陳亞曾陽何飄謝麗華張程程王瑾茜*袁華劉瑩瑩樸美虹汪辛強

（1. 湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，長沙 410007；2. 湖南中醫(yī)藥大學，長沙 410208）

心肌缺血-再灌注損傷（myocardial ischemiareperfusion injury，MIRI）是指冠狀動脈部分或完全急性阻塞經(jīng)再通后，血流雖恢復正常灌注，但心肌組織缺血損傷并未緩解反而進行性加重的病理過程。 因其高發(fā)病率、死亡率而成為阻礙人類健康的難題［1－2］。 心肌缺血再灌注后往往伴隨血液流速及缺氧環(huán)境的快速改變，活性氧過度產(chǎn)生、抗氧化酶相對不足及其活性降低，均可導致脂質(zhì)過氧化酶活化，引發(fā)脂質(zhì)過氧化損傷，從而加劇細胞損傷和鐵死亡［3］。 鐵死亡是以細胞內(nèi)鐵代謝異常為主要誘發(fā)因素進而導致細胞內(nèi)脂質(zhì)活性氧（lipid-ROS，L-ROS）致死性累積，并存在細胞氧化還原反應(yīng)參與的一種細胞死亡形式。 肝是主要的氧化還原及排毒的重要臟器之一。 現(xiàn)代醫(yī)學研究表明，肝在鐵的吸收、轉(zhuǎn)運和儲存中發(fā)揮重要作用，F(xiàn)e2＋是鐵在體內(nèi)存在的主要形式之一，當其蓄積超量會誘使活性氧大量產(chǎn)生，刺激細胞膜脂質(zhì)過氧化而導致鐵死亡［4－8］。 而細胞鐵死亡是引起心肌缺血再灌注的發(fā)作中起著關(guān)鍵作用［9］。

MIRI 屬于胸痹心痛范疇，史上中醫(yī)藥治療療效尚佳，有其獨特之處。 《黃帝內(nèi)經(jīng)》著有肝屬木、心屬火，是“母子關(guān)系”。 “心痛治肝”之法首見于明代陳士鐸所著《石室秘錄》中指出肝主疏泄，氣機郁滯則氣血不調(diào)，心脈不通或心脈攣急，遂發(fā)胸痹心痛，并提出“從肝治心、肝心并治”的治法。 研究表明，疏肝理氣、活血化瘀中藥復方可減輕心肌細胞炎癥，修復損傷的心肌細胞，提高診療效果［10］。 因此本課題組認為“心痛治肝”治法具有科學依據(jù)，可能與調(diào)控鐵死亡密切相關(guān)。 全國名老中醫(yī)王行寬教授熟讀經(jīng)典結(jié)合自身臨證經(jīng)驗，根據(jù)“心病治肝”理論遣藥組方自擬從肝治心方，由柴胡、郁金、姜黃等藥物組成，疏理肝氣，散氣破血以達推陳致新之功能［11］。 研究表明，該方藥可明顯改善心肌缺血患者的心功能［12－13］。 本研究采用“結(jié)扎冠狀動脈左前降支＋再灌注”制備MIRI 動物模型，觀察心肌組織病理形態(tài)、心肌細胞鐵沉積情況及細胞鐵死亡后線粒體的形態(tài)，檢測血清中肌酸激酶同工酶（creatine kinase-MB，CK-MB）、丙二醛（malonic dialdehyde，MDA）、心肌肌鈣蛋白T（cardiac troponin，cTnT）、超氧化物歧化酶（super oxide dismutase，SOD）及多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA）改變，檢測心肌組織中核轉(zhuǎn)錄因子紅系2 相關(guān)因子2（nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2）、長鏈脂酰輔酶 A 合成酶4 （long-chain acyl-CoA synthetase 4，ACSL4）mRNA 及蛋白表達量，以期探尋從肝治心方調(diào)控鐵死亡治療MIRI 機制所在，為“心痛治肝”理論提供一定的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

50 只SPF 級雄性健康SD 大鼠，8 ～10 周齡，體重為250 ± 20 g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司【SCXK（湘）2019－0004】。 飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院SPF 級動物房【SYXK（湘）2020－0010】。 飼養(yǎng)期間各組大鼠自由飲水，飼喂普通維持飼料由湖南嘉泰實驗動物有限公司提供。飼養(yǎng)條件：溫度22 ～26℃，相對濕度40% ～70%，保持每天12 h 光照和12 h 黑暗環(huán)境，每小時通風10 次，各組單籠喂養(yǎng)。 本研究所有操作均經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學醫(yī)學倫理委員會批準（IACUC 20201010-3），實驗過程遵循3R 原則。

1.1.2 藥物制備

從肝治心方（紅參，當歸，丹參，柴胡，姜黃，郁金，白芥子，九香蟲）8 味中藥按2 ∶2 ∶2 ∶2 ∶2 ∶2 ∶1 ∶1比例配方，飲片購自湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，煎煮時加入處方劑量8 倍水，浸泡藥材30 min 后，沸水文火煎煮2 次，每次30 min，合并藥液，過濾。4℃冰箱保存。 麝香保心丸說明書：1 ～2 丸／次，每丸22.5 mg，每天3 次。

1.1.3 主要試劑與儀器

多聚甲醛（國藥集團化學試劑有限公司，20170113），CK-MB-ELISA 試劑盒96T（江蘇酶免實業(yè)有限公司，F(xiàn)Y3500-A），cTnT-ELISA 試劑盒96T（江蘇酶免實業(yè)有限公司，F(xiàn)Y40431-A），SOD-ELISA試劑盒96T（江蘇酶免實業(yè)有限公司，F(xiàn)Y3262-A），MDA-ELISA 試劑盒96T（江蘇酶免實業(yè)有限公司，F(xiàn)Y8503-A），PUFA-ELISA 試劑盒96T（江蘇酶免實業(yè)有限公司，F(xiàn)Y40437-A），NRF2 兔多抗（BIOSS，BS1074R）， ACSL4 兔多抗（Affinity， DF12141），GAPDH 鼠單抗（Immunoway，YM3029）。 酶標儀（賽默飛，Infinite F50，英國），紫外可見分光光度計（科佑，UV759，中國），電熱恒溫水浴鍋（鼎鑫，DK-8D，中國），低速離心機（賽默飛，TDZ4-WS，英國），手動單道可調(diào)式移液器（大龍，TopPette，中國），可調(diào)移液器，槍頭，離心機，恒溫箱均購自于（菁華，eppendorf，中國），蛋白印跡系統(tǒng)（伯樂，Mini T，中國）。

1.2 方法

1.2.1 造模方法及分組

50 只成模大鼠隨機分為空白組、假手術(shù)組、模型組、從肝治心方組（CGZX 組）、麝香保心丸組（SXBX 組）5 組。 單籠喂養(yǎng)，自由攝食飲水。 參照課題組既往經(jīng)驗，空白組大鼠正常飼養(yǎng)，模型組、CGZX 組、SXBX 組術(shù)前12 h 禁食，于實驗第1 天進行造模，具體方式如下：連接心電圖電極，記錄標準Ⅱ?qū)?lián)心電圖，氣管切開、插入氣管插管。 連接空氣呼吸機進行人工控制呼吸，開胸暴露心臟及大血管根部，以6－0 縫合線結(jié)扎冠狀動脈左前降支血管，阻斷30 min 后松開縫合線維持再灌注狀態(tài)，隨后予以止血處理及逐層縫針關(guān)胸，造模結(jié)束。 假手術(shù)組只穿線不結(jié)扎，余操作同模型組。 手術(shù)中分開胸后、結(jié)扎后、再灌注后和關(guān)胸后4 個點記錄心電圖變化。 以心電圖ST 段的改變及左室前壁向外膨脹發(fā)紺為結(jié)扎成功標志。

1.2.2 給藥

造模24 h 后，空白組、假手術(shù)組及模型組予以等體積蒸餾水灌胃，給藥組按人與大鼠體表面積換算等效劑量，溶于蒸餾水灌胃，CGZX 組予以從肝治心方（6.3 g／（kg·d））灌胃，SXBX 組予以麝香保心丸混懸液（12.15 mg／（kg·d））灌胃，每天灌胃1 次，直到處死為止。

1.2.3 取材

各組均于給藥后14 d（實驗第16 天）8：00，參照隨機數(shù)字表分別取材。 待大鼠心肌缺血再灌注完成后，立即打開大鼠的腹腔，自腹主動脈取血2 mL， 靜置15 min 后分離血清，標記分類后，放至－80℃冰箱內(nèi)凍存。 取血完成后即刻剖取大鼠心臟，分離缺血心肌區(qū)域。 于－80℃冰箱內(nèi)保留備用。

1.2.4 檢測指標

檢測指標如下：（1）HE 染色觀察心肌細胞損傷情況；計算心肌梗死面積。 具體公式如下：梗死面積（%） ＝ ［（左心室梗死部位心內(nèi)膜長／總心內(nèi)膜周長）／2 ＋（左心室梗死部位心外膜長／總心外膜周長）／2］× 100%。 （2）普魯士藍染色觀察鐵沉積情況。 （3）透射電鏡下評估細胞鐵死亡特點。 （4）ELISA 測定血清心肌壞死及氧化反應(yīng)相關(guān)指標含量。 （5）PCR 測試心肌蛋白含量，引物序列信息見表1。 （6）Western Blot 測試心肌蛋白含量。

表1 引物信息Table 1 Information of primers

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件進行分析。 實驗數(shù)據(jù)以平均值± 標準差（±s）表示，多組間比較采用方差分析，方差齊性時用LSD 檢驗，方差非齊性時用Dunnett’sT3 檢驗。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 HE 染色測心梗面積

與模型組比較，CGZX 組及SXBX 組心梗面積均明顯縮?。≒＜0.01），見圖1。

圖1 MIRI 大鼠心肌梗死面積測定Figure 1 Measurement of myocardial infarction area in MIRI rats

2.2 HE 染色觀察心肌組織損傷情況

HE 染色結(jié)果顯示，模型組大鼠心肌組織排列紊亂、間隙增寬，細胞部分有壞死及明顯的炎性細胞浸潤。 而從CGZX 組及SXBX 組細胞壞死及炎性細胞浸潤較模型組明顯減少；假手術(shù)組心肌組織僅有少量炎性細胞浸潤，其他結(jié)構(gòu)完整，見圖2。

圖2 各組大鼠心肌組織病理變化（HE 染色）Figure 2 Pathological changes in myocardial tissue of rats in each group （HE staining）

2.3 普魯士藍染色觀察鐵沉積情況

普魯士染色結(jié)果顯示，模型組大鼠心肌組織出現(xiàn)大量的黑褐色鐵沉積；與模型大鼠心肌組織比較，CGZX 組鐵沉積明顯減少；假手術(shù)組心肌組織無明顯鐵沉積，見圖3。

圖3 各組大鼠心肌組織鐵沉積情況（普魯士藍染色）Figure 3 Iron deposition in myocardial tissue of rats in each group （Prussian blue staining）

2.4 電鏡下評估細胞鐵死亡特點

模型組大鼠心肌肌絲及線粒體內(nèi)部結(jié)構(gòu)疏松，且伴肌絲斷裂、線粒體腫脹及自噬體形成，與模型組相比，CGZX 及SXBX 組雖有斷裂或疏松，但形態(tài)相對完好，嵴突疏松程度較模型組輕；假手術(shù)組大鼠心肌肌絲及線粒體結(jié)構(gòu)完整，見圖4。

圖4 各組大鼠心肌細胞線粒體透射電鏡圖Figure 4 Transmission electron microscopy images of myocardial mitochondria in each group of rats

2.5 ELISA 測定血清心肌壞死及氧化反應(yīng)相關(guān)指標

與空白組相比，模型組MDA、PUFA、CK-MB、cTnT 均顯著升高（P＜0.01），SOD 顯著下降（P＜0.01）。 與模型組相比，CGZX 組、SXBX 組MDA、PUFA、CK-MB、cTnT 均顯著下降（P＜0.01），SOD顯著升高（P＜0.01），見圖5。

圖5 各組大鼠血清心肌壞死及氧化反應(yīng)相關(guān)指標含量Figure 5 Content of serum myocardial necrosis and oxidative response related indicators in each group of rats

2.6 PCR 法檢測各組大鼠心肌組織Nrf2、ACSL4 mRNA 表達水平

Nrf2、ACSL4 的熔解曲線均為單峰分布，擴增曲線平滑，基本呈“S”形，提示擴增產(chǎn)物特異性較好。與空白組相比，模型組Nrf2 mRNA 水平明顯下降，ACSL4 mRNA 水平升高（P＜0.01），提示MIRI 造模能抑制Nrf2 的表達，促進ACSL4 表達；空白組與假手術(shù)組相比，Nrf2、ACSL4 mRNA 水平差異無顯著性（P＞0.05）；CGZX 組和SXBX 組Nrf2 mRNA 水平較模型組顯著升高，ACSL4 mRNA 水平較模型組降低（P＜0.01），CGZX 組和SXBX 組之間差異無顯著性（P＞0.05），見圖6。

圖6 各組大鼠心肌組織Nrf2、ACSL4 mRNA 表達水平（n ＝6）Figure 6 Expression of Nrf2 and ACSL4 mRNA in myocardium of rats in each group（n ＝6）

2.7 各組大鼠心肌組織Nrf2、ACSL4 蛋白表達水平

結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組Nrf2 蛋白水平明顯下降，ACSL4 蛋白水平升高（P＜0.05），提示MIRI 造模能抑制Nrf2 的表達，促進ACSL4 表達；空白組與假手術(shù)組相比，Nrf2、ACSL4 蛋白水平差異無顯著性（P＞0.05）；CGZX 組和SXBX 組Nrf2 蛋白水平較模型組明顯升高，ACSL4 蛋白水平較模型組降低（P＜0.05），CGZX 組和SXBX 組之間差異無顯著性（P＞0.05），提示從肝治心方和麝香保心丸可能通過促進Nrf2 的表達，抑制ACSL4 的表達來改善MIRI，見圖7。

圖7 各組大鼠心肌組織Nrf2、ACSL4 蛋白表達水平（n ＝6）Figure 7 Expression levels of Nrf2 and ACSL4 proteins in myocardial tissue of rats in each group （n ＝6）

3 討論

課題組沿用前期制備的“冠狀動脈前降支結(jié)扎＋缺血后再灌注”造模方式制備MIRI 模型［14］。 陽性對照組選用麝香保心丸［15］，具有治療氣滯血瘀型胸痹作用，此方已列入《2020 年冠狀動脈血運重建術(shù)后心絞痛中西醫(yī)結(jié)合診療指南》、《中成藥治療冠心病臨床應(yīng)用指南（2020 版）》等［16－17］，且實驗證明其能改善MIRI，減輕心肌細胞鐵死亡［18］。 本研究通過HE 染色發(fā)現(xiàn)模型組細胞水腫壞死，細胞排列不規(guī)則、疏松及大量炎性細胞浸潤，透射電鏡顯示，模型組大鼠心肌肌絲斷裂或疏松，心肌組織線粒體腫脹，內(nèi)部結(jié)構(gòu)疏松，同時，模型組CK-MB、cTnT 均顯著升高，說明細胞鐵死亡在心肌缺血再灌注損傷中起到作用。 此外，與空白組相比，模型組MDA、PUFA 顯著升高，說明心肌缺血再灌注損傷鐵死亡過程中存在脂質(zhì)過氧化。 Nrf2 是細胞氧化應(yīng)激反應(yīng)的核心調(diào)節(jié)者，可平衡氧化還原，減輕細胞損傷［19－23］；而ACSL4 鐵死亡易感性的關(guān)鍵預測因子，可作為鐵死亡標志物［24－27］。 因此本研究選擇Nrf2-ACSL4 作為鐵死亡的調(diào)控通路觀察，結(jié)果顯示模型組大鼠心肌組織Nrf2 mRNA 及蛋白水平較空白組明顯下降，ACSL4 mRNA 及蛋白水平升高，表明Nrf2-ACSL4 可能是心肌缺血再灌注損傷鐵死亡的信號通路。

隨后，本研究通過HE 染色觀察到，與模型組相比，CGZX 組與SXBX 組均可顯著減少梗死面積；CGZX 組心肌組織水腫變性減少，炎癥細胞浸潤減輕；且CGZX 組血清CK-MB、cTnT 表達下降，透射電鏡顯示CGZX 組大鼠心肌組織線粒體腫脹輕，提示從肝治心組方干預可降低心肌缺血損傷程度；CGZX組血清中SOD 顯著升高，MDA、PUFA 顯著下調(diào)，提示從肝治心方可調(diào)節(jié)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)；普魯士藍染色顯示CGZX 組鐵沉積明顯減少；且鐵死亡標志物ACSL4 mRNA 及蛋白水平下調(diào)，Nrf2 mRNA 及蛋白水平較模型組顯著升高，與麝香保心丸組相比，差異無統(tǒng)計學意義，表明CGZX 與SXBX 組均可通過調(diào)控ACSL4、Nrf2 水平實現(xiàn)抑制鐵死亡的作用。 綜上，依據(jù)“心痛治肝”治法的從肝治心方減輕心肌細胞損傷可能通過改善鐵代謝異常及調(diào)節(jié)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)抑制鐵死亡，且機制與上調(diào)Nrf2、下調(diào)ACSL4有關(guān)，可為“心痛治肝”理論提供實驗依據(jù)。

本研究結(jié)果提示CGZX 方調(diào)控鐵死亡可能與調(diào)控Nrf2-ACSL4 的表達平衡氧化還原，改善脂質(zhì)代謝有關(guān)，同時證實肝主疏泄功能，可促進鐵及脂質(zhì)代謝，從而減輕細胞損傷，改善心肌缺血。