魯葉慧,欒軍杰,劉星,吳瑗,林靜

(青島大學(xué)附屬醫(yī)院眼科,山東 青島 266003)

真菌性角膜炎是一種嚴(yán)重的角膜感染性疾病,在亞洲和非洲等發(fā)展中國(guó)家發(fā)病率高[1]。絲狀真菌如煙曲霉菌和鐮刀菌是誘發(fā)真菌性角膜炎的主要原因,一旦其分生孢子透過(guò)角膜上皮進(jìn)入到基質(zhì),孢子會(huì)迅速萌發(fā),誘發(fā)癥狀。目前,真菌性角膜炎的一線治療是局部使用那他霉素、伏立康唑、兩性霉素B等藥物[2],但這些藥物存在水溶性差、滲透性差及嚴(yán)重的不良反應(yīng),因此亟待開(kāi)發(fā)可用于臨床的低毒高效的治療藥物。血根堿(SAN)為一種季銨鹽類(lèi)苯并菲啶生物堿,是來(lái)源于血根草、大白屈菜和博落回的一類(lèi)重要的天然異喹啉生物堿[3-4]。 SAN具有多種藥理活性,包括抗腫瘤、抗菌、抗炎和改善心血管功能等[5-9]。最近的研究顯示,在大鼠的神經(jīng)源性疼痛模型中,SAN可以通過(guò)抑制白細(xì)胞介素1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素6(IL-6)等炎癥因子的表達(dá)來(lái)減輕疼痛[10-12]。SAN在急、慢性炎癥中發(fā)揮抗炎作用。但是SAN能否在真菌性角膜炎中發(fā)揮抗炎作用尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究旨在探討SAN對(duì)煙曲霉菌感染的巨噬細(xì)胞及小鼠角膜炎癥的調(diào)節(jié)作用,為治療真菌性角膜炎提供一種新思路。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

小鼠來(lái)源的RAW264.7巨噬細(xì)胞系購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)(上海)。實(shí)驗(yàn)所用40只8周大小健康的C57BL/6雌鼠購(gòu)于山東濟(jì)南朋悅有限公司,體質(zhì)量20～30 g,按照青島大學(xué)附屬醫(yī)院動(dòng)物委員會(huì)批準(zhǔn)的方案飼養(yǎng)。SAN(100 mg,純度98%)由麥克林試劑公司提供,用體積分?jǐn)?shù)0.001的DMSO溶解后以2 g/L儲(chǔ)備液-20 ℃儲(chǔ)存;RNAex pro reagent裂解液(艾科瑞生物工程有限公司);酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)試劑盒(Biolegend公司);蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒(碧云天,中國(guó));煙曲霉菌(CPCC 3.0772,中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心(北京))。

1.2 研究方法

1.2.1煙曲霉菌絲制備 煙曲霉菌絲及滅活煙曲霉菌絲制備方法基于本實(shí)驗(yàn)室原有步驟,進(jìn)行優(yōu)化[13]。將煙曲霉標(biāo)準(zhǔn)菌株接種于酵母膏胨葡萄糖培養(yǎng)液(葡萄糖10 g、蛋白胨100 g、酵母5 g溶解于雙蒸水中定容1 L),置35 ℃培養(yǎng)箱孵育4～7 d后于超凈工作臺(tái)研磨菌絲至20～30 μm大小,一半經(jīng)3次離心后重懸,用DMEM稀釋至1×1011CFU/L;另一半浸泡于體積分?jǐn)?shù)0.75乙醇中,24 h后重復(fù)前述步驟,獲得滅活煙曲霉菌用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SAN對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力的影響 RAW264.7細(xì)胞以4×108CFU/L接種于96孔板中,孵育12 h至細(xì)胞密度約70%更換含SAN(濃度分別為0、62.5、125.0、250.0、500.0、1 000.0 μg/L)培養(yǎng)液,繼續(xù)孵育24 h后,以無(wú)菌PBS洗滌3次,更換含CCK-8的培養(yǎng)液繼續(xù)孵育2 h后,使用酶標(biāo)儀(PerkinElimer, 美國(guó))測(cè)各孔450、600 nm波長(zhǎng)處的吸光度值。每個(gè)樣本設(shè)5個(gè)復(fù)孔,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3小鼠分組及處理 32只健康小鼠隨機(jī)分為N組、500.0 μg/L SAN處理組(SAN組)、AF處理組及AF+500.0 μg/L SAN處理組(AS組),每組8只,每只小鼠的右眼為實(shí)驗(yàn)眼,左眼為空白對(duì)照眼。建模:AF組和AS組小鼠腹腔注射80 g/L水合氯醛約0.08 mL后,用手術(shù)無(wú)菌刀片刮除中央角膜上皮形成約2 mm×2 mm缺損區(qū)域,做井字劃痕、涂抹煙曲霉菌、覆蓋光滑的角膜接觸鏡并縫合眼瞼,24 h后拆除縫線。N組和AF組小鼠以雙蒸水點(diǎn)眼治療,每次5 μL,每天4次;SAN組和AS組小鼠以500.0 μg/L SAN點(diǎn)眼治療,每次5 μL,每天4次。治療第3天,以頸椎脫臼法處死小鼠,獲得小鼠角膜組織。6只健康小鼠隨機(jī)分為AF處理組和AS處理組,建模后分別以雙蒸水和500.0 μg/L SAN點(diǎn)眼治療,每次5 μL,每天4次,治療第3天以頸椎脫臼法處死小鼠,取小鼠眼球。

1.2.4細(xì)胞刺激 RAW264.7細(xì)胞接種于12孔板,孵育至細(xì)胞密度約80%后換液。將細(xì)胞分為N組、SAN組、AF組、AS組,AF組及AS組每孔加入60 μL滅活煙曲霉菌絲,2 h后SAN組及AS組加入SAN溶液使SAN終濃度為500.0 μg/L,8 h后收集細(xì)胞樣本用于細(xì)胞RT-PCR實(shí)驗(yàn)(每組6孔); 24 h后收集細(xì)胞上清液,離心后取上清液用于細(xì)胞ELISA檢測(cè)(每組8孔)。

1.2.5HE染色檢測(cè)小鼠角膜中炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)AS處理組(n=3)和AF處理組(n=3)的眼球分別在含OCT包埋劑的EP管(2 mL)中調(diào)整至合適位置后迅速液氮凍存,使用Leica冷凍切片機(jī)切取角膜中央最大截面處8 μm厚的角膜切片。應(yīng)用HE染色試劑盒染色,按說(shuō)明書(shū)方法進(jìn)行操作,自然晾干后中性樹(shù)膠封片。光學(xué)顯微鏡下觀察小鼠角膜中炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況。

1.2.6實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)檢測(cè)細(xì)胞因子的mRNA表達(dá) 細(xì)胞中加入RNAex pro reagent裂解液后,在冰上裂解0.5 h,用無(wú)菌的200 μL黃槍頭刮取細(xì)胞收集至2 mL的 EP管中,根據(jù)RNAex pro reagent試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,建立2 μg逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系。使用RT-PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng),以β-actin為內(nèi)參,檢測(cè)巨噬細(xì)胞中IL-1β、IL-6、TNF-α及單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP-1)的mRNA表達(dá)。引物及其序列來(lái)自GenBank,由艾科瑞生物有限公司設(shè)計(jì)及合成。見(jiàn)表1。

1.2.7相關(guān)蛋白表達(dá)檢測(cè) 應(yīng)用ELISA試劑盒檢測(cè)小鼠RAW264.7細(xì)胞中IL-1β、IL-6、TNF-α以及MCP-1及小鼠角膜組織中TNF-α和COX-2的蛋白表達(dá),根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。使用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm及570 nm波長(zhǎng)處吸光度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度SAN溶液對(duì)巨噬細(xì)胞活力的影響

不同濃度的SAN(0、62.5、125.0、250.0、500.0、1 000.0 μg/L)與RAW264.7細(xì)胞共孵育24 h后,1 000.0 μg/L SAN溶液處理組巨噬細(xì)胞的存活率低于其他各組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2.272,P<0.05)。500.0 μg/L濃度以?xún)?nèi)的SAN處理組的細(xì)胞存活率與正常對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖1。后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇500.0 μg/L作為研究濃度。

與其他濃度組比較,*F=2.272,P<0.05。

2.2 煙曲霉菌對(duì)小鼠角膜組織中炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)的影響

HE染色觀察結(jié)果顯示,感染煙曲霉菌3 d后,500.0 μg/L SAN組和AF組相比,小鼠角膜基質(zhì)層水腫明顯減輕,炎癥細(xì)胞數(shù)量顯著減少,組織病理結(jié)構(gòu)更為有序(圖2)。

A:AF組;B:500.0 μg/L SAN組。HE染色, 400倍。

2.3 各組細(xì)胞中IL-1β、IL-6、TNF-α以及MCP-1 mRNA 表達(dá)水平比較

析因設(shè)計(jì)的方差分析結(jié)果顯示,滅活菌絲處理產(chǎn)生的單獨(dú)效應(yīng)(FAF=131.211～253.824,P<0.01)、SAN處理產(chǎn)生的單獨(dú)效應(yīng)(FSAN=28.794～119.300,P<0.01)、不同滅活菌絲處理組間(F=141.468～360.577,P<0.01)和不同SAN處理組間(F=10.373～18.560,P<0.01)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,滅活菌絲處理與SAN處理之間存在交互作用(FAF×SAN=10.566～18.536,P<0.01)。與N組和SAN組相比較,AF組細(xì)胞炎癥遞質(zhì)IL-1β、IL-6、TNF-α和MCP-1的mRNA表達(dá)水平明顯升高;與AF組相比,AS組炎癥遞質(zhì)IL-1β、IL-6、TNF-α和MCP-1的mRNA表達(dá)水平明顯下降,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=20.939～37.097,P<0.01)。見(jiàn)表2。

表2 SAN對(duì)RAW264.7細(xì)胞各種炎癥遞質(zhì)mRNA表達(dá)影響

2.4 各組細(xì)胞中IL-1β、IL-6、TNF-α和MCP-1 蛋白表達(dá)水平比較

析因設(shè)計(jì)的方差分析結(jié)果顯示,滅活菌絲處理產(chǎn)生的單獨(dú)效應(yīng)(FAF=1 765.400～6 636.850,P<0.01)、SAN處理產(chǎn)生的單獨(dú)效應(yīng)(FSAN=98.002～3 070.111,P<0.01)、不同滅活菌絲處理組間(F=1 490.936～9 367.445,P<0.01)和不同SAN處理組間(F=63.775～1 347.574,P<0.01)差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,滅活菌絲處理與SAN處理存在交互作用(FAF×SAN=61.187～1 342.599,P<0.01)。與N組和SAN組相比,AF組中炎癥遞質(zhì)IL-1β、IL-6、TNF-α和MCP-1的蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào);AS組與AF組相比,炎癥遞質(zhì)IL-1β、IL-6、TNF-α和MCP-1的蛋白表達(dá)水平明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=124.949～2 690.170,P<0.01)。見(jiàn)表3。

表3 SAN對(duì)RAW264.7細(xì)胞炎癥遞質(zhì)蛋白表達(dá)影響

2.5 各組小鼠角膜中TNF-α和COX-2 蛋白表達(dá)水平比較

析因設(shè)計(jì)的方差分析顯示,滅活菌絲處理產(chǎn)生的單獨(dú)效應(yīng)(FAF=1 207.798、1 569.370,P<0.01)、SAN處理產(chǎn)生的單獨(dú)效應(yīng)(FSAN=75.086、260.364,P<0.01)、不同滅活菌絲處理組間(F=942.588、1 554.091,P<0.01)和不同SAN處理組間(F=295.009、356.222,P<0.01)的差異均有顯著性,滅活菌絲處理與SAN處理有交互作用(FAF×SAN=275.643、340.296,P<0.01)。與N組和SAN組相比較,AF組小鼠感染煙曲霉菌3 d后,炎癥遞質(zhì)TNF-α和COX-2蛋白表達(dá)水平明顯升高;AS組與AF組相比,小鼠感染煙曲霉菌3 d后,炎癥遞質(zhì)TNF-α和COX-2的蛋白表達(dá)水平明顯降低,差異有顯著性(F=570.488、696.427,P<0.01)。見(jiàn)表4。

表4 SAN對(duì)小鼠角膜中炎癥遞質(zhì)蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

真菌性角膜炎是由致病真菌誘導(dǎo)的嚴(yán)重眼部感染性疾病,其致病因素中植物劃傷引起的角膜損傷約占40%～60%[14],另外隱形眼鏡的使用[15]、長(zhǎng)期使用抗生素或類(lèi)固醇[16]、既往眼部手術(shù)史[17]都是重要的致病因素。當(dāng)煙曲霉菌首次攻擊宿主時(shí),其毒力決定簇誘發(fā)宿主發(fā)生強(qiáng)烈的固有免疫反應(yīng)[10],固有免疫系統(tǒng)包括巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞等,是抵御真菌感染的第一道防線;它能夠快速啟動(dòng)并消除入侵的煙曲霉菌[11]。這種防御機(jī)制涉及特異性受體的識(shí)別、指示信號(hào)通路的激活和多種炎癥遞質(zhì)的產(chǎn)生,從而加強(qiáng)炎癥反應(yīng)。但是大量的炎癥遞質(zhì)可引發(fā)嚴(yán)重的炎癥反應(yīng),會(huì)加重感染組織的損傷,使真菌感染的病程延長(zhǎng),產(chǎn)生一系列危險(xiǎn)的并發(fā)癥如角膜穿孔甚至患眼失明[12]。真菌性角膜炎的發(fā)病率逐漸增高,且臨床缺乏有效治療藥物,迫切需要找到新的高效低毒治療藥物。

SAN是一種以苯并菲啶結(jié)構(gòu)為特征的生物堿類(lèi)天然小分子,具有高效抗炎[18-19]、抗菌[4,7,20]、抗腫瘤[21]等藥理活性。已有研究表明,在大鼠LPS介導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)中,SAN可以通過(guò)抑制大鼠H9c2心肌細(xì)胞釋放炎癥遞質(zhì)IL-1β、IL-6和TNF-α發(fā)揮抗炎作用[22]。此外有研究顯示,在LPS誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞內(nèi)毒性休克模型中,SAN通過(guò)抑制小鼠巨噬細(xì)胞釋放TNF-α及NO發(fā)揮抗炎作用[18]。然而,SAN在真菌性角膜炎中是否發(fā)揮抗炎作用尚未有報(bào)道。炎癥從本質(zhì)上說(shuō)是機(jī)體的防御反應(yīng),在初期往往起到積極作用,例如炎性充血可增加局部組織血流量,使組織得到更多的氧氣、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等,增加組織代謝和抗擊力[23]。但持續(xù)的炎癥反應(yīng)使得巨噬細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)量的炎癥遞質(zhì),可能加重角膜損傷;還會(huì)導(dǎo)致角膜蛋白沉積,造成角膜水腫甚至角膜穿孔。本研究首先探究SAN在小鼠巨噬細(xì)胞中的安全濃度,結(jié)果表明500.0 μg/L SAN對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞沒(méi)有影響,可作為安全濃度用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。本文研究感染第3天的小鼠角膜組織HE染色結(jié)果顯示,500.0 μg/L SAN組和AF組相比,小鼠角膜基質(zhì)層水腫明顯減輕,炎癥細(xì)胞數(shù)量顯著減少,組織病理結(jié)構(gòu)更為有序。ZHENG等[24]研究顯示,在LPS誘導(dǎo)的小鼠乳腺炎模型中,SAN通過(guò)顯著減少LPS引起的中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、減輕腺泡結(jié)構(gòu)的破壞,進(jìn)而修復(fù)血-乳屏障發(fā)揮抗炎功能。本文研究結(jié)果與其一致。因此,SAN可能通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)中的免疫細(xì)胞過(guò)度激活,對(duì)煙曲霉菌性角膜炎起到治療作用。

在真菌性角膜炎中,炎癥細(xì)胞過(guò)度激活會(huì)導(dǎo)致大量的炎癥遞質(zhì)釋放加重炎癥反應(yīng)[25]。已有研究證實(shí),IL-1β是參與角膜抗真菌免疫應(yīng)答的重要炎癥因子,主要由激活的單核細(xì)胞產(chǎn)生,介導(dǎo)急性炎癥應(yīng)答[26]。在右旋糖酐硫酸鈉誘導(dǎo)的小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型中,SAN通過(guò)阻斷NLRP3-(Caspase-1)/IL-1β通路,降低炎癥因子IL-1β的表達(dá),對(duì)小鼠結(jié)腸炎具有治療作用[27]。本研究結(jié)果顯示,SAN能夠明顯抑制小鼠RAW264.7細(xì)胞中煙曲霉菌刺激引起的IL-1β基因及蛋白表達(dá)升高。提示SAN可能通過(guò)抑制IL-1β的表達(dá)發(fā)揮抗炎作用。炎癥因子TNF-α、IL-6及趨化因子MCP-1為反映角膜炎癥的重要指標(biāo),TNF-α、IL-6和MCP-1的表達(dá)升高可以介導(dǎo)白細(xì)胞募集和巨噬細(xì)胞遷移及浸潤(rùn)[28]。LIN等[29]研究顯示,在吲哚美辛誘導(dǎo)的大鼠腸道炎癥模型中,SAN可以通過(guò)降低大鼠腸道組織中TNF-α和IL-6的水平發(fā)揮抑炎作用。有研究顯示,在LPS刺激的人單核細(xì)胞白血病THP-1細(xì)胞系中,SAN可以通過(guò)下調(diào)炎癥遞質(zhì)IL-1β、MCP-1和IL-6的基因表達(dá)發(fā)揮保護(hù)作用[30]。本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,SAN能顯著減少煙曲霉菌刺激的小鼠巨噬細(xì)胞中IL-6、TNF-α和MCP-1的表達(dá)。另有研究顯示,在真菌感染宿主后,宿主體內(nèi)的單核巨噬細(xì)胞等會(huì)迅速誘導(dǎo)COX-2的表達(dá)增加,導(dǎo)致下游的抑炎因子表達(dá)被抑制,對(duì)角膜炎的預(yù)后造成不利影響[31]。本文對(duì)真菌性角膜炎小鼠模型研究顯示,SAN能顯著下調(diào)COX-2及TNF-α的表達(dá)。LI等[19]研究顯示,在LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷模型中,SAN通過(guò)抑制COX-2的表達(dá)抑制炎癥細(xì)胞因子的釋放,進(jìn)而抑制炎癥反應(yīng),降低急性肺損傷小鼠的致死率。本文研究結(jié)果與其相一致。因此,應(yīng)用SAN治療也可以通過(guò)減輕真菌性角膜炎中炎癥遞質(zhì)的過(guò)度表達(dá),從而改善真菌性角膜炎的預(yù)后。

綜上所述,SAN可以通過(guò)減少炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)和下調(diào)炎癥遞質(zhì)的表達(dá),減輕小鼠角膜煙曲霉菌感染后的炎癥反應(yīng),有望成為治療真菌性角膜炎的新型藥物。但SAN在真菌性角膜炎中的具體抗炎機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。