 的原膠原蛋白單體組成，分子量為300 000 Da。原膠原分子在肌外膜和肌束膜周圍聚集形成延伸的纖維，或作為肌內(nèi)膜主要的結(jié)構(gòu)基質(zhì)。加熱時可溶性膠原的溶解，不溶性膠原的熱變性和收縮等熱特性會對肉品的嫩度等感官品質(zhì)產(chǎn)生影響[18]，影響加熱過程中膠原熱特性的因素如下。

2.1 膠原蛋白類型對膠原蛋白熱特性的影響

不同肌肉部位甚至同一塊肌肉中都會含有不同類型的膠原蛋白，其變性溫度、收縮溫度、熱降解等性質(zhì)會有差別，如I 型膠原比III 型膠原更容易被加熱降解[19]。Bruggemann 等[20]發(fā)現(xiàn)豬肉內(nèi)有些膠原蛋白會在57～59.5 ℃變性；有些膠原蛋白在59～61 ℃的溫度下發(fā)生變性，三螺旋結(jié)構(gòu)展開；另一部分膠原蛋白在高達68 ℃的溫度下仍保持穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。在加熱時發(fā)生溶解的膠原蛋白還會隨著加熱溫度的升高形成明膠，但熱溶性膠原的比例不固定，通常只占結(jié)締組織中總膠原的一小部分，大部分膠原蛋白仍然是不溶的[21]。這些烹飪后剩余的熱不溶性膠原蛋白會對最終熟肉的品質(zhì)產(chǎn)生影響，所以未來研究的重點在于研究熱不溶性膠原蛋白成分及性質(zhì)，以及如何降解和轉(zhuǎn)化熱不溶性膠原蛋白。

不同種類的動物體內(nèi)的膠原蛋白組成不同，這也會導(dǎo)致其最終展現(xiàn)出的變性溫度不同。如哺乳動物中的膠原蛋白在65 ℃時發(fā)生變性；雞肉中的膠原蛋白在65.3 ℃時發(fā)生變性；牛肉中膠原蛋白在69.2 ℃發(fā)生變性；鱸魚中膠原蛋白在27.2 ℃就發(fā)生變性。因此消費者在烹飪過程中可根據(jù)不同肉類及其不同部位的膠原變性溫度選擇適合的烹飪方法。

2.2 加熱工藝對膠原蛋白熱特性的影響

不同的加熱處理會對膠原蛋白熱特性產(chǎn)生顯著的影響。研究者通過掃描電子顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)加熱過程中膠原蛋白會發(fā)生變性，并且隨著加熱時間的延長，變性膠原的比例會緩慢增加[22-23]。王靜帆等[24]在對豬肉膠原蛋白含量的測定中也發(fā)現(xiàn)，熱溶性膠原蛋白含量隨著加熱時間延長與溫度的升高而增加。何龍等[25]和孔令明[26]分別測量了牛蹄皮和馬肉中膠原蛋白的含量，也得到了相同的結(jié)論。并且Chang 等[27]發(fā)現(xiàn)在加熱溫度達到65 ℃及以上時，這個趨勢會更明顯，所以60 ℃和65 ℃的加熱溫度對于改變膠原蛋白的特性是關(guān)鍵的。

但有研究發(fā)現(xiàn)，如果將肉類緩慢加熱，相當數(shù)量的膠原蛋白會在較低的溫度下發(fā)生變性。Purslow 等[28]解釋了出現(xiàn)這一現(xiàn)象的原因，即在大多數(shù)文獻中使用快速升溫速率（5～10 ℃/min）的差示掃描量熱法得出膠原的熱變性溫度在62～67 ℃，但該過程高度依賴于升溫速率，因為基于Lumry-Eyring 模型的膠原蛋白展開和變性的非平衡、多步驟過程的差示掃描量熱法的數(shù)據(jù)分析高度依賴于加熱速率，在55～60 ℃的緩慢加熱狀態(tài)下測定的膠原蛋白變性溫度可能會下降。何龍等[25]的研究結(jié)果也表明，加熱溫度和時間均會使牛蹄皮組織結(jié)構(gòu)受到影響，并且在加熱時長超過50 min 后，不同溫度處理的牛蹄皮均顯示出較低的剪切力值。王浩明等[29]通過測量豬耳在鹵制過程中剪切力的變化，發(fā)現(xiàn)蒸煮溫度在85 ℃以下時，剪切力在蒸煮90 min 時達到最大，而溫度高于90 ℃時，在80 min 時剪切力達到最大，說明長時間低溫加熱可以使肉的嫩度改善。

2.3 動物年齡對膠原蛋白熱特性的影響

動物在不同成熟階段也會使膠原蛋白表現(xiàn)出不同的熱特性。Panea 等[30]在品種對歐洲肉牛膠原蛋白影響的研究中發(fā)現(xiàn)，動物的屠宰年齡會對肉品中膠原的溶解度產(chǎn)生影響，屠宰年齡較低的牛肉會有更低的膠原蛋白溶解度。這是由于在動物成熟過程中可還原的交聯(lián)會逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)楦€(wěn)定、不可還原的交聯(lián)，導(dǎo)致溶解性降低。

在成熟度低的動物中，熱不穩(wěn)定性的交聯(lián)存在于肌外膜和肌束膜中，而熱穩(wěn)定性的交聯(lián)存在于肌束膜和肌內(nèi)膜中，交聯(lián)的存在會增大肌肉的韌性[12]。并且隨著動物年齡的增長，熱不穩(wěn)定性的交聯(lián)會向熱穩(wěn)定性交聯(lián)轉(zhuǎn)變，也就是熱穩(wěn)定交聯(lián)比例會有所升高，這就導(dǎo)致結(jié)締組織在烹飪過程中會產(chǎn)生更大的張力[31]。同時熱穩(wěn)定性交聯(lián)的比例也影響了膠原蛋白的熱變性溫度，肌內(nèi)膜膠原蛋白的熱變性溫度升高，而肌束膜內(nèi)膠原呈現(xiàn)下降趨勢[32]。

現(xiàn)有的研究大多探究了熱穩(wěn)定性膠原蛋白在動物生長過程中的交聯(lián)現(xiàn)象，通過降低屠宰時的動物年齡和/或用生長促進劑誘導(dǎo)肌肉重建，可以降低肌肉中熱穩(wěn)定交聯(lián)的含量[33]。然而，在加熱過程中，關(guān)于熱穩(wěn)定性膠原蛋白的交聯(lián)情況的研究較少，探究如何改善這種交聯(lián)情況或許可以為提高肉嫩度提供一個思路。

2.4 蛋白聚糖降解對膠原蛋白熱特性的影響

蛋白聚糖（proteoglycans，PGs）在肌束膜與肌內(nèi)膜中以65 nm 的間隔與膠原纖維相締合，連接并穩(wěn)定著膠原纖維，維持著肌內(nèi)膜和肌束膜的結(jié)構(gòu)[34]。宰后成熟過程中，膠原蛋白網(wǎng)絡(luò)分解成膠原纖維，而PGs 的降解會導(dǎo)致膠原纖維暴露在膠原酶之下并促進其降解[35]。

Veiseth-Kent 等[36]通過免疫組織化方法，發(fā)現(xiàn)在宰后成熟2～13 d 內(nèi)，背最長肌和岡下肌中的蛋白聚糖均有不同程度的降解，同時肌內(nèi)膜膠原蛋白解螺旋需要的能量變少，推測蛋白聚糖的降解有利于加熱時膠原蛋白的解螺旋。Nishiumi 等[37]也發(fā)現(xiàn)，軟骨素酶水解掉蛋白多糖上的糖胺聚糖后，膠原蛋白在加熱時更容易發(fā)生溶解，推測是因為糖胺聚糖擁有固定膠原纖維的能力，糖胺聚糖水解后，膠原纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)弱化。但是該研究并沒有測定軟骨素酶處理后肌內(nèi)膜熱收縮相關(guān)數(shù)據(jù)，無法判斷糖胺聚糖水解是否和肌內(nèi)膜收縮有關(guān)。但也有學者認為，橫向堆積的分子間的離子相互作用導(dǎo)致了纖維狀膠原蛋白熱穩(wěn)定性的變化，而共價交聯(lián)與蛋白聚糖相互作用的影響不大[18，38]。

3 原料肉結(jié)締組織內(nèi)源降解體系及其和結(jié)締組織熱特性的關(guān)系

3.1 基質(zhì)金屬蛋白酶降解結(jié)締組織情況

結(jié)締組織可被多種酶降解，基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）是其中很重要的一類。MMPs 可以水解包括結(jié)締組織在內(nèi)的細胞外基質(zhì)中除多糖以外所有物質(zhì)，并且它是目前為止發(fā)現(xiàn)的唯一可以水解結(jié)締組織中纖維素類膠原的蛋白酶類。MMP-2和MMP-9 是研究最多的基質(zhì)金屬蛋白酶，其可以降解明膠，水解層粘連蛋白、間質(zhì)膠原等結(jié)締蛋白，并且其降解底物還在不斷被發(fā)現(xiàn)和更新。但目前MMP-2 和MMP-9 對肌肉結(jié)締組織的全部降解底物尚不明確。

CHA 等[39]的研究結(jié)果表明肌肉中MMP-2 和MMP-9可以被激活數(shù)倍，并且在直徑較小的肌纖維周圍具有更強的酶活性。MMPs 在肌肉中的表達和活性受到嚴格的調(diào)控，而纖溶酶或許是MMPs 強有力的生理性激活物。研究者在組織型纖溶酶原激活物敲除的小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)MMP-2 和MMP-9 活性的下降，細胞外基質(zhì)的合成和含量增加[40]。同時纖溶解酶在肌肉的肌束膜和肌內(nèi)膜相應(yīng)位置的表達，說明MMPs 的活性極有可能是由纖溶酶激活，從而實現(xiàn)細胞外基質(zhì)的降解和重塑。但是目前還未發(fā)現(xiàn)直接證據(jù)證明纖溶酶在調(diào)控肌肉中細胞外基質(zhì)，特別是肌束膜和肌內(nèi)膜降解和重塑中的作用。除了通過激活MMPs 的活性來增加結(jié)締組織的降解外，纖溶酶還可能直接對結(jié)締組織進行降解，并有可能在降解結(jié)締組織的某些成分后，使結(jié)締組織更容易被MMPs 降解，從而使嫩度得到改善。

在肉品科學領(lǐng)域，宰后成熟過程中MMPs 的活性調(diào)控及其和肉品品質(zhì)的關(guān)系研究還很缺乏。劉紀璇[41]在冰鮮草魚片由內(nèi)源蛋白酶介導(dǎo)的結(jié)締組織降解模式研究中發(fā)現(xiàn)，結(jié)締組織的降解和內(nèi)源性基質(zhì)金屬蛋白酶家族，尤其是膠原酶MMP-2 和MMP-9 有關(guān)。同時Rao 等[42]的研究結(jié)果表明，隨著貯藏時間的延長，羊肉中MMPs 的活性濃度在逐漸增加，貯藏7 d 后，活性濃度顯著高于貯藏1 d 的濃度。同時發(fā)現(xiàn)MMP-2 和MMP-9 的降解底物β 型肌聚糖（β-dystroglycan，β-DG）在宰后發(fā)生了顯著降解，這說明宰后MMPs 可能參與了細胞外基質(zhì)的降解，但還需要進一步證實。未來或可通過MMPs 來調(diào)控結(jié)締組織的降解，調(diào)節(jié)肉品收縮情況，從而改善肉品質(zhì)。

3.2 內(nèi)源降解系統(tǒng)對蛋白聚糖的降解及其和膠原熱降解關(guān)系

PGs 會在宰后貯藏過程中降解，分子量約3 000 kDa的PGs 在貯藏7 d 內(nèi)下降至原始值的40%，在宰后4 d檢測到了分子量約為20 kDa 的條帶，可能是高分子量PGs 的降解產(chǎn)物[35]。Nishimura 等[35]的試驗發(fā)現(xiàn)，在貯藏28 d 后，基底膜內(nèi)的PGs 消失，肌周膜內(nèi)PGs 大部分消失，總PGs 含量隨宰后時間的延長而降低，表明PGs在牛肉宰后貯藏過程中會發(fā)生降解?？侾Gs 含量隨著宰后時間的延長而減少，表明PGs 在牛肉的宰后貯藏過程里會發(fā)生降解。

研究者認為PGs 降解的機制有兩種可能性，一種是PGs 的自發(fā)降解，另一種是酶促降解[35，43]。目前大部分研究集中在酶促降解，即酶導(dǎo)致的PGs 降解，但大多是關(guān)于動物生長過程中結(jié)締組織中PGs 的變化情況，而在肉品貯藏中PGs 變化的研究較少。蛋白聚糖降解體系包括β-葡萄糖醛酸酶、透明質(zhì)酸酶和硫酸軟骨素酶等。在肉品科學領(lǐng)域，關(guān)于這些酶在宰后成熟過程中對肌束膜和肌內(nèi)膜成分的降解及熱特性的影響的研究較少。

β-葡萄糖醛酸酶是溶酶體內(nèi)的酸性水解酶，是蛋白聚糖降解的酶原之一，直接參與蛋白聚糖和細胞外基質(zhì)的降解過程。有研究表明β-葡萄糖苷酸酶的活性隨著牛肉嫩度的增加而增加[35]，這可能是由β-葡萄糖苷酸酶攻擊了肉里的PGs，導(dǎo)致結(jié)締組織松散造成的。

透明質(zhì)酸酶是指能夠?qū)⑼该髻|(zhì)酸及部分糖胺聚糖降解成二糖或小分子寡糖的一類糖苷酶，其最適反應(yīng)溫度在20～50 ℃，大都屬于中低溫酶，普遍在高于55 ℃時便會失活[44]。它的來源有很多，包括微生物發(fā)酵、動物組織提取或者基因重組等。Souza 等[45]使用透明質(zhì)酸酶處理妊娠白鼠細胞外基質(zhì)，檢測到糖胺聚糖濃度顯著降低，同時也檢測到PGs 的表達降低。

軟骨素酶可以降解硫酸軟骨素蛋白聚糖，其作用原理是破壞兩個二糖重復(fù)單元之間的β-糖苷鍵。Nishiumi 等[37]使用軟骨素酶處理結(jié)締組織，觀察到肌內(nèi)糖胺聚糖對溶酶體酶的蛋白水解攻擊膠原表現(xiàn)出保護作用，并隨著糖胺聚糖的拆分，膠原的熱穩(wěn)定性降低。這表明軟骨素酶降解掉了蛋白聚糖上的糖胺聚糖，即硫酸軟骨素，從而導(dǎo)致膠原解體，降低結(jié)締組織穩(wěn)定性。

4 總結(jié)

結(jié)締組織的熱收縮和熱溶解特性會對肉的品質(zhì)產(chǎn)生影響，但目前對結(jié)締組織與肉品多汁性、風味和質(zhì)構(gòu)等品質(zhì)指標的關(guān)系研究尚不全面。肉品加熱工藝流程、動物年齡、蛋白聚糖降解等都可以影響結(jié)締組織的主要成分膠原蛋白的熱特性，從而使肉品表現(xiàn)出不同的感官品質(zhì)。在今后的研究中，可以關(guān)注MMPs、β-葡糖醛酸酶等內(nèi)源酶與結(jié)締組織成分降解的關(guān)系，以及其與結(jié)締組織熱特性的關(guān)系，以期通過調(diào)控這些酶的活性來改善肉品的感官品質(zhì)。