李麗琴,莫雪妮,袁 莉,陳 煒,秦紅玲,胡躍強(qiáng),姚 春

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué),廣西 南寧 530012;2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,廣西 南寧 530020)

缺血性中風(fēng)是中風(fēng)病中最常見的一種,約占所有中風(fēng)病例的87%,其特點(diǎn)是血栓形成或栓塞導(dǎo)致血流突然減少,阻塞了供應(yīng)大腦特定區(qū)域的腦血管[1],是世界上第三大死因,也是最常見的致殘病因[2]。線粒體鐵死亡是最近發(fā)現(xiàn)的一種非凋亡性細(xì)胞死亡形式,其特征在于鐵過載,谷胱甘肽(GSH)消耗,谷胱甘肽過氧化物酶4(GPX4)失活以及脂質(zhì)和氨基酸代謝失衡[3]。有研究報道,在腦缺血和腦缺血再灌注損傷的發(fā)生發(fā)展中,線粒體鐵死亡既誘發(fā)又加重腦組織損傷[4]。因此靶向調(diào)控線粒體鐵死亡通路可以為缺血性中風(fēng)的治療提供新的視角。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)鐵離子負(fù)載的轉(zhuǎn)鐵蛋白與大多數(shù)體細(xì)胞表面的鐵調(diào)節(jié)蛋白1(Iron regulatory protein1,IRP1)結(jié)合,并且在復(fù)合物內(nèi)吞作用后進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)[5];96序列相似家庭成員A(Family with sequence similarity 96 member A,FAM96A)是新近發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)鐵硫蛋白質(zhì)組裝機(jī)制的成員和細(xì)胞鐵穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)劑[6]。在細(xì)胞鐵充足的情況下,IRP1能夠在FAM96A的幫助下轉(zhuǎn)換成含有鐵硫族的順烏頭酸酶[7-8],調(diào)控其表達(dá)可能會對腦缺血再灌注損傷發(fā)揮保護(hù)作用。既往研究證實(shí),四逆湯能夠提升機(jī)體谷胱甘肽過氧化物酶活力,減輕自由基損害和抑制脂質(zhì)過氧化物反應(yīng)的作用[9],而以四逆湯為底方的溫陽復(fù)元方在治療缺血性中風(fēng)方面取得了較好的臨床療效[10],故推測溫陽復(fù)元方可能通過抗氧化應(yīng)激反應(yīng)進(jìn)而抑制線粒體鐵死亡。本實(shí)驗(yàn)通過觀察溫陽復(fù)元方對線粒體鐵死亡相關(guān)蛋白IRP1和FAM96A表達(dá)的影響,旨在闡明該方對腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制,為其臨床應(yīng)用提供更多的、科學(xué)的理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1動物 健康雄性SPF級SD大鼠84只,12月齡,體重(250±50)g,由廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)中心提供,生產(chǎn)許可證號:SCXK(湘)2019-0014。實(shí)驗(yàn)方案通過廣西中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)(DW20211204-195)。

1.2藥物 溫陽復(fù)元方由白附片30 g、黃芪30 g、黨參30 g、石菖蒲20 g、淫羊藿15 g、田三七15 g、干姜10 g、炙甘草6 g組成。補(bǔ)陽還五湯由黃芪60 g、桃仁15 g、紅花6 g、地龍10 g、赤芍15 g、當(dāng)歸6 g、川芎15 g組成。以上藥物均由廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科統(tǒng)一采購,要求同一批次(批號:20190701)、同一質(zhì)量、同一產(chǎn)地。所有藥物浸泡30 min,白附片先煎1 h,后加入其他藥物,分2次煎煮;再大火濃縮至含原生藥濃度1.0 g/mL的藥液。根據(jù)成人(70 kg)與大鼠體表面積換算,確定溫陽復(fù)元方和補(bǔ)陽還五湯大鼠灌胃劑量分別為14.04 g/kg和11.43 g/kg。

1.3主要試劑和儀器 MCAO線栓(河南平頂山豫順生物科技有限公司,批號:2543);Trizol Reagent(美國Ambion公司,批號:284909),mRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(上海新貝生物科技有限公司,批號:F2967);mRNA擴(kuò)增試劑盒(上海新貝生物科技有限公司,批號:F2967);IRP1一抗(北京Solarbio公司,貨號:K111307P,1∶2 000);FAM96A一抗(上海Affinity公司,貨號:DF12272,1∶2 000);山羊抗兔HRP-IgG(北京Biosharp公司,貨號:BL003A,1∶20 000);DEPC水、GAPDH抗體(北京Biosharp公司,貨號分別是BL510A和BL0068);DAB顯色液(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司,貨號:ZLI-9017,ZLI-9018,ZLI-9019)。LightCycler 96型PCR儀(瑞士Roche公司);H-600型透射電鏡(日本日立公司);M200PRO型多功能酶標(biāo)儀(瑞士TECAN公司);Centrifuge 5418R型低溫離心機(jī)(德國Eppendorf公司)。

1.4實(shí)驗(yàn)方法 將84只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、腦缺血再灌注組、溫陽復(fù)元方組、補(bǔ)陽還五湯組,每組21只。腦缺血再灌注組、溫陽復(fù)元方組、補(bǔ)陽還五湯組大鼠在Longa線栓法[11]的基礎(chǔ)上加以改良制備右側(cè)大腦中動脈栓塞模型,線栓插入大鼠右側(cè)頸內(nèi)動脈大約17 mm,2 h后拔出線栓實(shí)現(xiàn)缺血再灌注,大鼠清醒后用Zea-Longa 5級評分法進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評分,評分1～3分且無蛛網(wǎng)膜下腔出血的大鼠證實(shí)造模成功。溫陽復(fù)元方組、補(bǔ)陽還五湯組在制作缺血再灌注模型前30 min分別給予溫陽復(fù)元方14.04 g/kg和補(bǔ)陽還五湯11.43 g/kg灌胃,術(shù)后大鼠清醒后1 h繼續(xù)予以原方灌胃,每日上、下午各1次;腦缺血再灌注組造模后灌胃等體積的生理鹽水;假手術(shù)組除線栓只插入頸內(nèi)動脈9 mm外,其余的實(shí)驗(yàn)步驟同腦缺血再灌注組。

1.5檢測指標(biāo)及方法 再灌注12 h、24 h、3 d時對各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評分,然后取各組大鼠腦組織,一部分液氮冷凍后通過RT-qPCR檢測IRP1、FAM96A mRNA表達(dá)情況;一部分進(jìn)行脫水和包埋,通過免疫組化檢測缺血灶腦組織中IRP1、FAM96A蛋白表達(dá)情況。

1.5.1神經(jīng)功能缺損評分評定方法 采用Zea-Longa 5級評分法對大鼠神經(jīng)功能缺損情況進(jìn)行評分。0分:神經(jīng)功能正常;1分:提尾時左側(cè)前肢不能完全伸展;2分:追尾現(xiàn)象;3分:行走時向左側(cè)轉(zhuǎn)圈;4分:無法自主行走,意識喪失。評分越高說明大鼠神經(jīng)功能障礙越嚴(yán)重。

1.5.2缺血灶腦組織中IRP1、FAM96A mRNA表達(dá)檢測方法 使用Trizol試劑提取大鼠總RNA,測定RNA 的濃度和純度,37 ℃ 15 min和85 ℃ 5 s進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,得到在RNA各個位置反轉(zhuǎn)錄效率均一的cDNA,最后進(jìn)行擴(kuò)增,過程如下:95 ℃預(yù)變性30 s,95 ℃變性10 s,60 ℃退火30 s,使用全自動實(shí)時熒光定量儀器進(jìn)行PCR產(chǎn)物的檢測。所用引物序列見表1。實(shí)驗(yàn)所得CT值采用2-ΔΔCT法計算分析。

表1 引物序列

1.5.3缺血灶腦組織中IRP1、FAM96A蛋白表達(dá)檢測方法 石蠟切片4 μm,玻片65 ℃烘烤2 h后脫蠟,在二甲苯中浸泡4次,每次10 min,去除多余液體后,梯度乙醇復(fù)水后在蒸餾水中沖洗1 min,置于檸檬酸鈉中高壓高溫修復(fù)5～10 min,后滴水冷卻至常溫,水洗3遍,免疫組化筆劃圈,加入適量內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑,室溫孵育10 min,PBS緩沖液洗3遍,每次3 min;加入一抗,4 ℃冰箱過夜,用自來水洗去一抗,PBS緩沖液沖洗;滴加適量的山羊抗兔HRP-IgG,蓋上蓋子防止揮發(fā),室溫孵育20 min后沖洗;加入新鮮配置的DAB顯色液(1∶19)染色直到顯淺黃色為止,蘇木素染色30 s,梯度乙醇中脫水后,中性樹膠封片,觀察結(jié)果,光學(xué)顯微鏡拍照,采用Image J軟件檢測圖片的陽性細(xì)胞面積,算出平均光密度值。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。多個樣本間的比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較方差齊者用LSD檢驗(yàn),方差不齊者用Tamhane’sT2檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較 假手術(shù)組大鼠各時間點(diǎn)神經(jīng)功能缺損評分均為0分,腦缺血再灌注組大鼠各時間點(diǎn)神經(jīng)功能缺損評分均明顯高于假手術(shù)組(P均<0.05);溫陽復(fù)元方組大鼠神經(jīng)功能缺損評分隨再灌注時間延長逐漸降低,再灌注3 d時最低,與腦缺血再灌注組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05);補(bǔ)陽還五湯組僅在再灌注12 h時神經(jīng)功能缺損評分明顯低于腦缺血再灌注組(P<0.05),再灌注24 h、3 d時與腦缺血再灌注組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05);與補(bǔ)陽還五湯組比較,溫陽復(fù)元方組再灌注3 d時神經(jīng)功能缺損評分更低(P<0.05)。見圖1。

A為假手術(shù)組;B為腦缺血再灌注組;C為溫陽復(fù)元方組;D為補(bǔ)陽還五湯組

2.2各組大鼠缺血灶腦組織中IRP1、FAM96A mRNA相對表達(dá)量比較 腦缺血再灌注組再灌注12 h、24 h、3 d時IRP1、FAM96A mRNA相對表達(dá)量均明顯高于同期假手術(shù)組(P均<0.05)。溫陽復(fù)元方組IRP1、FAM96A mRNA相對表達(dá)量隨再灌注時間延長逐漸降低,再灌注3 d時最低,與腦缺血再灌注組相應(yīng)時間點(diǎn)比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05),且再灌注3 d時IRP1 mRNA相對表達(dá)量和再灌注24 h、3 d時FAM96A mRNA相對表達(dá)量均明顯低于同期補(bǔ)陽還五湯組(P均<0.05);補(bǔ)陽還五湯組IRP1、FAM96A mRNA相對表達(dá)量隨再灌注時間延長逐漸升高,但再灌注12 h、24 h時均明顯低于同期腦缺血再灌注組(P均<0.05),再灌注3 d時與腦缺血再灌注組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見表2。

表2 假手術(shù)組和腦缺血再灌注各組大鼠腦組織中IRP1和FAM96A mRNA相對表達(dá)量比較

2.3各組大鼠 缺血灶腦組織中IRP1、FAM96A蛋白表達(dá)情況比較 腦缺血再灌注組再灌注12 h、24 h、3 d時IRP1、FAM96A蛋白表達(dá)平均光密度值均明顯高于同期假手術(shù)組(P均<0.05)。溫陽復(fù)元方組IRP1、FAM96A蛋白表達(dá)平均光密度值隨再灌注時間延長逐漸降低,再灌注3 d時最低,與腦缺血再灌注組相應(yīng)時間點(diǎn)比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05),且再灌注24 h、3 d時IRP1、FAM96A 蛋白表達(dá)平均光密度值均明顯低于同期補(bǔ)陽還五湯組(P均<0.05);補(bǔ)陽還五湯組IRP1、FAM96A蛋白表達(dá)平均光密度值隨再灌注時間延長逐漸升高,但再灌注12 h、24 h時均明顯低于同期腦缺血再灌注組(P均<0.05),再灌注3 d時與腦缺血再灌注組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見表3及圖2、圖3。

圖2 假手術(shù)組和腦缺血再灌注各組大鼠腦組織中IRP1蛋白表達(dá)情況(免疫組化染色,×400)

圖3 假手術(shù)組和 腦缺血再灌注各組大鼠腦組織中FAM96A 蛋白表達(dá)情況(免疫組化染色,×400)

表3 假手術(shù)組和腦缺血再灌注各組大鼠腦組織中IRP1和FAM96A平均光密度值比較

3 討 論

目前,中醫(yī)對于缺血性中風(fēng)的治療存在較多的觀點(diǎn),根據(jù)患者發(fā)病的病因病機(jī),常用的治療方法主要包括養(yǎng)陰熄風(fēng)、清火平肝或益氣活血、化瘀通絡(luò)或泄熱通腑、化痰開竅等[12]。受《內(nèi)經(jīng)》重陽思想和“火神派”思想的影響,并依據(jù)多年以來對缺血性中風(fēng)的認(rèn)識,胡躍強(qiáng)教授團(tuán)隊認(rèn)為元陽虧虛為本病的病機(jī)根本,元陽虧虛,臟腑溫煦功能失調(diào),陰寒內(nèi)生,導(dǎo)致寒凝血瘀;痰瘀阻滯又進(jìn)一步阻遏陽氣的化生,導(dǎo)致肝風(fēng)夾痰上蒙清竅,發(fā)為中風(fēng)[10,13-14],故基于此病機(jī)創(chuàng)制了溫陽復(fù)元方治療本病。該方中附片剛中帶柔,可溫坎水,大補(bǔ)少陰之腎陽為君藥。臣以黃芪補(bǔ)氣升陽,大補(bǔ)脾胃之氣,氣行則血行,有行滯通絡(luò)之效;黨參助黃芪補(bǔ)脾肺之氣;辛熱之干姜溫中散寒,助附子溫脾胃之陽。淫羊藿祛風(fēng)除濕、補(bǔ)腎壯陽,引陽入陰,通達(dá)內(nèi)外;石菖蒲化痰開竅,安神定志;田三七活血化瘀止血;上三藥為佐藥,炙甘草為使藥。諸藥合用,共奏溫陽益氣、化痰通絡(luò)之功。為探討該方對腦缺血再灌注大鼠線粒體鐵死亡的影響,本研究以治療缺血性中風(fēng)的經(jīng)典方補(bǔ)陽還五湯為對照進(jìn)行了相關(guān)研究。

線粒體鐵死亡是一種鐵依賴的調(diào)節(jié)性壞死,通過影響鐵代謝或脂質(zhì)過氧化在缺血性中風(fēng)的發(fā)展中起著重要作用,有研究發(fā)現(xiàn)抑制線粒體鐵死亡可以成功逆轉(zhuǎn)缺血性損傷[3,15]。細(xì)胞的鐵離子平衡受到嚴(yán)格的調(diào)控,在細(xì)胞缺鐵時最大限度地增加鐵的供應(yīng),而當(dāng)細(xì)胞缺鐵時限制鐵離子的供應(yīng),并促進(jìn)其儲存。這種調(diào)節(jié)可以發(fā)生在不同的層面,但最常見的是IRP1和IRP2與編碼各種鐵離子相關(guān)蛋白[16]的信使RNA非翻譯區(qū)(UTRs)中的干細(xì)胞環(huán)結(jié)構(gòu)[鐵反應(yīng)元件(IRE)]的鐵依賴性結(jié)合[17]。當(dāng)細(xì)胞鐵濃度低時,IRP1處于與mRNA結(jié)合的構(gòu)象。IRP1與鐵蛋白mRNA的5′UTR的結(jié)合阻止了翻譯,從而確保在不需要儲存鐵的時候產(chǎn)生少量的鐵蛋白;同時,IRP1與TfR1 mRNA的3′UTR中的鐵調(diào)節(jié)蛋白(IRPs)結(jié)合,從而保護(hù)信息不被降解,使更多的TfR1在細(xì)胞膜上表達(dá)。這種作用反過來使細(xì)胞能夠最大限度地攝入鐵離子。當(dāng)細(xì)胞鐵離子濃度高時,IRP1不與IREs結(jié)合,從而允許鐵蛋白mRNA的翻譯繼續(xù)進(jìn)行,并使TfR1 mRNA暴露與降解。這些條件限制了細(xì)胞對鐵離子的吸收并促進(jìn)了其儲存。FAM96A僅存在于少數(shù)生物體中,并作為IRP1的專用Fe/S簇成熟因子,從而對哺乳動物的細(xì)胞鐵離子平衡調(diào)節(jié)產(chǎn)生直接影響[6]。有研究表明,提高大鼠海馬內(nèi)IRP1的表達(dá)量,進(jìn)而使TfR表達(dá)量增加,鐵蛋白表達(dá)量減少,最終導(dǎo)致大鼠腦內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài)失衡,相應(yīng)腦區(qū)鐵離子含量增加[18]。Casarrubea等[19]研究發(fā)現(xiàn)IRP1過表達(dá)會導(dǎo)致細(xì)胞鐵代謝紊亂,強(qiáng)調(diào)了適當(dāng)?shù)腎RP1調(diào)節(jié)在鐵代謝的中樞器官中的重要性。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),大鼠腦缺血再灌注后腦組織中IRP1和FAM96A的表達(dá)顯著增加,其直接結(jié)果導(dǎo)致鐵離子內(nèi)流增加,而外輸減少,致使神經(jīng)元線粒體結(jié)構(gòu)破壞而鐵死亡發(fā)生;溫陽復(fù)元湯可下調(diào)IRP1和FAM96A的表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)鐵的外排,減少神經(jīng)元損傷,發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用,且其作用明顯優(yōu)于補(bǔ)陽還五湯。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。