朱明雪,閆清,王鵬,王曄,牟曉峰

(青島大學(xué),山東 青島 266071 1 醫(yī)學(xué)部; 2 附屬青島市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科)

肺癌是全球范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一。由于缺乏有效的早期篩查和診斷方法,肺癌總體預(yù)后很差[1-2]。吸煙、職業(yè)性接觸致癌物是肺癌發(fā)生的常見(jiàn)原因[3]。遺傳易感性也是肺癌發(fā)生重要原因之一,其中主要的方式就是表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)的突變[4-6]。表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)的興起使EGFR突變陽(yáng)性的肺腺癌病人的病情得到緩解,但仍有20%～30%的病人出現(xiàn)EGFR-TKI耐藥[7]。研究發(fā)現(xiàn),免疫細(xì)胞浸潤(rùn)和鐵死亡在癌癥發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起重要作用[8-9]。但其與EGFR突變肺腺癌的關(guān)系仍未闡明。本研究旨在通過(guò)生物信息學(xué)分析探討EGFR突變與肺腺癌預(yù)后、免疫細(xì)胞浸潤(rùn)和鐵死亡的關(guān)系,以期為EGFR突變型肺腺癌的治療提供思路。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)獲取

從癌癥基因組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)庫(kù)下載肺腺癌RNA測(cè)序數(shù)據(jù)、基因表達(dá)矩陣及臨床信息。共獲得肺腺癌樣本513例、癌旁正常組織樣本59例。將肺腺癌樣本分為EGFR突變組與野生組,比較兩組樣本的臨床特征差異。

1.2 基因突變景觀分析

基因突變景觀分析用于了解EGFR在肺腺癌基因組層面的突變情況。對(duì)肺腺癌EGFR突變數(shù)據(jù)、轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,并利用R軟件包maftools可視化肺腺癌病人的體細(xì)胞突變,包括突變物理位置、突變類(lèi)型的全景瀑布圖及突變亞組的進(jìn)一步分析。

1.3 肺腺癌差異基因分析

使用R軟件包中的limma包分析肺腺癌RNA測(cè)序數(shù)據(jù)中基因的差異表達(dá)。以|log2FC|>1、P<0.05為篩選條件,篩選EGFR突變型、野生型肺腺癌和癌旁正常組織樣本中兩兩比較的差異表達(dá)基因(DEGs)。然后利用Venn圖獲取3組DEGs的重疊基因。

1.4 預(yù)后模型構(gòu)建及評(píng)價(jià)

基于DEGs的重疊基因構(gòu)建LASSO-Cox風(fēng)險(xiǎn)預(yù)后模型,依據(jù)模型風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分中位值將樣本分為高、低風(fēng)險(xiǎn)組進(jìn)行Kaplan-Meier(KM)生存分析。R軟件包glmnet用于signature模型的分析,Log rank檢驗(yàn)用于比較高、低風(fēng)險(xiǎn)組的生存差異,時(shí)間依賴(lài)的受試者工作特征(ROC)曲線用于分析特征基因和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性,單因素Cox風(fēng)險(xiǎn)比例回歸分析用于篩選對(duì)肺腺癌有預(yù)后意義的基因。采用Spearman相關(guān)性分析方法分析EGFR突變與關(guān)鍵基因之間的相關(guān)性,利用R軟件包pheatmap展示多基因相關(guān)性熱圖。

1.5 肺腺癌EGFR突變與免疫細(xì)胞關(guān)系分析

利用R軟件包immunedeconv對(duì)EGFR突變組和野生組肺腺癌樣本進(jìn)行免疫評(píng)分評(píng)估,使用Wilcox檢驗(yàn)比較兩組之間的差異。采用Spearman相關(guān)性分析方法分析肺腺癌中EGFR突變與免疫細(xì)胞之間的相關(guān)性。利用R軟件包pheatmap繪制熱圖。

1.6 肺腺癌EGFR突變與鐵死亡基因關(guān)系分析

分析肺腺癌中24個(gè)鐵死亡相關(guān)基因在EGFR突變型、野生型肺腺癌組織中的差異表達(dá)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 EGFR在肺腺癌中的突變率

EGFR在肺腺癌中存在突變,體細(xì)胞突變率為11.64%(圖1A)。瀑布圖顯示,81.48%的樣本出現(xiàn)突變(圖1B)。

A:EGFR在肺腺癌中突變的棒棒糖圖;B:瀑布圖顯示了肺腺癌的體細(xì)胞突變景觀。

2.2 EGFR突變與臨床特征的關(guān)系

EGFR突變與性別(χ2=5.139,P<0.05)和吸煙(χ2=36.822,P<0.01)有關(guān),而與其他臨床特征無(wú)關(guān)。見(jiàn)表1。

表1 兩組臨床特征比較(例)

2.3 肺腺癌差異基因分析

對(duì)EGFR突變型、野生型肺腺癌和癌旁正常組織樣本進(jìn)行兩兩比較,得到3組DEGs?；鹕綀D顯示,EGFR突變型與野生型肺腺癌組織DEGs中有42個(gè)上調(diào)基因,30個(gè)下調(diào)基因(圖2A);EGFR突變型肺腺癌與癌旁正常組織DEGs中有1 809個(gè)上調(diào)基因,2 143個(gè)下調(diào)基因(圖2B);EGFR野生型肺腺癌和癌旁正常組織DEGs中有1 517個(gè)上調(diào)基因,2 388個(gè)下調(diào)基因(圖2C)。對(duì)這3組DEGs取交集,得到31個(gè)重疊基因(圖2D)。

A:EGFR突變型和野生型肺腺癌組織的差異基因分析;B:EGFR突變型肺腺癌和癌旁正常組織的差異基因分析;C:EGFR野生型肺腺癌和癌旁正常組織的差異基因分析;D:利用Venn圖獲取3組DEGs的重疊基因。

2.4 預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型構(gòu)建及評(píng)價(jià)

用LASSO回歸分析從31個(gè)重疊基因中篩選出4個(gè)(GLB1L3、TMEM63C、FAM83A、GPX2)建立預(yù)后模型,基因篩選過(guò)程見(jiàn)圖3A、B。模型風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的計(jì)算公式:風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分=(-0.002 9)×GLB1L3表達(dá)量+(-0.035 2)×TMEM63C表達(dá)量+0.145 7×FAM83A表達(dá)量+0.004 6×GPX2表達(dá)量。計(jì)算出每個(gè)樣本的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分值,依據(jù)中位值將樣本分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組。KM曲線分析結(jié)果顯示,高風(fēng)險(xiǎn)組生存率較低(HR=1.932,95%CI=1.433～2.606,P<0.05)(圖3C)。ROC曲線分析顯示,風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分預(yù)測(cè)病人1、3、5年生存率的曲線下面積(AUC)分別為0.700、0.658和0.622(圖3D)。單因素Cox風(fēng)險(xiǎn)比例回歸分析顯示,在31個(gè)重疊基因中,GLB1L3、TMEM63C、FAM83A是肺腺癌的預(yù)后特征基因(圖3E)。相關(guān)性分析結(jié)果顯示,EGFR突變與GLB1L3和TMEM63C呈正相關(guān)(r=0.383 1、0.382 6,P<0.05),而與FAM83A無(wú)顯著相關(guān)性(r=0.081 0,P>0.05)(圖3F)。

A:LASSO回歸系數(shù)分布圖,λ取最小值時(shí)對(duì)應(yīng)的基因數(shù)為4個(gè);B:根據(jù)十折交叉驗(yàn)證結(jié)果選擇最優(yōu)λ值,在λ值最小時(shí)篩選出4個(gè)基因;C:高、低風(fēng)險(xiǎn)組的KM生存曲線;D:預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型預(yù)測(cè)病人1、3、5年總生存率的ROC曲線與AUC;E:單因素Cox風(fēng)險(xiǎn)比例回歸分析預(yù)后特征基因;F:預(yù)后特征基因與EGFR突變的相關(guān)性。

2.5 肺腺癌EGFR突變與免疫細(xì)胞關(guān)系

免疫細(xì)胞評(píng)分熱圖顯示,有6種免疫細(xì)胞在EGFR突變型和野生型肺腺癌中的分布差異具有顯著性(P<0.05),其中CD8+T細(xì)胞分布差異最大(圖4A)。利用CIBERSORT算法估算22種免疫細(xì)胞在肺腺癌樣本中的浸潤(rùn)豐度,其中CD8+T細(xì)胞的浸潤(rùn)豐度最大(圖4B)。分析預(yù)后特征基因與免疫細(xì)胞的相關(guān)性,其中B細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞均與GLB1L3、TMEM63C有顯著相關(guān)性(P<0.01)(圖4C)。

A:免疫細(xì)胞評(píng)分熱圖,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001;B:腫瘤免疫浸潤(rùn)細(xì)胞在每個(gè)樣本中的百分比豐度;C:預(yù)后特征基因與免疫細(xì)胞的相關(guān)性分析。

2.6 肺腺癌EGFR突變與鐵死亡基因關(guān)系

在EGFR突變型和野生型肺腺癌中,ATL1、SLC7A11、GLS2等10個(gè)鐵死亡基因表達(dá)差異具有顯著性(t=1.896～3.765,P<0.05)(圖5)。

圖5 鐵死亡相關(guān)基因在EGFR突變型及野生型肺腺癌組織中的表達(dá)熱圖

3 討 論

肺腺癌是肺癌最常見(jiàn)的類(lèi)型。EGFR基因突變是導(dǎo)致肺腺癌發(fā)生的重要因素。EGFR突變型肺腺癌病人預(yù)后較差[10-12]。即使臨床上廣泛應(yīng)用EGFR-TKI治療EGFR突變型肺腺癌病人,最終也不可避免產(chǎn)生耐藥性,進(jìn)而影響預(yù)后。本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析探討EGFR突變與肺腺癌預(yù)后、免疫細(xì)胞浸潤(rùn)和鐵死亡的關(guān)系,以期為EGFR突變型肺腺癌的治療提供思路。

本研究生物信息學(xué)分析顯示,EGFR在肺腺癌中的體細(xì)胞突變率為11.64%。一項(xiàng)口腔腫瘤研究結(jié)果表明,吸煙可以上調(diào)EGFR信號(hào),并且能夠促進(jìn)體外和體內(nèi)口腔腫瘤的發(fā)生[13]。本文研究結(jié)果顯示,EGFR突變與肺腺癌病人性別和吸煙有關(guān),進(jìn)一步印證了EGFR與吸煙的關(guān)系。本研究建立了預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型,并且發(fā)現(xiàn)GLB1L3、TMEM63C、FAM83A是肺腺癌的預(yù)后特征基因,這3個(gè)基因或?qū)⒊蔀槲磥?lái)預(yù)測(cè)肺腺癌預(yù)后的重要因子。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),EGFR突變與GLB1L3、TMEM63C呈正相關(guān),這2個(gè)基因的表達(dá)或許促進(jìn)了EGFR的突變,下一步可以通過(guò)細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

免疫療法具有提高腫瘤緩解率、毒副作用小的特點(diǎn)。然而不同EGFR突變狀態(tài)的腫瘤對(duì)免疫治療的反應(yīng)不同。T細(xì)胞在腫瘤細(xì)胞免疫中起到中心調(diào)控作用[14]。CD8+T細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞,其在免疫微環(huán)境中的比例升高通常與病人的良好預(yù)后相關(guān)[15]。本研究結(jié)果顯示,肺腺癌組織中CD8+T細(xì)胞比例較高,且與EGFR突變狀態(tài)相關(guān),預(yù)后特征基因與B細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞具有顯著相關(guān)性,表明EGFR突變可能通過(guò)影響免疫細(xì)胞浸潤(rùn)進(jìn)而影響免疫治療。鐵死亡是一種鐵依賴(lài)性的細(xì)胞程序性死亡,它通過(guò)改變細(xì)胞代謝方式,使細(xì)胞大量積累脂質(zhì)過(guò)氧化物和活性氧來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞程序性死亡[16]。既往有研究表明,肺癌組織中血清鐵蛋白的表達(dá)普遍增高,血清鐵蛋白的高表達(dá)在肺癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移中起著重要作用,并導(dǎo)致較差的遠(yuǎn)期預(yù)后[17-18]。本研究結(jié)果顯示,鐵死亡相關(guān)基因CIDS1和ATP5MC3與EGFR突變具有顯著相關(guān)性,這或許提示鐵死亡對(duì)于肺腺癌的重要作用可細(xì)分至EGFR基因的突變狀態(tài)。

綜上所述,EGFR突變與肺腺癌的不良預(yù)后相關(guān),且與腫瘤免疫細(xì)胞浸潤(rùn)和鐵死亡存在緊密聯(lián)系,這為肺腺癌的進(jìn)一步研究和治療提供了新思路。