李文倩,宮宇紅,邱文生

(1 青島大學附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科,山東 青島 266031; 2 海軍青島特勤療養(yǎng)中心中醫(yī)科)

胃癌是全球發(fā)病率排第5、死亡率排第3的惡性腫瘤[1]。在過去的幾年中,免疫療法在提高胃癌病人的總生存期(OS)方面被證明是有效的[2]。然而,由于胃癌的高度異質(zhì)性,免疫療法并不適用于所有胃癌病人[3]。因此,開發(fā)能夠準確預測胃癌腫瘤免疫微環(huán)境的基因標簽,以識別不同的胃癌免疫亞型,確定最有可能從免疫治療中獲益的人群,是目前亟待解決的問題。在腫瘤組織中,免疫細胞浸潤的程度受腫瘤周圍毛細血管通透性、腫瘤刺激產(chǎn)生的細胞因子和趨化因子以及腫瘤微環(huán)境中細胞外基質(zhì)的影響[4]。作為細胞外基質(zhì)的重要組成部分,基底膜(BM)在免疫細胞浸潤過程中充當重要屏障[5]。然而,BM相關分子是否能夠影響免疫細胞浸潤從而調(diào)節(jié)腫瘤免疫微環(huán)境仍然未知。此外,BM作為浸潤性癌和原位癌區(qū)分的關鍵結構,在腫瘤的侵襲和轉移中發(fā)揮重要作用[6]。目前尚無研究探討B(tài)M相關分子對胃癌預后的影響。本研究基于生物信息學方法對以上問題進行了初步探討。

1 材料和方法

1.1 BM相關基因表達數(shù)據(jù)的采集

從癌癥基因組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)庫中獲取32例正常樣本及375例胃癌樣本的RNA測序數(shù)據(jù)和臨床信息作為訓練集,再從基因表達綜合數(shù)據(jù)庫(GEO)GSE84437數(shù)據(jù)集中獲取433例胃癌樣本的RNA測序數(shù)據(jù)和臨床信息作為驗證集。從基因集富集分析(GSEA)分子特征數(shù)據(jù)庫(v7.5.1版本)中獲取61個BM相關基因。

1.2 與胃癌預后相關的BM相關基因標簽的構建及驗證

用“l(fā)imma”R包分析腫瘤和正常組織間差異表達的BM相關基因(BMDEGs),將|log2FC|>1和偽發(fā)現(xiàn)率(FDR)<0.05作為閾值。訓練集采用單變量比例風險回歸(Cox回歸)分析篩選胃癌預后相關的BM相關候選基因,進一步使用最小絕對值選擇與收縮算子(LASSO)回歸建立提示胃癌預后的BM相關基因標簽。根據(jù)標簽中每個BM相關基因的標準化表達水平與其相應回歸系數(shù)的乘積再總和來計算每例病人的風險評分。根據(jù)中位風險評分將訓練集和驗證集的病人分為高、低風險組,采用生存曲線(Kaplan-Meier曲線)分析評估兩組生存差異,Cox回歸及受試者工作特征(ROC)曲線分析進一步驗證標簽的可靠性和穩(wěn)定性。用“rms”R包構建列線圖,預測胃癌病人1、3、5年的OS。建立校準曲線以評估使用列線圖預測的OS與實際觀察到的OS之間的一致性,采用ROC曲線分析比較各預測變量的預后價值,采用決策曲線分析(DCA)評估列線圖模型的臨床適用性。

1.3 腫瘤免疫微環(huán)境及免疫治療反應分析

采用不同算法評估高、低風險組胃癌病人腫瘤微環(huán)境中免疫細胞的豐度,同時分析兩組間免疫檢查點相關基因表達、免疫功能、基質(zhì)評分、免疫評分以及腫瘤微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(MSI)的差異。從腫瘤免疫功能障礙和排斥(TIDE)在線網(wǎng)站(http://tide.dfci.harvard.edu/)下載胃癌免疫治療反應相關數(shù)據(jù)信息,計算高、低風險組病人的TIDE評分,并利用GSE78220和PRJEB25780數(shù)據(jù)集信息分析風險評分與免疫治療反應的關系。然后用“pRRophetic”R包分析風險評分與胃癌常用化療藥物敏感性之間的關系。

1.4 在線生信分析工具驗證BMDEGs的表達

基于基因表達水平交互式分析平臺(GEPIA)(http://gepia.cancer-pku.cn/detail.php)驗證胃癌和正常胃組織中BMDEGs的差異表達水平。

1.5 統(tǒng)計學分析

應用GraphPad Prism 8.0.1軟件(GraphPad Software,Inc.)和R 4.1.2軟件進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析。連續(xù)變量比較采用Student’st檢驗、獨立樣本W(wǎng)ilcoxon秩和檢驗、Kruskal-Wallis檢驗和方差分析,相關性分析采用Pearson相關分析。P<0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 BM相關基因標簽的構建

差異分析篩選出19個BMDEGs(圖1A、B)。用單變量Cox回歸分析進一步篩選出8個與胃癌預后相關的BMDEGs(圖1C),通過LASSO回歸分析最終建立了由6個BMDEGs(CAV1、COL4A1、MMP11、PXDN、COL4A5、USH2A)組成的胃癌基因標簽(圖1D、E)。

2.2 BM相關基因標簽預后價值的評估

病人的風險評分計算如下:風險評分=0.072×CAV1的表達+0.015×COL4A1的表達+0.077×MMP11的表達+0.152×PXDN的表達+0.054×COL4A5表達+1.188×USH2A表達。訓練集(圖2A)和驗證集(圖2B)中的病人均根據(jù)中位風險評分分為高、低風險組。訓練集和驗證集中風險評分較高的胃癌病人往往死亡較早,Kaplan-Meier曲線分析表明,高風險組胃癌病人的OS較短(圖2C～F)。訓練集單變量Cox回歸分析表明,年齡和T、N、M分期以及風險評分(P<0.001,HR=3.472,95%CI=1.949～6.186)與OS之間顯著相關(圖2G);多變量Cox回歸分析同樣顯示,年齡和N、M分期以及風險評分(P<0.001,HR=4.008,95%CI=2.193～7.323)是OS的獨立預后因素(圖2H)。驗證集的單變量和多變量Cox回歸分析進一步證實了訓練集的結果(圖2J、K)。以上結果證明我們構建的BM相關基因標簽可作為胃癌病人的獨立預后生物標志物。ROC曲線分析結果顯示,訓練集中預測胃癌病人1、3、5年生存率的風險評分曲線下面積(AUC)分別為0.627、0.638和0.717(圖2I),驗證集中預測1、3、5年生存率的風險評分AUC也均高于0.6(圖2L)。

TCGA(A)和GEO(B)隊列中胃癌病人的風險分數(shù)分布;TCGA(C)和GEO(D)隊列中胃癌病人風險分數(shù)和生存狀態(tài)關系散點圖;TCGA(E)和GEO(F)隊列中高、低風險組胃癌病人OS的Kaplan-Meier曲線;TCGA(G、H)和GEO(J、K)隊列中臨床特征和風險評分的單變量和多變量Cox回歸分析森林圖;TCGA(I)和GEO(L)隊列中風險評分預測胃癌病人1、3、5年OS的ROC曲線。

2.3 預測胃癌OS的列線圖模型的構建及評價

將多種臨床風險因素與基于基因標簽計算所得風險評分結合構建胃癌OS預測的列線圖模型(圖3A)。訓練集及驗證集的校準曲線顯示,列線圖模型預測胃癌病人OS的準確度較高(圖3B、C)。兩隊列ROC曲線分析結果顯示,列線圖模型預測胃癌病人1、3、5年OS的AUC均較風險評分高(圖3D、G),更顯著高于其他臨床風險因素(圖3E、H)。DCA結果顯示,列線圖模型預測胃癌OS的臨床適用度也較高(圖3F、I)。

2.4 腫瘤免疫微環(huán)境與免疫治療反應分析

免疫細胞浸潤與風險評分間關系分析結果顯示,大多數(shù)免疫細胞浸潤水平與風險評分呈正相關,尤其是促進胃癌進展和導致免疫抑制的細胞(圖4A)。箱線圖結果亦是如此(圖4B)。免疫功能差異分析結果顯示,趨化因子CCR家族、抗原遞呈細胞(APC)共刺激、Ⅱ型干擾素反應功能在高風險組中更強,而主要組織相容性復合體(MHC)Ⅰ類功能在低風險組中更強(圖4C)。免疫檢查點相關基因(ICGs)表達差異情況分析顯示,高風險組中有22個基因表達水平顯著增加,而低風險組中僅有4個基因(圖4D)。計算兩組腫瘤純度(ESTIMATE)評分、免疫評分和基質(zhì)評分結果顯示,高風險組3種評分均顯著高于低風險組(圖4E、F、G)。上述結果表明,高風險組胃癌病人可能通過促進免疫抑制細胞浸潤,ICGs表達增加,以及募集更多基質(zhì)細胞介導免疫逃逸,從而導致預后不良。

A:免疫細胞浸潤和風險評分之間的相關性分析;高、低風險組間免疫細胞浸潤(B)、免疫功能(C)和ICGs表達(D)的博弈圖;高、低風險組ESTIMATE評分(E)、免疫評分(F)和基質(zhì)評分(G)的比較。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

MSI分析結果顯示,MSI-H的病人風險評分更低(圖5A);TIDE分析結果顯示,高風險組病人的TIDE評分更高(圖5B)。利用GSE78220(圖5C)及PRJEB25780(帕博利珠單抗治療反應,圖5D)免疫治療反應數(shù)據(jù)集分析風險評分與免疫治療反應之間的關系,結果顯示,免疫治療有反應組風險評分更低。表明高風險組胃癌病人更容易發(fā)生免疫逃逸,且對免疫治療的反應更有限。常用化療藥物敏感性差異分析結果顯示,高風險組對硼替佐米、環(huán)巴胺以及帕唑帕尼的敏感性更高(圖5E～G),而低風險組則對甲氨蝶呤和絲裂霉素C更敏感(圖5H、I)。以上結果表明,本研究構建的BM相關基因標簽有助于臨床管理和減少胃癌病人耐藥的發(fā)生。

2.5 6個BMDEGs表達水平的驗證

GEPIA分析結果顯示,胃癌組織中COL4A1、PXDN和MMP11的表達水平顯著高于正常組織,而COL4A5的表達水平則顯著低于正常組織,但與先前研究不同的是,CAV1和USH2A在胃癌與正常組織中的表達差異無顯著性。

3 討 論

BM作為腫瘤進展和腫瘤微環(huán)境調(diào)節(jié)中至關重要的結構,目前還沒有研究探索其相關分子在胃癌預后、腫瘤免疫微環(huán)境以及胃癌免疫治療中的作用。本研究基于TCGA數(shù)據(jù)庫,從61個BM相關基因中篩選出19個在胃癌及癌旁組織中差異表達的基因,進一步采用單變量Cox和LASSO回歸進行預后分析,最后構建了一個包含6個關鍵BMDEGs的基因標簽,該標簽可對胃癌病人生存風險進行評分,評估病人預后,分析腫瘤免疫微環(huán)境,可作為評估胃癌免疫治療效果的有效分子生物標志物。該標簽所包含的6個關鍵基因目前已被證明會影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

CAV1是洞穴的主要支架蛋白,研究發(fā)現(xiàn)它在胃癌組織中低表達,增加其表達可抑制胃癌發(fā)展[7]。COL4A1是Ⅳ型膠原蛋白α鏈(COL4A)家族的成員,可通過調(diào)節(jié)Hedgehog信號通路影響胃癌侵襲和上皮間質(zhì)轉化,有助于胃癌轉移[8]。COL4A5同屬于COL4A家族,生存分析表明,COL4A1/5表達百分比越低,胃癌病人的OS越長,且COL4A5是胃癌的獨立預后分子標志物[9]。MMP11作為基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)家族的一員,在胃癌病人腫瘤組織和血漿純化的外泌體中過表達,參與胃癌轉移,影響胃癌OS[10]。PXDN催化膠原蛋白Ⅳ中的磺酰胺鍵,起鞏固BM的作用,研究發(fā)現(xiàn)PXDN可抑制宮頸癌的上皮間質(zhì)轉化[11],但可促進黑色素瘤細胞侵襲[12]。USH2A編碼Usherin蛋白,研究發(fā)現(xiàn)該蛋白在胃癌的早期階段表達水平升高,可能與促進胃癌的進展有關[13]。以上文獻結果增加了本研究構建的基因標簽預測胃癌病人預后的可靠性。

此外,本研究還結合多種臨床風險因素與基于基因標簽所得的風險評分構建了一個能夠更為準確預測胃癌OS的列線圖模型,并從3個維度評估了列線圖模型預測胃癌OS的臨床價值。結果顯示,列線圖模型預測胃癌OS的準確度、區(qū)分度以及臨床適用度均較高。

通過對BM相關分子與腫瘤免疫微環(huán)境的相關性進行分析發(fā)現(xiàn),高風險組中免疫細胞浸潤度較高,且浸潤的免疫細胞多與腫瘤發(fā)展和抗腫瘤免疫抑制相關,如腫瘤相關巨噬細胞、肥大細胞、腫瘤相關中性粒細胞及調(diào)節(jié)性T細胞。此外,高風險組基質(zhì)細胞評分以及ICGs的表達均較高,這進一步促進了高風險組免疫逃逸的發(fā)生。

過去10年中,免疫檢查點阻斷療法已使一系列惡性腫瘤獲得令人振奮的生存獲益。目前我國已批準納武利尤單抗聯(lián)合化療(CapeOX/FOLFOX)用于晚期胃癌一線治療,無論PD-L1的表達如何。信迪利單抗聯(lián)合CapeOX也已在我國被批準用于晚期胃癌一線治療。此外尚有一些在其他腫瘤中獲批的PD-1單抗對晚期胃癌的療效目前也在研究中。同時,國內(nèi)也有一大批PD-1抑制劑用于胃癌術前新輔助治療的二期臨床研究正在進行,目前安全性基本沒有問題。免疫治療的日益成熟應用將對早晚期胃癌病人的生存及生活質(zhì)量起到明顯改善作用。

TCGA根據(jù)胃癌分子及遺傳特征將胃癌分為4種亞型:EB病毒陽性型、微衛(wèi)星不穩(wěn)定型、染色體不穩(wěn)定型和基因組穩(wěn)定型[14]。其中EB病毒陽性型胃癌表現(xiàn)出高CD8陽性T細胞浸潤和PD-L1/L2表達增加,提示其對免疫檢查點抑制劑具有更高的敏感性[15]。MSI-H狀態(tài)是手術完全可切除胃癌病人的良好預后因素,是圍手術期細胞毒性化療(如氟尿嘧啶類)反應的陰性預測指標,也是免疫檢查點抑制劑反應的陽性預測因子。美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡指南推薦對所有新確診為胃癌的病人使用聚合酶鏈反應、二代測序或免疫組化方法進行MSI狀態(tài)檢測(https://www.nccn.org/professionals/physician_gls/pdf/gastric.pdf)。此外,腫瘤突變負荷以及PD-L1表達均是免疫檢查點抑制劑治療晚期胃癌療效的有用預測生物標志物。本研究采用生物信息學方法構建了一個新的可預測胃癌免疫微環(huán)境及免疫治療反應的BM相關基因標簽,通過TIDE及其他免疫治療反應數(shù)據(jù)庫分析,結果表明該基因標簽能夠很好地預測胃癌抗PD-1治療反應。

總之,本研究首次將BM與胃癌預后、腫瘤免疫微環(huán)境和免疫治療反應評估聯(lián)系起來,隨著二代測序技術的成熟應用,本研究結果有望使胃癌的免疫治療、分子靶向治療及化療更加個體化和精準化。