劉莉莉 陳 敏

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,哈爾濱 150040)

在乳業(yè)中,奶牛乳腺炎是一種病因復(fù)雜且高發(fā)的疾病,如果治療不及時(shí)或不徹底,則很難恢復(fù),并有復(fù)發(fā)和乳房膿腫的風(fēng)險(xiǎn)。乳腺炎發(fā)生后,乳汁的乳脂率和乳蛋白率等顯著降低,降低了乳汁的產(chǎn)量和品質(zhì),造成的經(jīng)濟(jì)損失在奶牛的各種疾病中居于首位。乳腺炎主要由病原微生物引起,尤其是革蘭氏陰性菌[1-2]。細(xì)菌感染后,乳腺內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大量的內(nèi)毒素。內(nèi)毒素的主要成分是脂多糖(LPS),它能使機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫原性反應(yīng)。LPS可誘導(dǎo)乳腺上皮細(xì)胞或巨噬細(xì)胞的免疫應(yīng)答,分泌大量炎癥因子,因此LPS常被作為建立炎癥動(dòng)物模型的重要誘導(dǎo)物[3-4]。研究表明,LPS可與Toll樣受體4(TLR4)結(jié)合,激活乳腺上皮細(xì)胞中的核因子-κB(NF-κB)等多種信號通路,進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞中白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等促炎細(xì)胞因子的釋放以及環(huán)氧合酶-2(COX-2)和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)的產(chǎn)生,明顯擴(kuò)大炎癥反應(yīng),促進(jìn)炎癥加重[5]。奶牛乳腺炎發(fā)生時(shí),乳腺組織的損傷會(huì)導(dǎo)致乳汁中乳蛋白等營養(yǎng)成分含量的降低,同樣,奶牛乳腺上皮細(xì)胞炎癥模型中乳蛋白相關(guān)因子的表達(dá)量也會(huì)顯著下調(diào)[6]。哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號途徑以及酪氨酸激酶2(JAK2)/細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子5(STAT5)信號途徑主要調(diào)控乳腺上皮細(xì)胞中乳蛋白的合成,而且2條信號途徑之間可相互影響,共同調(diào)控泌乳相關(guān)因子等合成乳蛋白[7]。研究發(fā)現(xiàn),LPS可能通過抑制乳蛋白合成通路mTOR和STAT5及其下游相關(guān)基因的表達(dá),從而降低奶牛乳腺上皮細(xì)胞乳蛋白合成分泌功能[8]。

在臨床應(yīng)用中,乳腺炎的主要治療方法是使用抗生素,但其不能有效控制炎癥過程[9]。近期研究表明,聯(lián)合使用抗生素和天然抗炎藥物可有效緩解乳腺炎的進(jìn)一步發(fā)展[10-11]。與抗生素相比,天然產(chǎn)物往往具有較強(qiáng)的抗炎作用,而且具有低毒、無殘留、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn),牛奶中也不會(huì)發(fā)生抗生素和耐藥菌殘留進(jìn)入食物鏈而影響人體健康。因此,天然產(chǎn)物在乳腺炎治療中的應(yīng)用日益廣泛,尋找新的有效的天然抗炎藥物是目前奶牛乳腺炎治療的熱點(diǎn)。β-谷甾醇(BSS)是植物甾醇的一種,是很多藥用植物的重要活性成分。臨床試驗(yàn)證實(shí)β-谷甾醇具有降膽固醇、降血糖、抗氧化、抑菌和抗癌等多種生物活性。β-谷甾醇在小鼠胃組織炎癥[12]、葡聚糖酸鈉誘導(dǎo)的小鼠急性結(jié)腸炎[13]、慢性肥胖相關(guān)炎癥[14]等炎癥模型中發(fā)揮一定的抗炎作用。然而,β-谷甾醇對乳腺炎動(dòng)物重要營養(yǎng)成分乳蛋白合成的影響尚未見報(bào)道。因此,本研究利用LPS構(gòu)建了小鼠乳腺炎的體外模型,旨在探討β-谷甾醇對LPS誘導(dǎo)的小鼠乳腺上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)及乳蛋白合成的影響,為β-谷甾醇在緩解乳腺炎的進(jìn)一步應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

小鼠乳腺上皮細(xì)胞(HC11細(xì)胞)購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。

1.2 主要試劑

β-谷甾醇(純度>98%)購自成都某生物科技有限公司。噻唑蘭(MTT)法細(xì)胞活力檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;RPMI-1640干粉、胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司;Trizol購自美國Invitrogen公司;Prime ScriptTMRT reagent Kit試劑盒、SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒購自日本TaKaRa公司。STAT5、磷酸化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子5(p-STAT5)、JAK2、磷酸化酪氨酸激酶2(p-JAK2)、mTOR、磷酸化哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)和β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)一抗購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和方法

1.3.1 HC11細(xì)胞的培養(yǎng)

采用生長培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)HC11細(xì)胞,每隔24 h更換新鮮培養(yǎng)基。

1.3.2 β-谷甾醇及LPS對HC11細(xì)胞活力影響的檢測

試驗(yàn)分為對照組(CON組,生長培養(yǎng)基處理)、乳腺炎癥模型組(LPS組,1 μg/mL LPS處理)以及炎癥模型藥物組(BSS+LPS組,分別用5、10、20 μmol/L的β-谷甾醇預(yù)處理1 h后加入1 μg/mL LPS),每組設(shè)置5個(gè)重復(fù)。將處于對數(shù)生長期的HC11細(xì)胞接種于96孔板(1×104個(gè)/孔)中培養(yǎng)過夜,更換新鮮培養(yǎng)基并添加藥物處理24 h后,各孔加入10 μL MTT(5 mg/mL),繼續(xù)培養(yǎng)4 h后吸出培養(yǎng)液,各孔加入100 μL二甲基亞砜(DMSO)以溶解細(xì)胞中的甲瓚結(jié)晶,振蕩10 min后用酶標(biāo)儀檢測各孔在490 nm的吸光度(OD)值并進(jìn)行計(jì)算,試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.3 β-谷甾醇對LPS誘導(dǎo)的HC11細(xì)胞炎性細(xì)胞因子、乳蛋白及乳蛋白合成信號通路相關(guān)基因mRNA表達(dá)的檢測

試驗(yàn)分組及藥物處理方法同1.3.2。將處于對數(shù)生長期的HC11細(xì)胞接種于6孔板中,待細(xì)胞融合度達(dá)到70%～80%時(shí),添加藥物作用細(xì)胞24 h后收集細(xì)胞,Trizol法提取RNA,根據(jù)Prime ScriptTMRT reagent Kit試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)試劑盒(SYBR Premix Ex TaqTM)檢測HC11細(xì)胞TNF-α、COX-2、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、IL-1β、iNOS、β酪蛋白(CSN2)、κ酪蛋白(CSN3)、乳清蛋白(LALBA)、STAT5、JAK2、mTOR、真核細(xì)胞翻譯啟動(dòng)因子4E結(jié)合蛋白1(4EBP1)、核糖體蛋白S6激酶1(S6K1)的mRNA表達(dá)水平。試驗(yàn)所用基因的引物序列見表1,選用β-actin作為內(nèi)參基因。qRT-PCR結(jié)果采用2-ΔΔCt相對定量的方法計(jì)算各目的基因的mRNA相對表達(dá)量。

表1 引物序列

1.3.4 β-谷甾醇對LPS誘導(dǎo)的HC11細(xì)胞乳蛋白合成信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的檢測

試驗(yàn)分組及藥物處理方法同1.3.2。將處于對數(shù)生長期的HC11細(xì)胞接種于6孔板中,待細(xì)胞融合度達(dá)到70%～80%時(shí),添加藥物作用細(xì)胞24 h后收集細(xì)胞提蛋白,Western blotting方法檢測STAT5、p-STAT5、JAK2、p-JAK2、mTOR和p-mTOR的蛋白相對表達(dá)量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22.0軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和Duncan氏法多重比較。試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 β-谷甾醇對LPS誘導(dǎo)的HC11細(xì)胞活力的影響

利用MTT法檢測LPS單獨(dú)處理以及5、10、20 μmol/L BSS+LPS共處理對HC11細(xì)胞活力的影響,結(jié)果如圖1所示。與CON組相比,LPS組和5、10、20 μmol/L BSS+LPS組HC11細(xì)胞相對增殖率均無顯著差異(P>0.05)。這說明LPS和β-谷甾醇對HC11細(xì)胞活力無影響,后續(xù)試驗(yàn)結(jié)果不受HC11細(xì)胞活力變化的影響。

數(shù)據(jù)柱標(biāo)相同或無小寫字母表示差異不顯著(P>0.05),不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下圖同。

2.2 β-谷甾醇對LPS誘導(dǎo)的HC11細(xì)胞炎性細(xì)胞因子mRNA表達(dá)的影響

如圖2所示,與CON組相比,LPS組的HC11細(xì)胞TNF-α、IL-6、IL-1β、COX-2和iNOS的mRNA相對表達(dá)量均顯著升高(P<0.05)。與LPS組相比,5、10、20 μmol/L BSS+LPS組的HC11細(xì)胞TNF-α、IL-6、IL-1β、COX-2和iNOS的mRNA相對表達(dá)量均顯著下降(P<0.05);其中,5 μmol/L BSS+LPS組和10 μmol/L BSS+LPS組的HC11細(xì)胞炎性細(xì)胞因子的mRNA相對表達(dá)量較低。

2.3 β-谷甾醇對LPS誘導(dǎo)的HC11細(xì)胞乳蛋白mRNA表達(dá)的影響

如圖3所示,與CON組相比,LPS組的HC11細(xì)胞CSN2、CSN3和LALBA的mRNA相對表達(dá)量均顯著降低(P<0.05)。與LPS組相比,5、10、20 μmol/L BSS+LPS組的HC11細(xì)胞CSN2、CSN3和LALBA的mRNA相對表達(dá)量均顯著升高(P<0.05);其中,5 μmol/L BSS+LPS組的HC11細(xì)胞CSN2、CSN3和LALBA的mRNA相對表達(dá)量較高。

2.4 β-谷甾醇對LPS誘導(dǎo)的HC11細(xì)胞乳蛋白合成通路相關(guān)基因mRNA和蛋白表達(dá)的影響

如圖4和圖5所示,與CON組相比,LPS組的HC11細(xì)胞STAT5、JAK2、mTOR、4EBP1和S6K1的mRNA相對表達(dá)量均顯著降低(P<0.05),同時(shí)p-STAT5、p-JAK2和p-mTOR的蛋白相對表達(dá)量也顯著降低(P<0.05)。與LPS組相比,5、10、20 μmol/L BSS+LPS組的HC11細(xì)胞STAT5、JAK2、mTOR、4EBP1和S6K1的mRNA相對表達(dá)量均顯著升高(P<0.05),同時(shí)p-STAT5、p-JAK2和p-mTOR的蛋白相對表達(dá)量也顯著升高(P<0.05);其中,5 μmol/L BSS+LPS組和10 μmol/L BSS+LPS組的HC11細(xì)胞STAT5、JAK2、mTOR和S6K1的mRNA和蛋白相對表達(dá)量較高。

3 討 論

牛乳腺炎是影響世界乳業(yè)的重要疾病,會(huì)導(dǎo)致牛奶產(chǎn)量和質(zhì)量的降低,從而給乳業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。牛乳腺炎可由多種因素引起,最常見的因素是病原體感染,包括革蘭氏陰性菌在內(nèi)的多種微生物可引起乳腺炎,其中乳腺上皮細(xì)胞參與了抵御病原微生物入侵的第1道防線。

3.1 β-谷甾醇對LPS誘導(dǎo)的HC11細(xì)胞炎性細(xì)胞因子mRNA表達(dá)的影響

研究表明,LPS通過與乳腺上皮細(xì)胞膜的模式識別受體TLR4結(jié)合,激活多種炎癥反應(yīng)信號通路,導(dǎo)致各種炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS和COX-2的產(chǎn)生,這些炎癥介質(zhì)能夠進(jìn)一步放大炎癥過程[15]。因此,常用LPS誘導(dǎo)乳腺上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)模型來研究乳腺炎潛在治療藥物的抗炎機(jī)制。炎性細(xì)胞因子能促進(jìn)炎癥的發(fā)生發(fā)展,TNF-α是感染早期的主要炎癥因子,對中性粒細(xì)胞具有趨化作用。與TNF-α一樣,IL-6和IL-1β在炎癥過程中發(fā)揮重要作用。研究表明,一些植物活性成分可以通過抑制TNF-α、IL-6和IL-1β的產(chǎn)生來減弱LPS誘導(dǎo)的乳腺炎[16-17]。

圖2 β-谷甾醇對LPS誘導(dǎo)的HC11細(xì)胞炎性細(xì)胞因子mRNA表達(dá)的影響

圖3 β-谷甾醇對LPS誘導(dǎo)的HC11細(xì)胞乳蛋白mRNA表達(dá)的影響

本研究發(fā)現(xiàn),與CON組相比,LPS組的HC11細(xì)胞TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA相對表達(dá)量顯著升高;β-谷甾醇能顯著抑制TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA表達(dá),其中5和10 μmol/L β-谷甾醇抑制效果較好。Bi等[18]研究發(fā)現(xiàn),β-谷甾醇可以抑制LPS刺激的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA表達(dá)。β-谷甾醇降低了過敏性哮喘大鼠炎癥模型肺臟組織中TNF-α、IL-6等炎癥因子的含量[19]。這些研究為本試驗(yàn)的結(jié)果提供了依據(jù)。COX-2是一種由細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)生理刺激(如LPS和TNF-α)激活的誘導(dǎo)酶;iNOS是一種一氧化氮合酶,被炎癥、組織損傷等病理刺激激活,抑制iNOS的mRNA表達(dá)可以降低炎癥介質(zhì)一氧化氮(NO)含量。因此,COX-2和iNOS常被作為炎癥標(biāo)志物,它們的高表達(dá)與氧化應(yīng)激和炎癥的發(fā)生密切相關(guān)[20-21]。研究發(fā)現(xiàn),iNOS和COX-2在LPS誘導(dǎo)的乳腺炎小鼠乳腺組織中也大量表達(dá)[22]。芹菜素和大豆活性肽等植物活性成分可以通過抑制LPS誘導(dǎo)的體內(nèi)、體外乳腺炎模型中iNOS和COX-2的產(chǎn)生緩解乳腺炎[23-24]。Sun等[25]證明β-谷甾醇可抑制LPS誘導(dǎo)的小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥介質(zhì)IL-6、iNOS、TNF-α和COX-2的mRNA表達(dá)。本研究也發(fā)現(xiàn),β-谷甾醇能抑制LPS誘導(dǎo)的小鼠HC11細(xì)胞iNOS和COX-2的mRNA表達(dá),并且5和10 μmol/L β-谷甾醇的抑制效果較好。這些結(jié)果表明,β-谷甾醇可通過抑制促炎介質(zhì)TNF-α、IL-6、IL-1β、iNOS和COX-2的mRNA表達(dá)來抑制乳腺炎的發(fā)展,而且研究提示低劑量的β-谷甾醇對小鼠乳腺炎癥反應(yīng)的抑制效果較好。

圖4 β-谷甾醇對LPS誘導(dǎo)的HC11細(xì)胞乳蛋白合成信號通路相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響

圖5 β-谷甾醇對LPS誘導(dǎo)的HC11細(xì)胞乳蛋白合成信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3.2 β-谷甾醇對LPS誘導(dǎo)的HC11細(xì)胞乳蛋白mRNA表達(dá)的影響

乳蛋白是牛乳的重要營養(yǎng)成分,主要成分為酪蛋白和LALBA。牛乳中酪蛋白有αs1酪蛋白(CSN1S1)、CSN2、αs2酪蛋白(CSN1S2)和CSN3等4種亞型。乳蛋白的合成受多種信號通路和激素在多個(gè)水平上的調(diào)控。LPS對乳蛋白合成有顯著的抑制作用,Spitzer等[26]通過檢測乳蛋白基因表達(dá)發(fā)現(xiàn)LPS顯著降低了CSN2和LALBA的mRNA相對表達(dá)量。原利榮[27]發(fā)現(xiàn)LPS刺激能降低奶牛乳腺組織CSN2、CSN1S1和CSN3的mRNA相對表達(dá)量。李彥霞等[28]研究表明,大腸桿菌型乳房炎奶牛的乳腺組織中CSN1S1、CSN2和LALBA的mRNA相對表達(dá)量與健康奶牛相比均顯著下調(diào)。植物提取物活性成分豐富,對乳腺炎奶牛乳蛋白率有明顯的改善作用。Liu等[29]研究發(fā)現(xiàn),薄荷醇可能通過抑制LPS誘導(dǎo)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞炎癥因子的表達(dá),進(jìn)而上調(diào)β酪蛋白的表達(dá)。辣木提取物能上調(diào)LPS刺激的奶牛乳腺上皮細(xì)胞CSN1S1、CSN1S2和CSN2的mRNA相對表達(dá)量[30]。為了探究β-谷甾醇在抑制小鼠乳腺上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)的同時(shí)是否可以改善乳蛋白的合成,本研究檢測了β-谷甾醇對LPS誘導(dǎo)的HC11細(xì)胞乳蛋白mRNA表達(dá)的影響,結(jié)果表明LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)可降低HC11細(xì)胞CSN2、CSN3和LALBA的mRNA相對表達(dá)量;而不同濃度的β-谷甾醇能不同程度地提高LPS誘導(dǎo)的HC11細(xì)胞CSN2、CSN3和LALBA的mRNA相對表達(dá)量,其中5 μmol/L BSS+LPS組CSN2、CSN3和LALBA的mRNA相對表達(dá)量最高。這些結(jié)果表明,β-谷甾醇在緩解LPS誘導(dǎo)的HC11細(xì)胞炎癥反應(yīng)的同時(shí)可提高乳蛋白的合成,而且低劑量的β-谷甾醇上調(diào)乳蛋白mRNA表達(dá)的效果最明顯。

3.3 β-谷甾醇對LPS誘導(dǎo)的HC11細(xì)胞乳蛋白合成通路相關(guān)基因mRNA和蛋白表達(dá)的影響

哺乳動(dòng)物mTOR通路和JAK2/STAT5通路是眾所周知的調(diào)控乳腺中乳蛋白合成的關(guān)鍵信號通路。催乳素和促泌乳相關(guān)因子可通過JAK2使STAT5磷酸化,p-STAT5形成二聚體,進(jìn)入細(xì)胞核與乳蛋白基因的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子結(jié)合,誘導(dǎo)其表達(dá),從而促進(jìn)乳蛋白合成。激活的mTOR磷酸化其下游效應(yīng)因子4EBP1,真核細(xì)胞翻譯起始因子4E(eIF4E)與未磷酸化的4EBP1結(jié)合可抑制蛋白質(zhì)的翻譯;而4EBP1經(jīng)mTOR磷酸化后會(huì)與eIF4E脫離,促進(jìn)乳蛋白的合成。mTOR還能夠促進(jìn)S6K1磷酸化,增強(qiáng)含嘧啶基因mRNA的翻譯,進(jìn)而調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的合成[31]。占今舜等[32]研究發(fā)現(xiàn),LPS刺激的奶牛乳腺上皮細(xì)胞乳蛋白合成通路相關(guān)基因STAT5、mTOR和4EBP1的mRNA相對表達(dá)量顯著降低。Zhang等[33]研究發(fā)現(xiàn),LPS能降低奶牛乳腺上皮細(xì)胞中CSN1S1、CSN3、JAK2、STAT5、mTOR、4EBP1、S6K1的mRNA相對表達(dá)量。研究表明,植物提取物可能通過促進(jìn)乳蛋白合成信號通路相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄及磷酸化蛋白表達(dá)而提高LPS誘導(dǎo)的乳腺上皮細(xì)胞中乳蛋白合成水平。胡耀等[34]研究發(fā)現(xiàn),黃花蒿乙醇提取物能上調(diào)LPS誘導(dǎo)損傷的奶牛乳腺上皮細(xì)胞中mTOR、S6K1、4EBP1、JAK2和STAT5的mRNA相對表達(dá)量。黃芪甲苷處理炎癥乳腺上皮細(xì)胞時(shí)可促進(jìn)CSN2基因表達(dá),并可顯著激活p-mTOR蛋白表達(dá)[35]。本研究結(jié)果顯示,LPS誘導(dǎo)顯著下調(diào)了HC11細(xì)胞乳蛋白合成信號通路相關(guān)基因的mRNA相對表達(dá)量,與前人研究結(jié)果一致。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn),與LPS誘導(dǎo)損傷的炎癥模型HC11細(xì)胞相比,β-谷甾醇能上調(diào)mTOR、S6K1、4EBP1、JAK2和STAT5的mRNA相對表達(dá)量及p-mTOR、p-STAT5、p-JAK2的蛋白相對表達(dá)量,其中5和10 μmol/L β-谷甾醇提高乳蛋白合成信號通路相關(guān)基因mRNA和蛋白表達(dá)的效果最好。這表明β-谷甾醇可能通過影響mTOR及JAK2/STAT5信號通路來促進(jìn)炎癥模型HC11細(xì)胞中乳蛋白的合成。

4 結(jié) 論

β-谷甾醇可抑制LPS誘導(dǎo)的小鼠乳腺上皮細(xì)胞炎性細(xì)胞因子的mRNA表達(dá),同時(shí)可上調(diào)LPS誘導(dǎo)的小鼠乳腺上皮細(xì)胞乳蛋白合成信號通路(mTOR通路及JAK2/STAT5通路)相關(guān)基因的mRNA和蛋白表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)乳蛋白的mRNA表達(dá)。綜合比較,以低劑量的β-谷甾醇緩解LPS誘導(dǎo)的HC11細(xì)胞炎癥反應(yīng)以及促進(jìn)乳蛋白合成的效果較好。