孫效容蘇丹楊棣遠(yuǎn)張敏羅峰徐鈺惟貴文娟陳玥*

（1. 四川大學(xué)生物治療國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610041；2. 成都合拓創(chuàng)展生物科技有限公司，成都 610041；3. 寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院，銀川 750004）

樹鼩（Tupaia belangeri chinensis）是一種形似松鼠的小型哺乳動物［1］，與非人靈長類在進(jìn)化上存在高度相似性［2－3］。 樹鼩在消化系統(tǒng)［4－5］、免疫系統(tǒng)［6－7］、神經(jīng)系統(tǒng)［8－9］、骨關(guān)節(jié)炎［10］、 精神心理學(xué)［11－12］、病毒［13］、眼科［14］等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用于科學(xué)研究，在生物醫(yī)學(xué)研究和藥物安全性評價方面，已有學(xué)者提出樹鼩具有替代非人靈長類動物的價值［15］。

成年樹鼩正常心率每分鐘約300 次，樹鼩受到外界刺激處于應(yīng)激狀態(tài)，或者情緒高度興奮時心率每分鐘可達(dá)600 次左右［16］，說明樹鼩的心血管調(diào)節(jié)能力和心功能儲備非常強(qiáng)，提示樹鼩可能是一種很好的心血管疾病動物模型。 但樹鼩在心血管方面的研究較少，部分學(xué)者采用離體心臟心肌缺血再灌注進(jìn)行樹鼩心臟體外研究［17］，目前關(guān)于樹鼩心臟相關(guān)在體研究主要包括：心電圖測定［18］，通過無創(chuàng)血壓計（鼠儀）測定樹鼩血壓和心率［19］評估心臟電生理和外周血壓。 同時，有研究人員通過7T 心臟磁共振對心臟功能進(jìn)行研究［20］，但7T 磁共振對設(shè)備和操作人員要求極高，難以廣泛應(yīng)用于樹鼩心臟功能的研究。 國內(nèi)外尚未見樹鼩相關(guān)超聲心動圖研究報道。

心電圖用于評估臨床心臟疾病患者和臨床前動物實(shí)驗(yàn)中心臟生物電的變化，尤其在各類心律失常、心室心房肥大、心肌梗死、心肌缺血等心臟疾病中廣泛運(yùn)用［21］。 超聲心動圖是臨床心血管疾病患者和臨床前心臟動物模型最常用的無創(chuàng)檢測手段［22］，廣泛用于觀察患者或動物的心臟、瓣膜、大血管結(jié)構(gòu)及血流變化。 組織病理學(xué)是臨床及臨床前最重要的檢測指標(biāo)。 本研究應(yīng)用心電圖機(jī)肢體導(dǎo)聯(lián)監(jiān)測樹鼩心臟生物電信號，超聲心動圖測定心臟左室各壁厚度，軟件自動測定樹鼩左室收縮末期容積（end-systolic volume，ESV）、舒張末期容積（enddiastolic volume，EDV），并自動計算出射血分?jǐn)?shù)（ejection fraction， EF）、 短軸縮短率（fractional shorting，F(xiàn)S）等多項(xiàng)心臟結(jié)構(gòu)和功能指標(biāo)，并進(jìn)行心臟組織學(xué)的觀察。 本研究較為全面的對健康樹鼩心臟進(jìn)行研究，首次使用超聲心動圖對樹鼩心功能進(jìn)行評價分析，研究結(jié)果顯示樹鼩具備用于建立人類心臟疾病研究動物模型的潛力，同時提供健康樹鼩心電信號、超聲圖像、心臟結(jié)構(gòu)和功能各類指標(biāo)、心臟組織學(xué)特點(diǎn)等，為樹鼩作為心臟方面研究的實(shí)驗(yàn)動物奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物

10 只普通級健康成年樹鼩，雌雄各半，年齡2 ～3 歲，體重123 ～152 g，平均體重140 g。 樹鼩由昆明醫(yī)科大學(xué)購買自中國科學(xué)院昆明動物研究所【SCXK（滇）K2022－0003】，本批樹鼩由昆明醫(yī)科大學(xué)贈送，飼養(yǎng)于成都合拓創(chuàng)展生物科技有限公司【SYXK（川）2021－242】。 飼養(yǎng)環(huán)境：普通環(huán)境飼養(yǎng)自由飲食水，人工照明，12／12 h 晝夜明暗交替，設(shè)定相對濕度40% ～60%，溫度控制在20 ～25℃。所有操作均符合實(shí)驗(yàn)動物倫理學(xué)要求，經(jīng)成都合拓創(chuàng)展生物科技有限公司倫理委員會批準(zhǔn)（2022IINHT01T01）。

1.1.2 主要試劑與儀器

異氟烷（深圳市瑞沃德生命科技有限公司，中國），多聚甲醛（武漢賽維爾生物科技有限公司，中國），無水乙醇、二甲苯（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，中國）。 BeneHeart R12 心電圖機(jī)（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司，中國），M9Vet 便攜式彩色多普勒超聲系統(tǒng)（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司，中國），ABS 型呼吸麻醉機(jī)（上海玉研科學(xué)儀器有限公司），RM2016 病理切片機(jī)（上海徠卡儀器有限公司，中國），PH100 生物顯微鏡（鳳凰光學(xué)股份有限公司，中國）。

1.2 方法

1.2.1 心電圖檢測

小心抓取樹鼩，持續(xù)吸入1.0% ～2.5%異氟烷麻醉，樹鼩仰臥位固定在固定板上，樹鼩心率較快，設(shè)定心電圖機(jī)靈敏度20 mm／mV，心電圖機(jī)走紙速度50 mm／s。 按照常規(guī)導(dǎo)聯(lián)線連接電極，電極使用無菌1 mL 注射器針頭刺入皮下，記錄3 個肢體導(dǎo)聯(lián)（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ）和3 個加壓肢體導(dǎo)聯(lián)（aVR、aVL、aVF）生物電信號，以PDF 格式存儲和輸出。

1.2.2 超聲心動圖檢測

樹鼩持續(xù)吸入1.0% ～2.5%異氟烷麻醉，剔除胸前毛發(fā)，樹鼩左側(cè)傾斜約30°臥位，探頭L20-5 s（頻率16 MHz），深度2.5 cm 對樹鼩進(jìn)行B 型和M型超聲心動圖檢查，探頭位于樹鼩左胸在各切面觀察心肌壁和瓣膜的形態(tài)及運(yùn)動情況，多普勒超聲測定血液流速。 在左室短軸乳頭肌平面進(jìn)行M 型超聲心動圖測定，測量舒張末期室間隔厚度（end diastolic interventricular septum，IVSd）、左室舒張末期內(nèi)徑（left ventricular end diastolic dimension，LVIDd）、左室舒張末期后壁厚度（end diastolic left ventricular posterior wall，LVPWd），收縮末期室間隔厚度（end systolic interventricular septum，IVSs）、左室收縮末期內(nèi)徑（left ventricular end systolic dimension，LVIDs）、收縮末期左室后壁厚度（end systolic left ventricular posterior wall，LVPWs），軟件自動計算得出左室心功能數(shù)據(jù)，包括舒張末期容積（EDV）、收縮末期容積（ESV）、射血分?jǐn)?shù)（EF）和左室短軸縮短率（FS）。 連續(xù)采集10 個心動周期的動態(tài)圖像并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.3 心臟組織學(xué)染色

心臟取材后4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋存在這4 μm 厚度切片，HE 染色后封片，用生物顯微鏡進(jìn)行心臟結(jié)構(gòu)和心肌細(xì)胞形態(tài)的觀察及圖像采集。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 心電圖

成年樹鼩正常心電圖見圖1，可見樹鼩為竇性心律，節(jié)律規(guī)則，未見異常起搏點(diǎn)，未見異常傳導(dǎo)。心電圖可見明顯P 波，QRS 波群，T 波，其中肢體導(dǎo)聯(lián)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，單極加壓肢體導(dǎo)聯(lián)aVF 的QRS 主波方向均為正向波，單極加壓肢體導(dǎo)聯(lián)aVR、aVL 的QRS主波為負(fù)向波，T 波方向與主波方向一致，以Ⅱ?qū)?lián)為例，對各波進(jìn)行標(biāo)注。 10 只樹鼩心率282 ～333 bpm。 樹鼩較人心率（60 ～100 bpm）快，心電圖的波形和各波方向與人一致。

2.2 超聲心動圖

樹鼩超聲心動圖檢測可見左右心房及左右心室，見圖2A，四腔心切面可見4 個心腔中，左心室較大，心臟各結(jié)構(gòu)完整未見異常通道，各腔室搏動有力。 左室短軸乳頭肌平面測定心臟結(jié)構(gòu)和功能各參數(shù)，測定方法見圖2B，測定數(shù)據(jù)見表1。 多普勒超聲見各瓣膜和大血管血流正常，圖2C，各瓣膜結(jié)構(gòu)完整且功能完好，二尖瓣血流頻譜可見E、A 峰，見圖2D。

表1 成年樹鼩超聲心動圖檢測數(shù)據(jù)（ ± s，n ＝10）Table 1 Values of echocardiography in normal adult tree shrew（ ± s，n ＝10）

表1 成年樹鼩超聲心動圖檢測數(shù)據(jù)（ ± s，n ＝10）Table 1 Values of echocardiography in normal adult tree shrew（ ± s，n ＝10）

類型Items數(shù)值Value舒張末期室間隔厚度（mm）IVSd（mm）1.65 ± 0.19收縮末期室間隔厚度（mm）IVSs（mm）2.93 ± 0.18左室舒張末期內(nèi)徑（mm）LVIDd（mm）7.88 ± 0.28左室收縮末期內(nèi)徑（mm）LVIDs（mm）4.63 ± 0.13左室舒張末期后壁厚度（mm）LVPWd（mm）1.71 ± 0.11左室收縮末期后壁厚度（mm）LVPWs（mm）2.96 ± 0.23舒張末期容積（mm）EDV（mL）1.08 ± 0.08收縮末期容積（mm）ESV（mL）0.26 ± 0.02每搏輸出量（mL）SV（mL）0.82 ± 0.08射血分?jǐn)?shù)（%）EF（%）76.17 ± 2.26短軸縮短率（%）FS（%）41.21 ± 3.16心率（bpm）HR（bpm）308.10 ± 16.12

圖2 成年樹鼩超聲心動圖Figure 2 Echocardiography of adult tree shrew

2.3 心臟組織學(xué)

樹鼩心臟HE 染色后觀察，見圖3。 心室壁共分3 層，分別為心內(nèi)膜層、心肌層和心外膜層。 心內(nèi)膜較薄，內(nèi)皮為單層扁平上皮細(xì)胞，與血管內(nèi)皮相似并連續(xù)，心內(nèi)膜下層可見成纖維細(xì)胞、膠原纖維、小血管和神經(jīng)，其中小血管非常豐富。 心室壁肌纖維分淺、中、深3 層，心室壁肌纖維走形分為內(nèi)縱、中環(huán)、外斜3 層與人正常心肌分層一致。 與同等體重范圍大鼠相比，樹鼩心肌層較厚，心肌纖維數(shù)量更多，排列更加緊密規(guī)則，肌纖維間血管更加豐富。高倍鏡下見心肌細(xì)胞為長梭形，橢圓形的細(xì)胞核位于心肌細(xì)胞中央?yún)^(qū)域。 心外膜由間皮和薄層結(jié)締組織組成，心外膜深層含有血管和神經(jīng)纖維。

圖3 成年樹鼩心臟HE 染色Figure 3 HE staining of adult tree shrew

3 討論

本實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)用心電圖機(jī)測定樹鼩肢體導(dǎo)聯(lián)心電圖，觀察正常成年樹鼩的心臟節(jié)律，樹鼩為竇性心律，心率較快，節(jié)律規(guī)則，與文獻(xiàn)報道的樹鼩心電特征基本一致［18］。 超聲心動圖觀察心臟各結(jié)構(gòu)并測定心臟功能，樹鼩的心臟結(jié)構(gòu)與人類似，通過經(jīng)胸?zé)o創(chuàng)超聲心動圖檢測可多次重復(fù)測定心臟的功能，具有超聲專業(yè)背景的人員有合適的超聲設(shè)備和探頭即可操作完成，圖像質(zhì)量高，可獲得用于分析的心臟結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)和心功能數(shù)據(jù)參數(shù)多。 樹鼩心臟組織學(xué)染色，發(fā)現(xiàn)樹鼩心臟分層與人類似，HE 染色即可清晰觀察到心臟形態(tài)和心肌細(xì)胞的情況。

樹鼩作為一種新型實(shí)驗(yàn)動物，病毒感染性模型、基因組學(xué)、神經(jīng)和免疫系統(tǒng)等疾病研究中有豐富的應(yīng)用和研究［23］。 樹鼩運(yùn)動能力強(qiáng)，攀爬時常呈現(xiàn)直立狀態(tài)，結(jié)合樹鼩與人的高度同源性，且樹鼩與人一樣是晝出夜伏的動物，提示樹鼩具有與大小鼠等嚙齒類動物更天然的優(yōu)勢。 經(jīng)心臟組織學(xué)觀察可見，樹鼩心臟心肌纖維數(shù)量更多，排列緊密，且肌纖維間血管分布更為廣泛，為心肌運(yùn)動提供更好的基礎(chǔ)和動力。 上述心臟結(jié)構(gòu)及功能特征，可能是健康樹鼩在特定應(yīng)激或情緒亢奮狀態(tài)下，心率可由每分鐘300 次左右，激增至每分鐘600 次左右的組織基礎(chǔ)。 在心血管系統(tǒng)研究中可能有較大的潛力。本文通過臨床常用的心電圖和超聲心功能檢測初步研究樹鼩的心臟生物電活動與心臟結(jié)構(gòu)和功能，組織學(xué)檢測全面對樹鼩心臟進(jìn)行分析，為樹鼩心臟疾病模型的建立和分析奠定基礎(chǔ)。

臨床心臟檢測中，還需要采用心肌酶譜、心衰標(biāo)志物等實(shí)驗(yàn)室檢測對心臟功能進(jìn)行輔助評價，由于樹鼩體重較小，采集較多血液損傷較大，本實(shí)驗(yàn)未進(jìn)行心臟血液學(xué)的實(shí)驗(yàn)室檢測。 此外，本實(shí)驗(yàn)采用的動物數(shù)量較少，作為正常標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫仍較不足。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)首次結(jié)合心電圖、超聲心動圖、心臟組織學(xué)對樹鼩心臟進(jìn)行綜合分析，提示樹鼩在心臟結(jié)構(gòu)和功能上與人類似，為樹鼩心臟疾病動物模型的建立和應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。