符顯昭,陳佳俊,蔣曉鳳,申亞亞,覃金艷,丘海先,閉紅函

(右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院,廣西 百色 533099)

慢性心力衰竭是心肌重構(gòu)發(fā)展的結(jié)果,而心肌重構(gòu)是多種心臟疾病慢性發(fā)展的病理變化。當(dāng)心肌組織受缺氧缺血、衰老、血壓升高等因素影響時(shí),心肌細(xì)胞損傷、死亡丟失,而作為應(yīng)激之后的反應(yīng)和損傷修復(fù),取而代之的則是心肌纖維化的發(fā)生,進(jìn)而導(dǎo)致心室擴(kuò)大及心力衰竭[1]。目前研究發(fā)現(xiàn),細(xì)胞死亡丟失方式除了壞死和凋亡外,還存在一種因細(xì)胞過(guò)度自噬導(dǎo)致的死亡,即自噬性細(xì)胞死亡,也稱Ⅱ型程序性死亡[2]。正常情況下,自噬可以降解變性的蛋白質(zhì)和受損的細(xì)胞器,給心肌提供氨基酸及游離脂肪酸,保護(hù)心肌細(xì)胞,但自噬被過(guò)度激活則損傷心肌,產(chǎn)生負(fù)面影響,因此自噬在心臟疾病發(fā)展中具有雙重作用,如自噬性細(xì)胞死亡增加,則心肌細(xì)胞減少,并且由于心肌細(xì)胞不能再生,最終引發(fā)心力衰竭[3]。自噬的適度激活與心肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激形成了機(jī)體內(nèi)適應(yīng)性、保護(hù)性的交互作用,而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過(guò)度激活可介導(dǎo)過(guò)度自噬,導(dǎo)致心肌細(xì)胞自噬性死亡增加[4]。糖尿病合并慢性心力衰竭發(fā)病隱匿,治療預(yù)后差[5]。中醫(yī)理論認(rèn)為氣陰兩虛、瘀毒內(nèi)蘊(yùn)為糖尿病心肌病變的主要病機(jī),前期臨床研究發(fā)現(xiàn)具有滋陰益氣、活血解毒作用的降糖舒心方能糾正糖脂代謝紊亂,減輕胰島素抵抗,調(diào)節(jié)心肌能量代謝,抑制心力衰竭激活的腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RASS)對(duì)心臟的損害,縮小左室舒張期末容積,降低心室充盈壓,改善心肌重構(gòu),提高糖尿病合并慢性心力衰竭患者心功能[6]。本研究通過(guò)建立糖尿病合并慢性心力衰竭大鼠模型,基于蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激酶-真核翻譯啟始因子2α-微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(PERK-eIF2α-LC3)通路,探討了降糖舒心方干預(yù)糖尿病合并慢性心力衰竭心肌重構(gòu)的分子機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1動(dòng)物 雄性SD大鼠100只,體重220～250 g,購(gòu)于廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,合格證號(hào):SCXK (桂)2020-003。大鼠飼養(yǎng)于右江民族醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,飼養(yǎng)條件:室溫20～23 ℃,相對(duì)濕度40%～50%,適應(yīng)性普通飼料(江蘇省協(xié)同生物工程有限公司)喂養(yǎng)7 d。本實(shí)驗(yàn)已通過(guò)右江民族醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查(2019030701)。

1.2藥物 降糖舒心方,組方:人參10 g、黃芪15 g、麥冬15 g、生地15 g、山藥15 g、山茱萸10 g、大黃5 g、黃連8 g、丹參10 g、五味子10 g,藥材購(gòu)自右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院,用不銹鋼桶水煎,水煎液分別按高劑量濃縮至130%和低劑量濃縮至80%,冰箱貯存?zhèn)溆?。格列喹?天津金世制藥有限公司,國(guó)藥準(zhǔn)字H20084004),貝那普利(上海新亞藥業(yè)閔行有限公司,國(guó)藥準(zhǔn)字H20044840)。

1.3主要儀器與試劑 SLAN-96S型熒光全自動(dòng)定量PCR儀(北京櫟海生物科技有限公司);YKT-6300型光學(xué)顯微鏡(上海永科光學(xué)儀器有限公司);E0972型全自動(dòng)石蠟切片機(jī)(上海碧云天生物技術(shù)有限公司);5425R型高速低溫離心機(jī)(南京貝登電子商務(wù)有限公司);ASP300型組織脫水機(jī)(德國(guó)徠卡公司);MLS-3750型高壓蒸汽滅菌器(北京萊博瑞杰科技有限公司);IMS-40型制冰機(jī)(常熟市雪科電器有限公司);SW-CJ-1FD型超凈工作臺(tái)(浙江孚夏醫(yī)療科技有限公司);5DT-4型血糖儀(北京怡成生物電子技術(shù)有限公司);鏈脲佐菌素( STZ,貨號(hào):18883-66-4,北京酷來(lái)搏科技有限公司);糖化血紅蛋白(HbA1c)試劑盒(貨號(hào):A097481,上海撫生實(shí)業(yè)有限公司)、同型半胱氨酸(Hcy)試劑盒( 貨號(hào):A099640,上海撫生實(shí)業(yè)有限公司)、血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)試劑盒(貨號(hào):A100687,上海撫生實(shí)業(yè)有限公司),Cathepsin D抗體(貨號(hào):ab2732,Abcam公司)、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3蛋白Ⅰ抗體(LC3Ⅰ)(貨號(hào):ab210498,Abcam公司)、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3蛋白Ⅱ抗體(LC3Ⅱ,貨號(hào):ab63817,Abcam公司)。

1.4實(shí)驗(yàn)方法 將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、西藥組、降糖舒心低劑量組、降糖舒心高劑量組,每組20只。假手術(shù)組大鼠腹腔內(nèi)注射檸檬酸緩沖液,普通飼料喂養(yǎng)。其余組大鼠單次性腹腔注射50 mg/kg STZ(用檸檬酸緩沖液配置為濃度10 mg/mL),72 h后尾靜脈采血,用血糖試紙檢測(cè)空腹血糖,連續(xù)2次空腹血糖≥16.7 mmol/L 認(rèn)為糖尿病造模成功,隨后高脂飼料(含普通飼料78.2%、豬油10%、膽固醇1.5%、蛋黃粉10%、豬膽鹽0.3%,江蘇省協(xié)同生物工程有限公司)喂養(yǎng)1個(gè)月。然后參考文獻(xiàn)[7]采用腹主動(dòng)脈縮窄方法對(duì)各糖尿病造模大鼠進(jìn)行慢性心力衰竭造模:大鼠喂養(yǎng)1個(gè)月后,禁食8 h,腹腔注射10 %水合氯醛3 mL/kg麻醉后打開腹腔,于雙側(cè)腎動(dòng)脈上方鈍性分離腹主動(dòng)脈,在腹主動(dòng)脈旁置入7號(hào)針,用4-0絲線穿過(guò)分離出的腹主動(dòng)脈和7號(hào)針,慢慢結(jié)扎后拔針,縮窄腹主動(dòng)脈 60%～70%,縫合腹腔,術(shù)后抗感染治療,繼續(xù)高脂飼料飼養(yǎng)和飲水。假手術(shù)組大鼠對(duì)腹主動(dòng)脈只穿線不結(jié)扎,普通喂養(yǎng)。術(shù)后28 d,麻醉備皮,大鼠取仰臥位,用Vevo 770高分辨率小動(dòng)物超聲系統(tǒng)進(jìn)行心臟超聲檢測(cè),依據(jù)美國(guó)超聲心動(dòng)學(xué)會(huì)制定的標(biāo)準(zhǔn),大鼠射血分?jǐn)?shù)(EF)≤45%為心力衰竭造模成功。降糖舒心低劑量組給予濃度為80%的降糖舒心方藥液灌胃,降糖舒心高劑量組給予濃度為130%的降糖舒心方藥液灌胃,西藥組給予含格列喹酮9.80 mg/kg 和貝那普利3.30 mg/kg(按成人臨床用藥劑量的5.4倍計(jì)算)的蒸餾水稀釋液灌胃,假手術(shù)組和模型組給予蒸餾水灌胃,灌胃量均為3 mL/100 g,均1次/d,連續(xù)灌胃2個(gè)月,灌胃期間各造模大鼠繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)。

1.5檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.5.1心功能指標(biāo) 灌藥2個(gè)月后,采用2%異氟烷讓大鼠吸入麻醉后,仰臥固定,用探頭頻率為17.5 MHz的Vevo-770小動(dòng)物超聲儀進(jìn)行超聲心動(dòng)圖檢查,記錄左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)、左室收縮末期內(nèi)徑 (LVESD)、短軸縮短率(FS)和EF,取3次平均值。

1.5.2HbA1c及血清 Hcy和AngⅡ水平 采用ELISA法測(cè)定,實(shí)驗(yàn)步驟按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.5.3心肌組織Masson染色情況 處死大鼠,在冰上迅速取心臟,取一部分心肌組織用4%多聚甲醛固定,經(jīng)石蠟包埋,切4 μm薄片,依次浸入二甲苯20 min→無(wú)水乙醇10 min→95%,90%,80%,70%梯度乙醇各5 min→蒸餾水洗;Weigert氏鐵蘇木素染5 min,自來(lái)水洗;1%的鹽酸酒精分化,自來(lái)水沖洗返藍(lán);麗春紅液染色5～10 min,蒸餾水漂洗;磷鉬酸水溶液處理3～5 min后,用苯胺藍(lán)液復(fù)染5 min;浸入1%冰醋酸1 min;依次經(jīng)95%酒精Ⅰ5 min →95%酒精Ⅱ 5 min→無(wú)水乙醇Ⅰ5 min→無(wú)水乙醇Ⅱ5 min →二甲苯Ⅰ5 min→二甲苯Ⅱ5 min,脫水透明,晾干后中性樹膠封片;在顯微鏡下,選取拍照5個(gè)不重疊視野,用Image-Pro Plus Version 6.0軟件計(jì)算膠原纖維灰度值。

1.5.4心肌細(xì)胞自噬及超微結(jié)構(gòu) 取經(jīng)3%的戊二醛溶液處理的心肌組織,用1%鋨酸溶液固定2 h,吸出固定液,用0.1 mol/L pH 7.0 PBS漂洗樣品3次,每次15 min,然后用梯度濃度(50%,70%,80%,90%,95%)乙醇溶液對(duì)心肌組織樣品進(jìn)行脫水,純丙酮處理20 min,用812環(huán)氧樹脂包埋心肌組織,制成超薄切片(50～70 nm),用醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛溶液雙重染色15 min,透射電鏡觀察(加速電壓60～80 kV,放大倍率30 000),調(diào)節(jié)物鏡聚焦旋鈕至圖片清晰,拍照。

1.5.5心肌組織中PERK、eIF2α和C/EBP同源蛋白(CHOP) mRNA表達(dá)情況 采用RT-PCR法檢測(cè):從-80 ℃冰箱取出液氮冷凍心肌組織,加入Trizol裂解液裂解后,依次加入氯仿、異丙醇、75%乙醇、無(wú)水乙醇、DEPC水溶解RNA。然后根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書要求進(jìn)行操作:42 ℃ 15 min,85 ℃ 5 min,反轉(zhuǎn)錄為cDNA,按照PCR試劑盒說(shuō)明將cDNA擴(kuò)增為目的基因,在Realtime PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng),反應(yīng)條件:95 ℃ 10 min變性;95 ℃ 15 s;60 ℃ 60 s;40次循環(huán)。利用溶解曲線檢測(cè)引物的特異性,記錄達(dá)到所設(shè)定的閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù),即CT值,采用2-△△CT計(jì)算表達(dá)量,以假手術(shù)組表達(dá)量為1,比值為相對(duì)表達(dá)量。內(nèi)參基因和目的基因引物由康為世紀(jì)生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成,目的基因:eIF2α的上游引物序列為5’-GACAGCCCTTCTCCAAGAACT-3’,下游引物序列為5’-ACCATGGGATTAACAGAC TTGCT-3’,擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為218 bp;PERK的上游引物序列為5’-CTTTTGGACCTGGTCTGCTCT-3’,下游引物序列為5’-GGGAGAAGCCTCTTGAACGA-3’,擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為163 bp;CHOP的上游引物序列為5’-TCACCATCACACAGACAGGC-3’,下游引物序列為5’-GCCCTTTCTGAGTACCCCAC-3’,擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為148 bp。內(nèi)參基因GAPDH上游引物序列為5’-GATGGTGAAGGTCGGTGTGA-3’,下游引物序列為5’-TGAACTTGCCGTGGGTAGAG-3’,擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為114 bp。

1.5.6心肌組織中Cathepsin D、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白表達(dá)情況 采用Western blot法檢測(cè):從-80 ℃冰箱取出心肌組織,用剪刀剪碎,加入1 mL冷Lysis Buffer,在組織勻漿機(jī)中進(jìn)行勻漿,冰上靜置裂解15 min。將勻漿液放入離心管中,12 000 r/min離心5 min,取上清液,移至預(yù)冷的離心管,用BCA試劑盒檢測(cè)其濃度。用SDS-PAGE電泳和轉(zhuǎn)膜后,把PVDF膜放入孵育盒中,加入5%脫脂奶粉的封閉液,搖床振蕩1.5 h;結(jié)束封閉后,用TBST洗膜3次;將膜放入含一抗稀釋液(按抗體說(shuō)明稀釋)的孵育盒中,4 ℃搖床振蕩,孵育過(guò)夜;第2天室溫振蕩30 min,吸棄一抗,TBST洗3次;用5%脫脂奶粉封閉液稀釋二抗,室溫?fù)u床振蕩1 h;反應(yīng)結(jié)束后,回收二抗,然后用TBST洗膜3次。在PVDF膜滴加發(fā)光試劑混合液,充分接觸反應(yīng)3 min,使用ECL成像儀拍照,使用Image J軟件測(cè)定灰度值。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠心功能指標(biāo)比較 與假手術(shù)組比較,模型組大鼠 LVEDD、LVESD均明顯增加(P均<0.05),FS和EF均明顯降低(P均<0.05);與模型組比較,各藥物組大鼠 LVEDD、LVESD均明顯縮短(P均<0.05),FS和EF均明顯升高(P均<0.05),且降糖舒心高劑量組各指標(biāo)變化更大,但各藥物組間各指標(biāo)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表1。

表1 假手術(shù)組和糖尿病合并慢性心力衰竭各組大鼠心功能指標(biāo)比較

2.2各組大鼠HbA1c及血清Hcy、AngⅡ水平比較模型組大鼠HbA1c及血清Hcy、AngⅡ水平均明顯高于假手術(shù)組(P均<0.05);各藥物組大鼠HbA1c及血清Hcy、AngⅡ水平均明顯低于模型組(P均<0.05);降糖舒心高劑量組大鼠HbA1c及血清Hcy、AngⅡ水平與降糖舒心低劑量組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05),但各指標(biāo)均明顯低于西藥組(P均<0.05)。見表2。

表2 假手術(shù)組和糖尿病合并慢性心力衰竭各組大鼠HbA1c及血清Hcy、AngⅡ水平比較

2.3各組大鼠心肌組織Masson染色情況及心肌膠原纖維IOD值比較 心肌膠原纖維被染成藍(lán)色,心肌纖維被染成紅色。假手術(shù)組大鼠心肌組織中無(wú)膠原纖維增生,心肌膠原纖維IOD值為351.43±17.26;模型組大鼠心肌膠原纖維大量分布在心肌纖維之間,呈擴(kuò)散狀態(tài),心肌膠原纖維IOD值為9 118.67±215.86,明顯高于假手術(shù)組(P<0.05);各藥物組大鼠心肌膠原纖維增生較少,西藥組、降糖舒心低劑量組、降糖舒心高劑量組大鼠心肌膠原纖維IOD值分別為4 934.83±202.45,4 131.67±183.54,3 726.33±139.56,均明顯低于模型組(P均<0.05),且降糖舒心高劑量組和降糖舒心低劑量組均明顯低于西藥組(P均<0.05)。見圖1。

圖1 假手術(shù)組和糖尿病合并慢性心力衰竭各組大鼠心肌組織心肌纖維和膠原纖維Masson染色表現(xiàn)(×400)

2.4各組大鼠心肌細(xì)胞自噬及心肌組織超微結(jié)構(gòu)假手術(shù)組大鼠心肌細(xì)胞形態(tài)、大小正常,細(xì)胞連接緊密、排列整齊,胞內(nèi)可見含量不等的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體等細(xì)胞器,間質(zhì)纖維無(wú)增生,細(xì)胞自噬小體較少;模型組大鼠心肌細(xì)胞排列紊亂,橫紋不清晰,間質(zhì)纖維增生嚴(yán)重,細(xì)胞自噬小體增多,細(xì)胞外形不規(guī)則,突向腔面或脫落,細(xì)胞間連接擴(kuò)大,胞內(nèi)有空泡,線粒體腫脹,呈空泡樣改變;與模型組相比,各藥物組大鼠心肌細(xì)胞自噬及纖維化程度減輕,其中降糖舒心高劑量組改善更明顯。見圖2。

圖2 假手術(shù)組和糖尿病合并慢性心力衰竭各組大鼠心肌細(xì)胞自噬及心肌組織超微結(jié)構(gòu)(×15 000,箭頭為自噬體)

2.5各組大鼠心肌組織中PERK、eIF2α、CHOP mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較 模型組大鼠心肌組織中PERK、eIF2α和CHOP mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯高于假手術(shù)組(P均<0.05);各藥物組大鼠心肌組織中PERK、eIF2α和CHOP mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯低于模型組(P均<0.05);降糖舒心高劑量組大鼠心肌組織中PERK、eIF2α和CHOP mRNA相對(duì)表達(dá)量與降糖舒心低劑量組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05),但各指標(biāo)均明顯低于西藥組(P均<0.05)。見表3。

表3 假手術(shù)組和糖尿病合并慢性心力衰竭各組大鼠心肌組織中PERK、eIF2α和CHOP mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

2.6各組大鼠心肌組織中Cathepsin D、LC3Ⅰ、LC3 Ⅱ蛋白表達(dá)情況及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值比較 模型組大鼠心肌組織中Cathepsin D、LC3Ⅱ蛋白相對(duì)表達(dá)量及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值均明顯高于假手術(shù)組(P均<0.05);各藥物組大鼠心肌組織中Cathepsin D、LC3Ⅱ蛋白相對(duì)表達(dá)量及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值均明顯低于模型組(P均<0.05);降糖舒心低、高劑量組大鼠LC3Ⅱ蛋白相對(duì)表達(dá)量及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值均明顯低于西藥組(P均<0.05),降糖舒心低、高劑量組大鼠心肌組織中Cathepsin D、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白相對(duì)表達(dá)量及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見圖3和表4。

圖3 假手術(shù)組和糖尿病合并慢性心力衰竭各組大鼠心肌組織中Cathepsin D、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白表達(dá)電泳圖

表4 假手術(shù)組和糖尿病合并慢性心力衰竭各組大鼠心肌組織中Cathepsin、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白相對(duì)表達(dá)量及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值比較

3 討 論

自噬是由溶酶體介導(dǎo)的降解細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和細(xì)胞器的過(guò)程,該過(guò)程可維持細(xì)胞中間代謝,清除細(xì)胞內(nèi)受損的細(xì)胞或者細(xì)胞器,提高細(xì)胞的生存能力[8]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細(xì)胞中的一種細(xì)胞器,主要參與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)折疊、運(yùn)輸和翻譯后修飾,為新生多肽提供適宜的加工環(huán)境,通過(guò)分子伴侶和翻譯后修飾引導(dǎo)多肽合成二硫鍵,最終形成穩(wěn)定的三級(jí)結(jié)構(gòu),形成正確折疊的分泌蛋白[9]。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境紊亂,影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)折疊的效率,導(dǎo)致錯(cuò)誤折疊蛋白累積,就會(huì)引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,誘發(fā)未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)[9]。正常情況下,積累的未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白超過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)處理能力時(shí),自噬就會(huì)被誘導(dǎo)激活,作為次級(jí)反應(yīng)降解累積的非折疊蛋白,以減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的負(fù)荷,但持久且過(guò)度發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí),自噬的保護(hù)作用機(jī)制將逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)橐环N持續(xù)性、破壞性的作用[10]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生后,誘發(fā)UPR,上調(diào)葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78 (GRP78),激活下游PERK、活化轉(zhuǎn)錄因子6(ATF6)和肌醇需求酶1 (IRE-l)三條信號(hào)傳導(dǎo)通路,以協(xié)助清除錯(cuò)誤折疊蛋白,其中PERK是位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上具有絲氨酸/蘇氨酸結(jié)構(gòu)域的Ⅰ型跨膜蛋白,是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中重要的信號(hào)因子,其下游的信號(hào)分子是eIF2α[11]。GRP78/PERK/eIF2α信號(hào)通路是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激/UPR中一條特殊信號(hào)傳導(dǎo)途徑,也是介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與自噬交互作用的重要調(diào)控因子,生理狀態(tài)下,PERK與GRP78在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上形成穩(wěn)定復(fù)合物,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激負(fù)擔(dān)過(guò)重時(shí),GRP78與PERK解離,失去束縛的PERK則磷酸化下游信號(hào)分子eIF2α,磷酸化后eIF2α通過(guò)多種信號(hào)分子誘導(dǎo)自噬[12]。

糖尿病患者糖代謝正常途徑受損,蛋白激酶C途徑、晚期糖基化終末產(chǎn)物途徑等過(guò)度激活,使活性氧簇蓄積,影響蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)折疊,導(dǎo)致未折疊蛋白蓄積,誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)態(tài)[10]。心肌細(xì)胞是代謝旺盛的細(xì)胞,需要內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(肌漿網(wǎng))處理大量的能量物質(zhì)和細(xì)胞成分,易受糖脂代謝紊亂影響;并且在心力衰竭發(fā)展過(guò)程中,激活了RAAS系統(tǒng)和交感神經(jīng)系統(tǒng),啟動(dòng)了神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫功能的代償調(diào)節(jié)機(jī)制,產(chǎn)生各種神經(jīng)遞質(zhì)、激素、炎癥介質(zhì)[13]。因此,糖尿病合并心力衰竭患者既受到心力衰竭激活的RAAS系統(tǒng)和交感神經(jīng)系統(tǒng)受損的打擊,又受到胰島素抵抗導(dǎo)致的代謝紊亂的侵害,致使神經(jīng)體液調(diào)節(jié)和內(nèi)分泌代謝保持著一種致?lián)p性平衡。盡管糖尿病合并心力衰竭發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,但糖尿病的病理狀態(tài)下導(dǎo)致的高糖、高脂、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)及免疫失衡等均參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,作為多種應(yīng)激源的共同通路,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激將糖尿病狀態(tài)下多種危險(xiǎn)因素與心力衰竭發(fā)展相聯(lián)系,對(duì)心肌細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-自噬交互作用推波助瀾,通過(guò)UPR與自噬進(jìn)行交叉對(duì)話,產(chǎn)生持續(xù)性破壞作用,導(dǎo)致自噬水平持續(xù)增加和過(guò)度激活,甚至自噬性細(xì)胞死亡[14]。心肌細(xì)胞在成年后不具再生能力,因此心肌細(xì)胞死亡或凋亡,可導(dǎo)致心肌細(xì)胞數(shù)量絕對(duì)減少,而間質(zhì)細(xì)胞代償性增生,從而導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生過(guò)多,形成心肌纖維化,最終導(dǎo)致心肌重構(gòu)[15]。

溶酶體是自噬通路的最終降解場(chǎng)所,變性的蛋白質(zhì)和受損的細(xì)胞器包裹于溶酶體中,Cathepsin D是自噬溶酶體中降解依賴的重要水解酶,其水平可反映自噬活性,心力衰竭時(shí)其表達(dá)上調(diào)[16]。定位于前自噬體表面的LC3是自噬標(biāo)志性蛋白之一,在自噬體的延長(zhǎng)及成熟中起重要作用,LC3的合成過(guò)程經(jīng)由LC3Ⅰ的未成熟形成階段,再經(jīng)ATG7催化,LC3Ⅰ與膜磷脂磷脂酰乙醇胺作用,產(chǎn)生LC3Ⅱ(其相對(duì)量反映了自噬體的含量),LC3Ⅱ/LC3 Ⅰ比值反映自噬活性[17]。在應(yīng)激狀態(tài)下,自噬參與各種急性心臟病變,在許多慢性心臟病變過(guò)程中也可以觀測(cè)到自噬,如糖尿病合并心臟病等[18]。Li等[19]在小鼠主動(dòng)脈縮窄術(shù)的心臟肥厚實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),病變?cè)缙谧允伤较陆?隨后自噬被激活,并維持上調(diào)達(dá)9周,且與心力衰竭程度呈正相關(guān)。Kanamori等[20]研究發(fā)現(xiàn),在心肌梗死7 d后,心肌自噬水平明顯上升,表現(xiàn)為 LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值和Cathepsin D、p62均增加。因此,Cathepsin D、LC3Ⅱ表達(dá)情況既可反映心肌細(xì)胞自噬的活躍程度,又可反映溶酶體活性,體現(xiàn)自噬小體累積情況。

高血壓引起心臟負(fù)荷過(guò)重是心力衰竭的一個(gè)重要原因,心臟隨高血壓增加的壓力后負(fù)荷,適應(yīng)性地啟動(dòng)一系列代償機(jī)制增強(qiáng)心肌收縮力,導(dǎo)致左心室擴(kuò)張、肥厚,心肌纖維化等病理學(xué)改變,這種變化可適應(yīng)性降低心室壁張力,維持心臟一定射血量以滿足機(jī)體正常代謝需求,但通常伴隨著交感神經(jīng)和RASS系統(tǒng)的激活(AngⅡ水平升高),初期表現(xiàn)為一種代償性機(jī)制反應(yīng),若持續(xù)活化,則會(huì)導(dǎo)致病理性的心室重構(gòu),成為心力衰竭進(jìn)程中的重要環(huán)節(jié)。心臟超聲是評(píng)價(jià)心臟結(jié)構(gòu)和功能的一項(xiàng)客觀檢查手段,EF和FS是反映心臟功能的指標(biāo),二者降低提示左心室整體收縮功能不全;LVESD和LVEDD是反映心臟結(jié)構(gòu)的指標(biāo),二者增加提示容量負(fù)荷過(guò)重,心臟變形能力降低,心肌重構(gòu)嚴(yán)重。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,造模后模型組大鼠LVEDD、LVESD增加,FS、EF降低,糖化血紅蛋白及血清Hcy、AngⅡ水平升高(其中Hcy可與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的蛋白質(zhì)發(fā)生二硫鍵反應(yīng),擾亂內(nèi)質(zhì)網(wǎng)正常的蛋白折疊),提示心肌發(fā)生病理性重構(gòu)。Masson染色和透射電鏡觀察模型組大鼠心肌膠原纖維增生,心肌組織肌原纖維模糊,線粒體增生且變形,心肌細(xì)胞自噬小體大量增加,細(xì)胞漿內(nèi)充滿腫脹的線粒體,且內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)分子PERK、eIF2a、CHOP mRNA表達(dá)量和自噬相關(guān)蛋白Cathepsin D、LC3Ⅱ蛋白表達(dá)量及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值均明顯升高,提示慢性心力衰竭引起心肌細(xì)胞中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)邀-自噬過(guò)度激活,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-自噬反應(yīng)交互作用加強(qiáng),導(dǎo)致自噬性細(xì)胞死亡,心肌細(xì)胞數(shù)量減少,心肌間質(zhì)代償性增多,產(chǎn)生心肌纖維化和心肌重構(gòu)。

中醫(yī)認(rèn)為先天稟賦不足是糖尿病發(fā)生的重要內(nèi)在因素,飲食不節(jié)、損傷脾胃是后發(fā)因素。在發(fā)病之初,陰虛燥熱,遷延日久則致氣陰兩虛、燥熱痰瘀,氣為血之帥,氣虛無(wú)力推動(dòng)血液運(yùn)行,則加重血瘀;內(nèi)熱則耗傷津液,津虧熱結(jié),致血脈瘀滯,久而成毒。因此糖尿病合并心力衰竭以氣陰兩虛為本,瘀毒內(nèi)蘊(yùn)為標(biāo),因此治療以滋陰益氣為基礎(chǔ),強(qiáng)調(diào)活血解毒。降糖舒心方中的山茱萸、山藥、地黃是《景岳全書》治療真陰不足的左歸丸成分;人參、麥冬、五味子是李杲《內(nèi)外傷辨惑論》中滋陰、益氣、生津、養(yǎng)心的生脈散組方;加入黃連、大黃清熱解毒,燥濕祛濁;加丹參活血化瘀,養(yǎng)心血;加黃芪益氣扶正解毒。全方滋陰益氣、活血解毒。前期實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明,降糖舒心方能抑制糖尿病心肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)凋亡的通路,減輕氧化應(yīng)激-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-細(xì)胞凋亡的耦聯(lián)反應(yīng),可保護(hù)心肌組織結(jié)構(gòu)及超微結(jié)構(gòu)[21]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與模型組比較,降糖舒心低、高劑量組大鼠 LVEDD、LVESD均明顯縮短,FS和 EF均明顯升高,糖化血紅蛋白及血清Hcy、AngⅡ水平和心肌膠原纖維IOD值均明顯降低;心肌膠原纖維減少,心肌細(xì)胞自噬及纖維化程度減輕;心肌組織中PERK、eIF2α、CHOP mRNA相對(duì)表達(dá)量和Cathepsin D、LC3Ⅱ蛋白相對(duì)表達(dá)量及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值均明顯降低。提示降糖舒心方可通過(guò)調(diào)控PERK-eIF2α-LC3通路減輕自噬效應(yīng),抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-自噬的過(guò)度激活,進(jìn)而減緩糖尿病合并慢性心力衰竭心肌重構(gòu)的進(jìn)展。

綜上所述,心肌重構(gòu)發(fā)生機(jī)制復(fù)雜,但本研究發(fā)現(xiàn)調(diào)控心肌細(xì)胞過(guò)度自噬能夠有效抑制心肌纖維化,為中醫(yī)藥治療糖尿病心肌重構(gòu)提供了新的靶點(diǎn)和依據(jù)。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。