陳 旭,張星平,梁瑞寧,王凱凱,梁政亭,閆德祺,王 慧

(新疆醫(yī)科大學(xué)第四臨床醫(yī)學(xué)院,新疆 烏魯木齊 830099)

不寐屬現(xiàn)代醫(yī)學(xué)“失眠癥”范疇,指盡管在睡眠環(huán)境舒適、睡眠機(jī)會(huì)充足情況下,仍頻繁入睡困難或睡眠難以維持等導(dǎo)致患者對(duì)自身睡眠質(zhì)量或時(shí)間不滿足的一種疾病[1]。相關(guān)機(jī)制研究顯示,白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平與失眠聯(lián)系密切,失眠患者IL-6、TNF-α水平較健康人明顯升高[2-3]。IL-6水平升高能縮短慢波睡眠時(shí)長(zhǎng),影響睡眠質(zhì)量,導(dǎo)致失眠發(fā)生[4];TNF-α在調(diào)節(jié)睡眠-覺醒周期方面具有重要作用,隨著失眠患者睡眠質(zhì)量的提升,血清TNF-α水平可逐漸恢復(fù)至正常[5]。筆者團(tuán)隊(duì)在《內(nèi)經(jīng)》“五神臟”理論及歷代名家論著啟發(fā)下,確立不寐五臟病位的“中醫(yī)不寐五神分型診斷法”[6],且發(fā)現(xiàn)以夜寐早寤為主要表現(xiàn)特征的腎不藏志型不寐患者,其多導(dǎo)睡眠圖結(jié)構(gòu)參數(shù)呈現(xiàn)出NREM期中N1、N2期較常人延長(zhǎng)和REM期縮短的特征性變化[7]。本研究采用D-半乳糖聯(lián)合對(duì)氯苯丙氨酸(PCPA)構(gòu)建腎不藏志不寐大鼠模型,探尋睡眠相關(guān)因子IL-6、TNF-α在腎不藏志型不寐大鼠腎、腦、心、肝、脾、肺、大腸、膀胱組織中的表達(dá)差異。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 16只SPF級(jí)雄性SD大鼠,8周齡,體重(200±20)g,購(gòu)自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,動(dòng)物合格證號(hào):SYXK(新)2018-0003。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d,自由進(jìn)食飲水,SPF級(jí)飼養(yǎng)環(huán)境:溫度20～26 ℃,相對(duì)濕度40%～70%,空氣潔凈度7級(jí),晝夜明暗交替12 h/12 h,最小換氣次數(shù)≥15次/h。本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批后進(jìn)行(審批編號(hào):IACUC20190116-01)。

1.2主要試劑及儀器 Anti-IL-6 Antibody(AA0624512,博奧森),Anti-TNF-α Antibody(BJ07106495,博奧森),中性樹膠(G8590,Solarbio),免疫組織化學(xué)染色兔二步法試劑盒(2241D0401,中杉金橋),DAB試劑盒(218191011,中杉金橋),抗原修復(fù)液(C1034,Solarbio),無(wú)水乙醇(20210901,天津致遠(yuǎn)),二甲苯(20200920,天津致遠(yuǎn))。真空干燥箱(DZF-6090,上海一恒),電熱恒溫水浴鍋(DZKW-S-4,北京永光明),輪轉(zhuǎn)式石蠟切片機(jī)(RM2235,Leica),正置熒光生物顯微鏡(Eclipse Ni-U,Nikon),NIS-Elements D圖像采集軟件(V5.01,Nikon),Image J圖像分析軟件(V1.53,National Institutes of Health)。

1.3分組與造模方法 將16只大鼠隨機(jī)分為不寐組與對(duì)照組,每組8只。不寐組大鼠制備腎不藏志不寐模型:先予以D-半乳糖120 mg/(kg·d)頸背部皮下注射,1次/d,連續(xù)42 d,然后予以PCPA 300 mg/(kg·d)腹腔注射,1次/d,連續(xù)3 d,共45 d;當(dāng)大鼠多導(dǎo)睡眠圖NREM期中N1、N2期較正常大鼠延長(zhǎng),REM期較正常大鼠縮短的特征時(shí),表明腎不藏志型不寐模型制備成功。正常組大鼠同期同等飼養(yǎng)環(huán)境下給予等體積0.9%NaCl溶液行相應(yīng)部位注射。

1.4各臟器組織中IL-6、TNF-α表達(dá)免疫組化檢測(cè) 使用7%水合氯醛溶液(0.5 mL/100 g)腹腔注射麻醉大鼠,迅速取肝、心、脾、肺、腎、膀胱、大腸、腦組織,并先后行4%多聚甲醛沖洗固定、石蠟包埋及切片(厚度4 μm)。各組織石蠟切片經(jīng)65 ℃、120 min烤片后依次行脫蠟、復(fù)水、抗原修復(fù)、內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑室溫孵育、一抗(IL-6、TNF-α)孵育過夜、酶標(biāo)山羊抗兔IgG聚合物孵育、DAB顯色、蘇木素復(fù)染、鹽酸分化、氨水返藍(lán)、脫水、透明及中性樹膠封片。在顯微鏡下觀察相關(guān)臟器組織切片,各個(gè)組織均隨機(jī)觀察5張切片,每張切片隨機(jī)取3個(gè)視野,陰性細(xì)胞染色為藍(lán)色,陽(yáng)性細(xì)胞染色為棕褐色,應(yīng)用Image J圖像分析軟件V1.53計(jì)算平均灰度值。

2 結(jié) 果

2.12組大鼠各臟器組織中IL-6表達(dá)情況比較不寐組大鼠腎、心、腦、肺、大腸組織中IL-6表達(dá)平均灰度值均明顯高于正常組(P均<0.05),2組大鼠肝、脾、膀胱組織中IL-6表達(dá)平均灰度值比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見圖1及表1。

表1 正常組和不寐組大鼠各臟器組織中IL-6表達(dá)平均灰度值比較

圖1 正常組和不寐組大鼠各臟器組織中IL-6表達(dá)情況(免疫組化染色,×400)

2.22組大鼠各臟器組織中TNF-α表達(dá)情況比較 不寐組大鼠腎、腦、肺、大腸組織中TNF-α表達(dá)平均灰度值均明顯高于正常組(P均<0.05),2組大鼠肝、心、脾、膀胱組織中TNF-α表達(dá)平均灰度值比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見圖2及表2。

表2 正常組和不寐組大鼠各臟器組織中TNF-α表達(dá)平均灰度值比較

圖2 正常組和不寐組大鼠各臟器組織中TNF-α表達(dá)情況(免疫組化染色,×400)

3 討 論

不寐是一種睡眠難以啟動(dòng)或難以維持并伴有日間功能障礙的疾病,中國(guó)人群患病率約為15%,中老年患者占比約為35.9%[8-9]。長(zhǎng)期不寐會(huì)增加罹患精神心理疾病概率,且嚴(yán)重影響患者認(rèn)知力,是輕度認(rèn)知功能障礙及癡呆發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[10-11]。課題組前期提出的“中醫(yī)不寐五神分型診斷法”[6]將不寐病分為5種,包括以夢(mèng)繞紛紜為主訴的肝不藏魂型、以入寐維艱為主訴的心不藏神型、以睡前思慮紛紜為主訴的脾不藏意型、以睡眠輕淺易寤或頻寤為主訴的肺不藏魄型、以夜寐早寤為主訴的腎不藏志型。以上5種類型的不寐患者其睡眠多導(dǎo)圖結(jié)構(gòu)參數(shù)間存在差異,且中醫(yī)不寐五神分型與四診辨證分型在五臟定位上具有一致性[12],表明中醫(yī)不寐五神分型診斷法具有科學(xué)性及客觀性。課題組研究認(rèn)為腎不藏志型不寐的臨床單一主癥是夜寐早寤,其核心病機(jī)為腎志不入于舍,常見病因?yàn)槟I臟虛損[13]?！峨y經(jīng)》曰:“老人血?dú)馑ァ蕰內(nèi)詹荒芫?夜不得寐,故知老人不得寐也?！瘪T兆張于《馮氏錦囊秘錄》又言:“壯年腎陰強(qiáng)盛,則睡沉熟而長(zhǎng);老年陰氣衰弱,則睡輕而短?！币陨暇砻骼先耸咭阅I虛志不入舍多見,這與不寐患者以中老年多見的流行病學(xué)特征[10]相吻合。

失眠的發(fā)生與IL-6、TNF-α等多種睡眠相關(guān)因子密切相關(guān),TNF-α對(duì)睡眠有雙向調(diào)節(jié)作用,低水平TNF-α可促進(jìn)睡眠,若表達(dá)過高則導(dǎo)致失眠[5]。蘇浩[14]研究發(fā)現(xiàn),脂多糖能誘導(dǎo)失眠大鼠TLR4下游MyD88、NF-κB表達(dá),啟動(dòng)腸道局部炎癥反應(yīng),增加IL-6與TNF-α表達(dá)。Su等[15]研究報(bào)道,睡眠剝奪模型大鼠腦組織中IL-6、TNF-α水平較正常大鼠顯著增高。本研究中發(fā)現(xiàn)腎不藏志型不寐大鼠大腸及腦組織中IL-6、TNF-α水平均較正常組升高,這與前人結(jié)論相一致。HPA軸是調(diào)控機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)的重要神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng),HPA軸功能亢進(jìn)是引起失眠的重要因素[16],對(duì)大鼠進(jìn)行睡眠剝奪后,其體內(nèi)IL-6、TNF-α水平升高并激活HPA軸,給予相應(yīng)藥物干預(yù)后,IL-6、TNF-α水平降低,睡眠狀況得以改善[17],這表明通過調(diào)控IL-6、TNF-α水平能抑制亢進(jìn)的HPA軸功能,從而調(diào)節(jié)睡眠-覺醒周期,亦說明IL-6、TNF-α與失眠關(guān)系密切。長(zhǎng)期慢性失眠是心血管事件發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,也是亞臨床心臟疾病的標(biāo)志,失眠可導(dǎo)致機(jī)體神經(jīng)內(nèi)分泌功能紊亂、交感神經(jīng)興奮,刺激炎癥基因表達(dá),誘導(dǎo)IL-6的合成與釋放,炎癥反應(yīng)可損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞,促進(jìn)心血管疾病發(fā)生發(fā)展[18]。本研究中,腎不藏志型不寐大鼠心臟組織中IL-6表達(dá)水平較正常大鼠明顯升高,這亦驗(yàn)證了前述研究。本實(shí)驗(yàn)研究還發(fā)現(xiàn),腎不藏志型不寐大鼠肺、腎組織中IL-6、TNF-α表達(dá)水平均較正常大鼠升高,而肝、脾、膀胱組織中IL-6、TNF-α表達(dá)水平與正常大鼠比較未見明顯差異,其具體機(jī)制有待于后續(xù)深入研究。

綜上所述,腎不藏志型不寐大鼠腎、腦、肺、大腸組織中IL-6、TNF-α表達(dá)水平和心組織中IL-6表達(dá)水平均較正常大鼠升高,IL-6、TNF-α的特征性變化可能是腎不藏志型不寐的特征性變化之一。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。