孫昊,馬平,崔楠,于慶潭,崔靜

(1 海軍青島特勤療養(yǎng)中心醫(yī)訓(xùn)部,山東 青島 266071; 2 青島市第三人民醫(yī)院麻醉科; 3 青島大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)院管理研究所;4 海軍青島特勤療養(yǎng)中心療養(yǎng)五區(qū)檢驗(yàn)科; 5 青島市疾病預(yù)防控制中心/青島市預(yù)防醫(yī)學(xué)研究院)

2型糖尿病(T2DM)是一種慢性代謝紊亂性疾病,我國(guó)T2DM病人高達(dá)1.14億,居世界首位[1]。中醫(yī)臨床上常用大柴胡湯治療T2DM[2-3]。大柴胡湯可以通過調(diào)節(jié)IRS-1/PI3K/Akt通路活性、糖脂代謝和抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)來減輕胰島素抵抗,從而發(fā)揮治療T2DM 的作用[4-6]。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與生物信息學(xué)相結(jié)合的方法,分析大柴胡湯治療T2DM的潛在分子生物學(xué)機(jī)制,探討大柴胡湯臨床治療T2DM的藥效機(jī)制,為該方的藥理學(xué)機(jī)制研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 大柴胡湯活性成分與作用基因的挖掘

通過在線中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(tái)(TCMSP)(https://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)檢索大柴胡湯的相關(guān)蛋白。以大柴胡湯的藥物組成為檢索詞,將口服生物利用度(OB)≥40%和藥物相似性(DL)≥0.20的藥物成分相關(guān)的蛋白質(zhì)納入研究,然后將納入的蛋白質(zhì)通過蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(UniProt)(https://www.uniprot.org/)規(guī)范為相應(yīng)的基因。

1.2 T2DM相關(guān)基因的篩選

T2DM的相關(guān)基因以“‘Type 2 diabetes’and ‘Homo sapiens’ [porgn:_txid9606] and ‘series’ and ‘expression profiling by array’”在PubMed的基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(GEO數(shù)據(jù)庫)中檢索,共檢索到140個(gè)可能相關(guān)的基因芯片,通過GEO2R對(duì)含有T2DM與非T2DM樣本的基因芯片進(jìn)行中位數(shù)標(biāo)準(zhǔn)分析,導(dǎo)出T2DM與非T2DM分別處于同一水平的基因樣本,將調(diào)整后P<0.05且|log10(FC)|>1的基因納入到本研究。

1.3 大柴胡湯治療T2DM的相關(guān)靶點(diǎn)基因的篩選

Jvenn在線網(wǎng)站(http://www.bioinformatics.com.cn/static/others/jvenn/index.html)是一個(gè)用維恩圖比較列表的交互式在線工具。將大柴胡湯的作用靶點(diǎn)基因與T2DM關(guān)聯(lián)的基因均導(dǎo)入Jvenn在線網(wǎng)站,最后獲得大柴胡湯治療T2DM的相關(guān)靶點(diǎn)基因。

1.4 “復(fù)方-藥材-組分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

采用Cytoscape 3.8.2軟件,通過復(fù)方、復(fù)方藥材、部分藥材組分、靶點(diǎn)基因以及T2DM構(gòu)建“復(fù)方-藥材-組分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò),以明確大柴胡湯治療T2DM的關(guān)鍵成分、靶點(diǎn)。

1.5 GO功能和KEGG通路富集分析

將大柴胡湯治療T2DM的相關(guān)靶點(diǎn)基因?qū)氲組etascape在線分析軟件中(http://metascape.org/)進(jìn)行GO功能和KEGG通路富集分析。其中GO生物學(xué)進(jìn)程(BP)、KEGG通路、Reactome基因組等數(shù)據(jù)庫是Metascape在線分析軟件富集分析的主要來源。Metascape在線分析軟件將基因數(shù)≥3個(gè)、富集因子>1.5且P<0.01的相似GO功能和KEGG通路進(jìn)行富集分簇分析。富集分析的P值采用累積的超幾何分布計(jì)算[7];q值采用多次Banjamini-Hochberg過程計(jì)算[8];層次聚類分析采用Kappa分?jǐn)?shù),相似度>0.3的視為同一簇[9]。

1.6 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析

采用Metascape在線軟件的分子復(fù)合物檢測(cè)法對(duì)大柴胡湯治療T2DM的相關(guān)靶點(diǎn)基因進(jìn)行模塊分析,Metascape在線軟件將每個(gè)模塊的靶點(diǎn)基因分別進(jìn)行GO功能和KEGG通路分析,并將P值從小到大排列后前3位的GO功能和KEGG通路進(jìn)行描述。

2 結(jié) 果

2.1 大柴胡湯藥物活性成分與靶基因篩選

通過TCMSP在線數(shù)據(jù)庫平臺(tái)獲得大柴胡湯的藥物活性成分,獲得大柴胡湯中OB≥40%和DL≥0.20的藥物活性成分98個(gè),其中柴胡12個(gè)、黃芩18個(gè)、芍藥16個(gè)、半夏5個(gè)、生姜2個(gè)、枳實(shí)16個(gè)、大棗16個(gè)、大黃11個(gè),黃芩苷、豆甾醇、槲皮素、圣草酚(黃烷酮)等6個(gè)藥物活性成分在組方藥材2味及以上中藥中所含有。利用TCMSP在線軟件,獲得大柴胡湯的相關(guān)靶點(diǎn)蛋白后,通過Uriprot數(shù)據(jù)庫將靶蛋白規(guī)范為相應(yīng)的靶基因名稱,剔除重復(fù)基因后,最終564個(gè)靶基因被納入到本研究中。

2.2 T2DM相關(guān)基因的篩選

GEO數(shù)據(jù)庫中共檢索到18套與T2DM相關(guān)的基因芯片,18套基因芯片中調(diào)整后P<0.05且|log10(FC)|>1的T2DM相關(guān)基因共11 641個(gè)。

2.3 大柴胡湯治療T2DM的相關(guān)靶點(diǎn)基因篩選

將大柴胡湯的作用靶點(diǎn)基因與T2DM關(guān)聯(lián)的基因?qū)氲絁venn在線網(wǎng)站中,得到大柴胡湯治療T2DM的相關(guān)靶點(diǎn)基因136個(gè),見圖1。大柴胡湯復(fù)方-藥材-組分-靶點(diǎn)-T2DM網(wǎng)絡(luò)圖見圖2。表明大柴胡湯的有效藥物成分可能通過影響機(jī)體的基因而達(dá)到治療疾病的作用。

圖1 大柴胡湯治療T2DM的相關(guān)靶點(diǎn)基因

圖2 大柴胡湯復(fù)方-藥材-組分-靶點(diǎn)-T2DM網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 大柴胡湯治療T2DM相關(guān)靶點(diǎn)基因的GO功能和KEGG通路富集分析

采用Metascape在線軟件將136個(gè)大柴胡湯治療T2DM的相關(guān)靶點(diǎn)基因進(jìn)行富集分析,GO功能和KEGG通路富集分析結(jié)果顯示20個(gè)功能簇。大柴胡湯可影響機(jī)體對(duì)無機(jī)物的應(yīng)答(BP)、脂多糖的應(yīng)答(BP)、氧化應(yīng)激反應(yīng)(BP)、對(duì)有機(jī)環(huán)化合物的細(xì)胞反應(yīng)(BP)、激素刺激的細(xì)胞反應(yīng)(BP)、細(xì)胞外刺激的應(yīng)答(BP)、凋亡信號(hào)通路(BP)、活性氧代謝通路(BP)、TNF信號(hào)通路(KEGG通路)、細(xì)胞死亡的正向調(diào)節(jié)(BP)、細(xì)胞衰老(KEGG通路)、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的調(diào)節(jié)(BP)、脂肪酸代謝進(jìn)程(BP)等BP與信號(hào)通路來治療T2DM。見圖3和表1。

表1 大柴胡湯治療T2DM靶基因的富集分析

圖3 大柴胡湯治療T2DM靶基因的富集分析圖

2.5 大柴胡湯治療T2DM相關(guān)靶點(diǎn)基因的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析

采用Metascape在線軟件將136個(gè)大柴胡湯治療T2DM的相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析,大柴胡湯治療T2DM的相關(guān)靶點(diǎn)蛋白共有5個(gè)Mcode模塊,包含5個(gè)以上蛋白的模塊有4個(gè),見圖4和表2。最復(fù)雜模塊是模塊1,包含19個(gè)蛋白,其功能主要集中在蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的調(diào)節(jié)、PID-ATF2通路等;模塊2包含15個(gè)蛋白,主要集中在凋亡信號(hào)通路、凋亡過程的正調(diào)控、程序性細(xì)胞死亡的正調(diào)節(jié)等功能;模塊3和模塊4分別包含8個(gè)蛋白,分別主要集中在胰腺癌、內(nèi)分泌抵抗與胺受體配體結(jié)合、鈣信號(hào)通路等BP。

表2 大柴胡湯治療T2DM靶基因的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析

圖4 大柴胡湯治療T2DM的相關(guān)靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析圖

2.6 影響Mcode模塊的藥物

大柴胡湯中作用于模塊1的藥物有柴胡、黃芩、枳實(shí)、大黃、芍藥、生姜、大棗等;作用于模塊2的藥物有柴胡、枳實(shí)、大黃、芍藥、大棗等;作用于模塊3的藥物有柴胡、黃芩、枳實(shí)、大黃、半夏、生姜、大棗等;作用于模塊4的藥物有柴胡、大黃、枳實(shí)、大棗等;作用于模塊5的藥物有柴胡、黃芩等。

3 討 論

T2DM的發(fā)生多是由于病人過食肥甘厚味,導(dǎo)致胃熱、肝熱或者肝胃俱熱。大柴胡湯由柴胡、黃芩、大黃、枳實(shí)、芍藥、半夏、生姜、大棗等組成,主要起到和解少陽、內(nèi)瀉熱結(jié)的功效,王國(guó)斌與仝小林均運(yùn)用大柴胡湯治療T2DM[2,10]。本研究結(jié)果顯示,大柴胡湯中OB≥40%和DL≥0.20的藥物活性成分98個(gè),得到大柴胡湯治療T2DM的相關(guān)靶點(diǎn)基因136個(gè)?；?蛋白富集分析結(jié)果顯示,大柴胡湯治療T2DM的靶點(diǎn)基因,其BP與信號(hào)通路主要集中在對(duì)無機(jī)物的應(yīng)答、脂多糖的應(yīng)答、氧化應(yīng)激反應(yīng)、激素刺激的細(xì)胞反應(yīng)、細(xì)胞外刺激的應(yīng)答、凋亡信號(hào)通路、活性氧代謝通路、TNF信號(hào)通路、細(xì)胞死亡的正向調(diào)節(jié)、細(xì)胞衰老、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的調(diào)節(jié)、脂肪酸代謝進(jìn)程、鈣信號(hào)通路等。說明大柴胡湯可能通過影響氧化應(yīng)激反應(yīng)、脂肪酸代謝進(jìn)程、活性氧代謝通路等BP與信號(hào)通路來治療T2DM。有研究結(jié)果表明,大柴胡湯中能提取黃芩苷、芍藥苷[11-12],而黃芩苷能夠激活胰島素受體底物-1和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-4,并能激活A(yù)MPK-PI3K/Akt與MAPK/ERK信號(hào)通路,進(jìn)而有效地刺激機(jī)體葡萄糖的吸收[11,13-17],這與本研究結(jié)論一致。大柴胡湯提取物治療四氯化碳中毒導(dǎo)致的急性肝損傷大鼠的研究發(fā)現(xiàn),大柴胡湯能預(yù)防超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和谷胱甘肽還原酶等活性氧代謝損傷[18-19],而氧化應(yīng)激已被認(rèn)為是T2DM發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素,并最終導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化[20-24],這與本研究中大柴胡湯治療T2DM相關(guān)靶點(diǎn)基因富集于氧化應(yīng)激反應(yīng)、活性氧代謝通路等結(jié)論一致。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),大柴胡湯可以抑制胰腺脂肪酶的活性,進(jìn)而降低三酰甘油、膽固醇和游離脂肪酸等血脂指標(biāo)的水平[25-27]。T2DM是一種典型的脂代謝紊亂性疾病,目前研究顯示該病和三酰甘油、總膽固醇、游離脂肪酸等脂肪酸代謝密切相關(guān)[28-31]。這與本研究中大柴胡湯治療T2DM相關(guān)靶點(diǎn)基因富集于脂肪酸代謝進(jìn)程等結(jié)果一致。

本研究還顯示,大柴胡湯治療T2DM的靶點(diǎn)基因主要集中在對(duì)無機(jī)物的應(yīng)答、激素刺激的細(xì)胞反應(yīng)、凋亡信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、細(xì)胞死亡的正向調(diào)節(jié)、細(xì)胞衰老、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的調(diào)節(jié)等BP與信號(hào)通路,而T2DM與上述BP和通路均相關(guān),研究大柴胡湯與上述BP和通路的關(guān)系是今后大柴胡湯治療T2DM的研究方向。大柴胡湯不同的藥物組成作用在不同的模塊上,也為今后探討臨床用藥的藥理學(xué)機(jī)制與各種藥物組成在臨床中發(fā)揮協(xié)同作用提供新的研究思路,為中西醫(yī)的融合發(fā)展起到促進(jìn)作用。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)大柴胡湯能夠通過影響脂多糖的應(yīng)答、細(xì)胞外刺激、氧化應(yīng)激反應(yīng)、活性氧代謝通路、脂肪酸代謝等生物學(xué)通路來影響胰島細(xì)胞的分泌和降低血脂指標(biāo),達(dá)到清泄“肝胃郁熱”的作用,從而使T2DM病人的血糖降低。通過動(dòng)物和(或)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)將網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證是我們的下一步研究方向。