王飛燕李志凌尹博豐李佩霖郝瑞聰韓夢月李曉彤田家儀丁麗武文卿朱恒*

（1. 安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，合肥 230032；2. 軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850；3. 空軍特色醫(yī)學(xué)中心血液科，北京 100142；4. 軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院實驗動物中心，北京 100071）

骨缺損［1］是臨床上較為常見的骨損傷類型之一。 嚴(yán)重開放性骨折、高能量創(chuàng)傷、爆炸傷、需要清創(chuàng)處置的骨感染和骨腫瘤切除術(shù)等多種場景均會導(dǎo)致骨缺損發(fā)生。 雖然骨組織有一定的自我修復(fù)能力［2］，但如果缺損組織較多，機(jī)體很難完全自我恢復(fù)骨的結(jié)構(gòu)與功能［3］。 此外骨缺損區(qū)域往往呈不規(guī)則狀，事先預(yù)制的填充材料往往不能完成無縫隙填充，影響了再生修復(fù)的效果［4］。

目前骨缺損的主要治療方法有骨移植［5］、骨組織工程技術(shù)［6］、基因治療［7］等。 骨移植是治療骨缺損的常用且有效方法之一，其主要包括自體骨移植和異體（異種）骨移植及人工骨修復(fù)材料三大類。自體骨來源有限［8］，同種異體骨也具有免疫原性和交叉感染的潛在危險以及倫理學(xué)的限制［9］，人工骨修復(fù)材料目前仍存在活性不足和骨傳導(dǎo)性差等缺點［10］。 在臨床迫切需求的驅(qū)動下，骨組織工程技術(shù)應(yīng)運而生［11］。 骨再生生物材料是一類組織工程支架［12］，可以支持骨缺損部位的再生過程［13］，同時在原位降解后能夠被新生成的骨組織取代［14］。 近年來，水凝膠［15］、納米纖維支架［16］、3D 打印復(fù)合支架［17］等多種形式的骨修復(fù)材料已取得重要進(jìn)展［18］，其中水凝膠顯示出與水相似的物理特性，可以模擬人體的組織環(huán)境，以最小的侵入方式為缺損部位提供結(jié)構(gòu)支持，使骨缺損通過內(nèi)在愈合機(jī)制進(jìn)行再生修復(fù)，具有獨特的優(yōu)勢［19］。

甲基丙烯?；髂z（gelatin methacryloyl，GelMA）為烯烴雙鍵改性明膠，是一種光敏性的生物水凝膠材料［20］。 GelMA 水凝膠具有優(yōu)異的生物相容性和細(xì)胞反應(yīng)特性［21］，例如提供合適的細(xì)胞粘附位點［22］，因此可以取代人工基底膜或其他天然膠原蛋白水凝膠［23］。 此外，GelMA 水凝膠具有良好的機(jī)械性能，用GelMA 構(gòu)建的3D 微支架可根據(jù)需求調(diào)整其機(jī)械特性［24］。 研究表明，通過可注射GelMA 水凝膠遞送的人尿液來源的干細(xì)胞外泌體加速骨再生［25］。

小鼠是一種常用的實驗動物，便于構(gòu)建基因動物模型，有利于從分子、細(xì)胞和動物等多水平評價再生支架材料［26］。 目前關(guān)于小鼠骨缺損模型應(yīng)用于可注射式再生支架評估的相關(guān)研究數(shù)量稀少，相關(guān)領(lǐng)域工作進(jìn)展緩慢。 基于此，本研究旨在建立基于可注射式再生支架的小鼠股骨缺損再生修復(fù)模型，探究GelMA 對小鼠股骨缺損再生修復(fù)的影響，為將來研究可注射式再生支架修復(fù)骨缺損提供一種小鼠模型。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

40 只8 周齡健康雌性SPF 級C57BL／6N 小鼠，體重16 ～22 g，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司【SCXK（京）2021－0006】。 小鼠飼養(yǎng)于軍事醫(yī)學(xué)研究院實驗動物中心【SYXK（京）2017－0023】，常規(guī)飼料喂養(yǎng)，自由飲食水，日光燈12 h 明暗交替，溫度22 ～24℃，相對濕度40% ～55%。 本實驗所有操作均經(jīng)過軍事醫(yī)學(xué)研究院實驗動物中心實驗倫理審批（IACUC-DWZX-2023-505）。

1.1.2 主要試劑與儀器

甲基丙烯?；髂z（GelMA）（蘇州永沁泉智能設(shè)備有限公司），型號：EFL-GM-60，組分A：GelMA，白色海綿狀，每瓶1 g；組分B：光引發(fā)劑LAP，白色粉末狀，每瓶0.05 g；4%通用型組織固定液（武漢塞維爾生物科技有限公司）；兔抗小鼠抗體OCN（23418-1-AP，proteintech）；Masson 三色染色液試劑盒（G1006-20 ML，武漢塞維爾生物科技有限公司）；蘇木精-伊紅（HE）高清恒染試劑盒（G1076-500 ML，武漢塞維爾生物科技有限公司）；組織RNA 提取試劑盒plus（RN002plus， ES Science）；PCR Pipettes（5-000-1001-x10， Drummond Scientific Company）。紫外光固化電源（蘇州永沁泉智能設(shè)備有限公司）；雙孔恒溫水浴鍋（LC-WB-2，LICHEN 力辰）；低速臺式離心機(jī)（湘儀L500）；正置光學(xué)顯微鏡和成像系統(tǒng)均為日本尼康產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 可注射式再生支架的制備

（1）光敏性可注射式再生支架原理：甲基丙烯?；髂z（GelMA）為烯烴雙鍵改性明膠，其可通過紫外光及可見光在光引發(fā)劑作用下迅速固化成膠。GelMA 光固化水凝膠兼具天然和合成生物材料的特征，具有適于細(xì)胞生長和分化的三維（3D）結(jié)構(gòu)。

（2）光敏性可注射式再生支架配置：首先配制0.25%光引發(fā)劑標(biāo)準(zhǔn)溶液，向裝有光引發(fā)劑LAP（0.25 g）的棕色瓶中加10 mL PBS，40 ～50℃水浴加熱15 min，期間振蕩數(shù)次，使其充分溶解，分裝至10 mL 離心管中，每管0.5 mL，再加4.5 mL PBS，配制成終濃度0.25%的標(biāo)準(zhǔn)溶液，該標(biāo)準(zhǔn)液可在4℃避光下保存12 個月。 接著配制15%（w／v）GelMA濃縮溶液，稱取0.09 g GelMA，放入避光離心管中，加600 μL 上述光引發(fā)劑標(biāo)準(zhǔn)溶液（圖1A）；60 ～70℃水浴加熱20 ～30 min，期間振蕩數(shù)次，使其充分溶解；立即用0.22 μm 除菌濾器過濾滅菌，并將其分裝后分別稀釋為5%、10%、15% 3 個濃度，5%：取50 μL GelMA 濃縮液＋100 μL LAP 標(biāo)準(zhǔn)液；10%：取100 μL GelMA 濃縮液＋50 μL LAP 標(biāo)準(zhǔn)液；15%：取150 μL GelMA 濃縮液。 使用紫外光評估3D 微支架GelMA 的光固化性（圖1B），使用PCR Pipettes 移液器評估3D 微支架GelMA 的可注射性（圖1C）。

圖1 GelMA 水凝膠制備過程Figure 1 GelMA hydrogel preparation process

1.2.2 小鼠股骨缺損動物分組及模型干預(yù)

小鼠正常喂養(yǎng)1 周后隨機(jī)分為4 組：骨缺損組（n＝10），5% GelMA 組（n＝10），10% GelMA 組（n＝10），15% GelMA 組（n＝10）。 用2%戊巴比妥鈉（按0.25 ～0.3 mL／100 g）腹腔注射麻醉小鼠，剝離小鼠大腿皮膚、肌肉組織和骨膜，完全暴露股骨外側(cè)面（圖2A）；隨后，各組操作如下，骨缺損組：使用鉆頭直徑為1 mm 的STRONG90 微型直流高速調(diào)速電鉆在股骨中、下1／3 交界點制備骨缺損模型［18］，確認(rèn)深度可達(dá)骨髓腔，同時不穿過對側(cè)皮質(zhì)骨（圖2B）；5% GelMA 組：造模方式同骨缺損組，后用PCR Pipettes 移液器向缺損處注射5% GelMA（2 ～3 μL）（圖2C）；10% GelMA 組：造模方式同骨缺損組，后用PCR Pipettes 移液器向缺損處注射10% GelMA（2 ～3 μL）；15% GelMA：造模方式同骨缺損組，后用PCR Pipettes 移液器向缺損處注射15%水凝膠（2 ～3 μL）。 每組注射結(jié)束后，均立刻用紫外光固化電源在骨缺損位置照射30 s（圖2D），最后小心對位縫合肌肉和皮膚，整個過程嚴(yán)密消毒。

圖2 小鼠股骨缺損模型建立及GelMA 水凝膠注射過程Figure 2 Establishment of mouse femur bone defect model and GelMA hydrogel injection process

1.2.3 HE 染色

造模2 周后［13］，將小鼠麻醉處死，取造模側(cè)股骨用4%通用型組織固定液固定48 h，10% EDTA 脫鈣，石蠟包埋、切片，制備骨缺損區(qū)域的5 μm 矢狀切片，使用HE 高清恒染試劑盒，將切片置于二甲苯中脫蠟，隨后放入蘇木素染液0.5 ～1 min；自來水漂洗，1%鹽酸乙醇分化3 ～5 s；自來水漂洗，然后1%氨水溶液返藍(lán)1 min；流水沖洗20 s，放入伊紅染液中染色15 ～30 s；流水漂洗，依次放入75%乙醇2 min， 85%乙醇2 min，無水乙醇5 min，無水乙醇5 min， 環(huán)保型脫蠟透明液透明5 min，最后用中性樹膠封片，倒置顯微鏡下觀察骨組織形成情況。

1.2.4 Masson 染色

使用Masson 三色染色液進(jìn)行Masson 染色。 切片常規(guī)脫蠟，用配制好的Weigert 鐵蘇木素染色5 ～10 min；用酸性乙醇分化液分化，水洗；用Masson 藍(lán)化液返藍(lán)，水洗；麗春紅品紅染色液染色5 ～ 10 min；以2%冰醋酸水溶液洗1 min；1%磷鉬酸水溶液分化3 ～5 min，2%冰醋酸水溶液洗1 min；不經(jīng)水洗，直接用苯胺藍(lán)水溶液或1%光綠水溶液染1 ～2 min；以0.2%冰醋酸水溶液洗1 min；95%乙醇脫水2 ～3 s，無水乙醇脫水3 次，每次5 s，環(huán)保型脫蠟透明液透明3 次，每次1 min，中性樹膠封固。

1.2.5 RT-qPCR 分析

取各組小鼠造模側(cè)股骨缺損處組織，放入做好標(biāo)記的Ep 管內(nèi)，按照組織RNA 提取試劑盒說明書提取骨組織總RNA。 計算樣品總RNA 濃度；根據(jù)小鼠OCN、Osterix 序列，使用Premier 5.0 設(shè)計合成擴(kuò)增OCN、Osterix 片段的特異性引物（以GAPDH 基因作為內(nèi)參），進(jìn)行引物序列設(shè)計（見表1）；根據(jù)反轉(zhuǎn)錄以及PCR 反應(yīng)體系，進(jìn)行RT-qPCR 實驗。 為減少誤差，各組OCN、Osterix 的表達(dá)水平均以相對表達(dá)量表示。

表1 各檢測基因的引物序列Table 1 Primer sequences of each detected gene

1.2.6 免疫組織化學(xué)染色

取材、固定、包埋、切片方法同HE 和Masson 染色，石蠟切片梯度乙醇脫水，用內(nèi)源性過氧化物酶淬滅、抗原修復(fù)并阻斷非特異性結(jié)合位點后，將股骨切片與OCN 抗體一起孵育過夜，接著滴加與一抗相應(yīng)種屬的二抗孵育1 h，最后DAB 顯色，復(fù)染細(xì)胞核，脫水封片，光學(xué)顯微鏡采圖。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 組織學(xué)觀察

2.1.1 HE 染色

HE 染色觀察骨缺損處的組織結(jié)構(gòu)。 術(shù)后2周，骨缺損組大部分骨小梁仍處于重塑期，骨小梁排列連續(xù)性、致密性較差；10% GelMA 組骨組織結(jié)構(gòu)及骨缺損愈合情況顯著優(yōu)于其他各組。 顯微鏡下可見較多成熟骨小梁，結(jié)構(gòu)連續(xù)，排列整齊、致密；5% GelMA 組和15% GelMA 組，成熟骨小梁數(shù)量少于10% GelMA 組，見少量骨組織形成，但骨小梁排列整齊性、連續(xù)性、致密性較10% GelMA 組差，如圖3。

圖3 植入GelMA 后各組小鼠股骨缺損區(qū)（HE 染色，n ≥3）Figure 3 Femur defect of mice in each group after GelMA implantation （HE staining，n ≥3）

2.1.2 Masson 染色

Masson 骨膠原染色觀察骨缺損處的新骨形成情況。 其結(jié)果顯示4 組均可見骨缺損部位出現(xiàn)藍(lán)染的新生骨和骨膠原組織，其間夾雜呈點狀或條狀分布的紅染纖維組織。 其中10% GelMA 組的新生骨量面積及膠原、纖維組織生成明顯多于骨缺損組、5% GelMA 組和15% GelMA 組，如圖4。

圖4 植入GelMA 后各組小鼠股骨缺損區(qū)（Masson 染色，n ≥3）Figure 4 Femoral defect of mice in each group after GelMA implantation （Masson staining，n ≥3）

2.2 RT-qPCR 分析

OCN mRNA 檢測顯示：10% GelMA 組小鼠骨缺損部位OCN 表達(dá)顯著高于骨缺損組（P＜0.001）、5% GelMA 組（P＜0.01）和15% GelMA 組（P＜0.01）；5% GelMA 組和15% GelMA 組相比OCN mRNA 水平無顯著差異，但都高于骨缺損組，如圖5A。 Osterix mRNA 檢測顯示：10% GelMA 組Osterix mRNA 表達(dá)水平明顯高于骨缺損組（P＜0.001）、5% GelMA 組（P＜0.001）和15% GelMA 組（P＜0.01）；5% GelMA 組和15% GelMA 組與骨缺損組相比Osterix mRNA 表達(dá)水平無顯著差異，如圖5B。

圖5 各組小鼠骨缺損組織RT-qPCR 表達(dá)情況（n ≥3）Figure 5 Expression of RT-qPCR in bone defect tissue of mice in each group（n ≥3）

2.3 免疫組化染色分析

免疫組化染色觀察成骨標(biāo)志物OCN 在各組股骨缺損處的表達(dá)情況。 結(jié)果顯示5% GelMA 組OCN 蛋白表達(dá)量與骨缺損組比無統(tǒng)計學(xué)意義；10%GelMA 組OCN 蛋白表達(dá)量明顯高于骨缺損組（P＜0.01）、5% GelMA 組（P＜0.01）和15% GelMA 組（P＜0.05）；15% GelMA 組OCN 蛋白表達(dá)高于骨缺損組（P＜ 0.05），低于10% GelMA 組（P＜0.05），和5% GelMA 組比無統(tǒng)計學(xué)意義，如圖6。

圖6 各組OCN 免疫組化染色與定量分析（n ≥3）Figure 6 OCN immunohistochemical staining and quantitative analysis of each group（n ≥3）

3 討論

骨缺損是指骨的結(jié)構(gòu)完整性被破壞，常見于軍事作業(yè)、創(chuàng)傷和骨病手術(shù)后等場景。 通常情況下，大段、大面積的骨缺損無法進(jìn)行自我修復(fù)，需要借助臨床技術(shù)干預(yù)。 目前臨床上主要通過骨移植術(shù)修復(fù)骨缺損，但自體骨移植需要進(jìn)行手術(shù)同時其材料來源有限，限制了其可用性。 同種異體骨移植與異種骨移植雖然無需額外手術(shù)同時也克服了材料限制，但可能會產(chǎn)生某些免疫排斥反應(yīng)，影響移植骨的存活率并增加患傳染疾病的風(fēng)險，且受到倫理學(xué)的限制［27］。 因此，尋找更安全、有效的骨缺損修復(fù)材料，并構(gòu)建適宜的動物模型對相關(guān)材料進(jìn)行評價仍是骨再生領(lǐng)域亟待解決的重要問題。

新型光敏水凝膠材料甲基丙烯酰化明膠（GelMA）近來日益受到關(guān)注。 這種類似于天然細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的水凝膠材料不僅能夠通過刺激細(xì)胞來形成具有機(jī)械整合性的功能組織，而且還能確保移植物在植入后能繼續(xù)存活［28］。 GelMA 還具有優(yōu)異的生物相容性和物理可塑性［29］，與其他可用的水凝膠生物材料相比，更能滿足組織再生修復(fù)的需求。 雖然GelMA 已經(jīng)被應(yīng)用于多種臨床前場景開展研究，但是有關(guān)其在小鼠骨缺損模型中的修復(fù)作用及其評價體系報道不多，這限制了對于GelMA 支架的篩選［30］，以及修復(fù)作用相關(guān)的細(xì)胞和分子機(jī)制的評價，不利于優(yōu)化可注射式骨再生支架材料的安全性和有效性。

本研究選擇建立小鼠股骨缺損模型來評價GelMA 水凝膠對小鼠骨創(chuàng)傷的再生修復(fù)作用。 早期研究表明，顱骨血液運行較差，且離中樞神經(jīng)系統(tǒng)較近，不利于構(gòu)建復(fù)雜骨缺損模型，同時顱骨缺損模型無法用來評估骨髓腔是否再通的修復(fù)效果。在后期的長骨骨缺損模型中發(fā)現(xiàn)，脛骨靠近腓骨，且外觀呈三角形，因此在一定程度會影響骨修復(fù)過程。 而股骨外觀呈管狀，內(nèi)外徑相對一致，與脛骨和顱骨相比可以提供如放創(chuàng)復(fù)合傷、骨缺合并感染等更復(fù)雜的骨缺損模型。 而且股骨作為負(fù)重骨，可以更加客觀地評價骨修復(fù)過程中的力學(xué)載荷情況。因小鼠具備較強(qiáng)的抗感染能力，便于集中管理，且整體死亡率較低，因此本文選用小鼠股骨進(jìn)行骨缺損建模［31］。 在成功建立模型的基礎(chǔ)上，利用GelMA自身的可注射性，配置5%、10%、15%共3 個不同濃度的GelMA 體系，將其注射至小鼠股骨缺損處，待其填滿整個缺損區(qū)后用紫外光源固化。 造模2 周后發(fā)現(xiàn)，隨著支架材料降解，各組均有不同程度的新生骨組織形成。 以HE 染色和Masson 染色鑒別新生骨組織和骨膠原纖維；RT-qPCR 鑒定成骨基因OCN、Osterix mRNA 表達(dá)水平；OCN 免疫組化鑒定骨缺損處骨特異性蛋白表達(dá)情況。 最后得出結(jié)論，相比于骨缺損組、5% GelMA 組與15% GelMA 組，10% GelMA 組骨缺損處骨小梁較為成熟，缺損附近有大量新骨形成，這也通過RT-qPCR 及免疫組織染色得到了驗證。 綜上，本研究建立了一種簡便易行的小鼠骨缺損模型，并運用此模式發(fā)現(xiàn)了可加速骨缺損修復(fù)的適宜濃度GelMA 可注射支架材料。

本研究結(jié)果具有較好的實踐意義，一方面該模型可以用于其他材質(zhì)的可注射式再生支架的體內(nèi)評價，另一方面該模型可以評價攜帶了干細(xì)胞和生物活性因子的可注射式再生修復(fù)支架的修復(fù)效果，并開展相關(guān)機(jī)制研究。 但是，同時也應(yīng)當(dāng)看到，本研究的結(jié)果是基于小型實驗動物得到的，大動物甚至人體臨床研究的結(jié)果對于可注射式再生支架的評價更為重要，需要系統(tǒng)而深入的后繼工作。