李 真， 郝 凱， 賀超良， 田華雨，4

（1. 中國科學(xué)院長春應(yīng)用化學(xué)研究所生態(tài)環(huán)境高分子材料重點實驗室, 長春 130022;2. 中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)應(yīng)用化學(xué)與工程學(xué)院, 合肥 230026;3. 廈門大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院, 固體表面物理化學(xué)國家重點實驗室, 廈門 361005;4. 福建省能源材料科學(xué)與技術(shù)創(chuàng)新實驗室(IKKEM), 廈門 361005）

姜黃素（Cur）是一種在姜科植物中含量較高的多酚類物質(zhì)， 是姜黃的主要成分［1］. 姜黃素的來源廣泛， 不良反應(yīng)小， 價格低廉［2］， 且經(jīng)研究證實其具有多種藥理作用， 包括對腫瘤的抑制作用、 抗氧化作用、 抗炎作用和免疫調(diào)節(jié)作用［3］. 姜黃素可通過調(diào)節(jié)核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）信號通路抑制氧化反應(yīng)，阻礙炎癥細(xì)胞因子、 腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細(xì)胞介素-6（IL-6）的分泌， 從而發(fā)揮抗炎作用［4，5］. 但因其親脂性強［6］、 水溶性和穩(wěn)定性差， 難以被細(xì)胞攝取和吸收， 不利于藥物發(fā)揮作用， 從而極大地限制了其生物利用［7］. 目前， 一些以脂質(zhì)體、 微球和聚合物膠束為載體的新型姜黃素制劑已被開發(fā)， 用于提高其分散性和穩(wěn)定性［8］. 聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）是一種生物相容性良好的材料， 已被美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)用于臨床治療［9］. PLGA具有良好的藥物包封效果和優(yōu)良的成膜性能， 在藥物遞送領(lǐng)域獲得了廣泛的應(yīng)用. 研究結(jié)果表明， PLGA可將藥物分子封裝在其形成的納米顆粒中， 在保留藥物活性的同時能夠起到藥物緩釋的效果［10～13］.

本文通過雙乳液法制備了一種具有較高Cur載藥率的PLGA@Cur納米顆粒（PLGA@Cur NPs）， 顯著改善了Cur在水中的分散性和水溶性， 并對其抗氧化性和抗炎性進行了詳細(xì)的表征. 結(jié)果表明， 在細(xì)胞水平上， PLGA@Cur NPs可有效清除細(xì)胞內(nèi)的活性氧（ROS）， 降低促炎細(xì)胞因子含量， 緩解細(xì)胞水平的炎癥. 該納米藥物遞送系統(tǒng)的開發(fā)為Cur用于炎癥疾病的治療奠定了基礎(chǔ)， 為提高姜黃素的生物利用度提供了新的思路.

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

PLGA（貨號P133293）、 姜黃素（貨號C400222）、 聚乙烯醇（PVA， 貨號P139537）、 黃嘌呤氧化酶、黃嘌呤、 二氫乙錠和2，2-偶氮二（2-甲基丙基咪）二鹽酸鹽（AAPH）， 分析純， 上海阿拉丁生化科技股份有限公司； 二氯甲烷、 無水乙醇和過氧化氫， 分析純， 上海滬試實驗室器材股份有限公司； 無水硫酸銅， 分析純， 北京伊諾凱科技有限公司； 甲醇（HPLC級）和3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺（TMB， 分析純）， 北京百靈威科技有限公司； 冰乙酸（HPLC級）和叔丁基過氧化氫溶液（TBHP， 分析純）， 上海麥克林生化科技有限公司； RAW 264.7， 美國ATCC公司； 胎牛血清、 磷酸鹽緩沖液（PBS）和細(xì)胞培養(yǎng)基（DMEM），美國Gibco 公司； 活性氧測定試劑盒， 上海碧云天生物技術(shù)有限公司； TNF-αELISA 試劑盒， 美國Thermo Fisher Scientific 公司； CCK-8測定試劑盒， 大連美倫生物技術(shù)有限公司； CpG核酸， 上海生工生物工程有限公司， 其意義鏈序列為TCGTCGTTTCGGCGCGCCGCCCACAUAAAAAACAGUUG.

UltiMate3000型超高效液相色譜儀（HPLC）， 美國戴安公司； Zeiss GeminiSEM 500型場發(fā)射掃描電子顯微鏡（SEM）， 美國蔡司公司； H1750R 型高速離心機， 湖南湘儀離心機儀器有限公司；SB-5200DTDN型超聲波細(xì)胞破碎機， 寧波新芝生物科技股份有限公司； RO15型多點磁力攪拌器， 德國IKA 公司； LAMBDA 1050+型紫外-可見-近紅外分光光度計（UV-Vis-NIR）， 美國PerkinElmer 公司；Varioskan LUX 型酶標(biāo)儀， 美國Thermo Fisher Scientific 公司； NanoBrook 173Plus 型動態(tài)光散射粒度儀（DLS）， 美國Brookhaven公司.

1.2 實驗過程

1.2.1 PLGA@Cur NPs 的制備 采用雙乳液法制備PLGA@Cur NPs. 將50 mg PLGA 和一定質(zhì)量的Cur 溶解在1 mL 二氯甲烷中形成混合溶液， 然后緩慢加入至3 mL 5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）PVA 水溶液中， 用100 W 超聲波破碎儀超聲1 min， 得到初始乳液. 將該乳液緩慢加入至50 mL 1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）PVA 水溶液中， 用100 W超聲波破碎儀超聲3 min， 得到復(fù)乳液. 通過在室溫下攪拌12 h除去復(fù)乳液中殘留的二氯甲烷. 然后用離心機以1200 r/min 的速度離心10 min， 分離得到PLGA@Cur NPs. 用15 mL超純水洗滌PLGA@Cur NPs 3次進行純化.

1.2.2 PLGA@Cur NPs的表征 將PLGA@Cur NPs分散在超純水中， 配制成約500 μg/mL的懸濁液， 采用動態(tài)光散射粒度儀（DLS）對納米顆粒的粒徑、 多分散指數(shù)（PDI）和Zeta電位進行測定［14，15］. 通過掃描電子顯微鏡觀察納米顆粒的形貌.

1.2.3 PLGA@Cur NPs 包封率和載藥率的測定 采用雙乳液法制備PLGA@Cur NPs 色譜柱：Agilent Extend-C8 4.6×250 mm， 流動相為甲醇-0.5%乙酸水溶液（體積比4∶1）， 柱溫35 ℃， 流速1.0 mL/min， 檢測波長425 nm， 進樣量10 μL.

Cur 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制： 將1 mg 姜黃素溶于1 mL 甲醇中， 用流動相梯度稀釋為500， 250， 125，62.5， 31.25， 17.82， 3.91和1.95 μg/mL的姜黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液， 進行HPLC測試， 記錄峰面積， 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.

精確稱取適量凍干后的PLGA@Cur NPs， 加入一定量的乙醇， 超聲20 min， 使姜黃素充分提取至乙醇中， 取上清液經(jīng)過濾后用于HPLC檢測. 按下式計算姜黃素的包封率（DLE， %）和載藥量（DLC， %）：

式中：m（Lg）為實際裝載姜黃素的質(zhì)量；m（Fg）為理論投入姜黃素的質(zhì)量；mN（g）為載藥納米顆粒的質(zhì)量.

1.2.4 PLGA@Cur NPs的抗氧化性測試 通過硫酸銅與H2O2的芬頓（Fenton）反應(yīng)制得·OH. 首先將0.1 mL Cu2（+500 μg/mL）、 0.1 mL H2O（21 mmol/L）、 0.1 mL TMB（10 mmol/L）和0.1 mL 樣品（2 mg/mL）加入到0.6 mL Milli-Q水中， 室溫孵育1 h， 測定氧化后TMB在混合物中的UV-Vis吸光度值. 通過觀察樣品在650 nm處的峰值的變化考察其對·OH的清除作用. 黃嘌呤可在黃嘌呤氧化酶的作用下產(chǎn)生. 將0.1 mL 黃嘌呤氧化酶（5 EU/mL）、 0.1 mL 黃嘌呤（6 mmol/L）和0.1 mL PLGA@Cur NPs（2 mg/mL， 樣品組）或0.1 mL Milli-Q 水（空白組）混合在0.6 mL PBS 中， 于37 ℃孵育40 min. 然后加入0.1 mL 二氫乙錠（1 mg/mL）， 混合均勻后， 轉(zhuǎn)移至熒光酶標(biāo)板中， 用酶標(biāo)儀測定二氫乙錠氧化產(chǎn)物乙錠的熒光強度.的相對含量（Content of O·2-， %）按下式計算：

其中：Fs和Fb分別為處理后的樣品組和空白組的熒光強度.

1.2.5 PLGA@Cur NPs 的細(xì)胞毒性測試 使用CCK-8 試劑盒評價PLGA@Cur 的細(xì)胞毒性. 將RAW 264.7 細(xì)胞在含10%的胎牛血清及100 U/mL 青霉素、 100 U/mL 鏈霉素的DMEM 高糖培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)， 培養(yǎng)箱培養(yǎng)條件設(shè)定為5%（體積分?jǐn)?shù)）CO2， 37 ℃. 當(dāng)RAW 264.7 細(xì)胞生長到一定數(shù)量時， 以1×104cell/孔的密度接種到96 孔板中， 并在37 ℃、 含5% CO2的培養(yǎng)箱中黏附12 h［16～18］. 然后用不同濃度的樣品處理這些細(xì)胞. 在培養(yǎng)24 h后， 將培養(yǎng)基替換為含有10% CCK-8的生長培養(yǎng)基， 培養(yǎng)1 h. 用酶標(biāo)儀測量孔板中溶液在450 nm處的光強度（OD 450 nm）計算細(xì)胞活力.

1.2.6 PLGA@Cur NPs 的血液相容性測試 取1 mL新鮮小鼠血液， 以1200 r/min 的轉(zhuǎn)速離心10 min分離血細(xì)胞. 用PBS洗滌離心沉淀物， 直至上清液澄清透明， 離心沉淀物為血細(xì)胞. 陽性組加入10 μL血細(xì)胞和90 μL 1% TritonX-100， 陰性組加入10 μL血細(xì)胞和90 μL PBS. 在樣品組中， 加入10 μL血細(xì)胞和90 μL PLGA@Cur， 使PLGA@Cur NPs 的終濃度為100 mg/mL. 各組于室溫下孵育2 h， 離心后拍照.取離心后的上清液， 測定其在450 nm處的吸光度值. 按下式計算溶血率（Hemolysis， %）：

其中：As，Ap和An分別為樣本組、 陽性組和陰性組的吸光度值.

1.2.7 細(xì)胞內(nèi)ROS 檢測 將RAW 264.7 細(xì)胞以8000 cell/孔的密度接種到96 孔板中， 并在37 ℃、 含5% CO2的培養(yǎng)箱中黏附12 h. 用10 μL 1 mmol/L的TBHP和10 μL 1.2 mg/mL的PLGA@Cur NPs 處理細(xì)胞24 h， 細(xì)胞用H2DCFDA染色后用PBS反復(fù)沖洗， 用熒光顯微鏡成像.

1.2.8 細(xì)胞因子檢測 將RAW 264.7 細(xì)胞以2×104cell/孔的密度接種于96 孔板中. 將10 μL 20 μg/mL 的CpG 和12.5/15/20 μL 2 mg/mL 的PLGA@Cur NPs 加入至96 孔板中. 在37 ℃、 含5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育24 h后， 用TNF-αELISA試劑盒評估培養(yǎng)基中TNF-α的含量.

2 結(jié)果與討論

2.1 PLGA@Cur NPs的制備

以PLGA 和Cur 的二氯甲烷溶液為油相， PVA 水溶液為水相， 通過雙乳液溶劑揮發(fā)法制備了PLGA@Cur NPs［19～21］（Scheme 1）. 通過控制Cur與PLGA的質(zhì)量比分別為1∶25， 1∶10， 1∶5， 3∶10和2∶5，得到PLGA@Cur 1～PLGA@Cur 5， 其中PLGA的質(zhì)量是固定的， 改變Cur的質(zhì)量. 通過SEM觀察了所制備的納米顆粒（圖1）， 其形態(tài)呈均一的球形， 表面光滑， 粒徑大小一致. 經(jīng)動態(tài)光散射粒度儀（DLS）測定了載藥納米顆粒的Zeta電位、 粒徑和PDI， 結(jié)果列于表1. 與PLGA納米顆粒相比， PLGA@Cur NPs負(fù)電性增加； PLGA@Cur NPs保留了PLGA納米顆粒的尺寸， 其水動力學(xué)尺寸約為300 nm， 與SEM結(jié)果相符； PLGA@Cur NPs的PDI＜0.3， 具有良好的單分散性.

Scheme 1 Schematic for the preparation of PLGA@Cur NPs

Fig.1 SEM images of PLGA(A) and PLGA@Cur1—PLGA@Cur-5(B—F) nanoparticles

Table 1 Characteristics of different nanoparticles

2.2 包封率和載藥率

通過HPLC方法［22，23］測定了所制備的系列載藥納米顆粒的Cur負(fù)載率. 由表2可見， 隨著Cur含量的增加， PLGA@Cur NPs 中Cur 的DLE 增加， DLC 先增加后減少. 當(dāng)Cur 與PLGA 的質(zhì)量比為1∶5 時（PLGA@Cur 3）， 納米顆粒的載藥率高于其它體系. 當(dāng)加入的Cur過多時， 藥物無法被載體包埋， 容易造成藥物的損失， 使載藥率下降. 當(dāng)Cur與PLGA的質(zhì)量比為2∶5時， 在SEM圖像中觀察到有姜黃素顆粒的出現(xiàn)， 此時載體的負(fù)載能力達到上限， 繼續(xù)增加藥物與載體的投料比也無法得到更高載藥量的納米顆粒. 基于藥物的包封率和載藥率的測定結(jié)果， 優(yōu)選PLGA@Cur 3（Cur與PLGA的質(zhì)量比為1∶5， 包封率為15.09%， 載藥率為34.85%）用于后續(xù)的實驗.

Table 2 DLE and DLC of PLGA@Cur 1—PLGA@Cur 5 nanoparticles

2.3 PLGA@Cur NPs的穩(wěn)定性

納米顆粒的穩(wěn)定性對于藥物的儲存和運輸至關(guān)重要， 通過測定納米顆粒在PBS中的粒徑變化考察了所制備PLGA@Cur NPs 的穩(wěn)定性. 由圖2 可見， 所制備的PLGA@Cur NPs 呈淡黃色， 均勻分散在水中. 室溫下放置7 d后， PLGA@Cur NPs溶液未發(fā)生明顯變化， 而經(jīng)過超聲分散的Cur在靜置1 h后就出現(xiàn)了聚集， 并且下沉到樣品瓶底部. DLS結(jié)果（圖3）也證實PLGA@Cur NPs保留了PLGA納米顆粒的穩(wěn)定性， 粒徑在7 d內(nèi)沒有顯著變化.

Fig.2 Appearance of Cur and PLGA@Cur NPs solutions placed at different time points at room temperature

Fig.3 Hydrodynamic size of PLGA, Cur and PLGA@Cur NPs to explore the stability

2.4 PLGA@Cur NPs的抗氧化性

首先， 利用H2O2和Cu2+之間的芬頓作用產(chǎn)生了·OH［24，25］， 當(dāng)·OH 存在時可氧化·OH 的檢測探針TMB生成在652 nm處有吸收峰的oxTMB（圖4）. 當(dāng)H2O（2H）， TMB（T）和Cu2+同時存在時， 652 nm處出現(xiàn)了明顯的吸收峰. 加入PLGA@Cur NPs 后吸收峰消失， 而Cur的存在并未減少溶液中的·OH. 此外，利用黃嘌呤與黃嘌呤氧化酶的氧化作用產(chǎn)生， 通過測量檢測探針二氫乙錠氧化產(chǎn)物氫乙錠的熒光強度［26，27］測定了PLGA@Cur NPs 對于O·2-的清除效率（圖5）. 將對照組（加入等體積的PBS）的熒光強度值定義為含量100%. 隨著PLGA@Cur NPs 和Cur 濃度的增加， 溶液中的O·2-含量減少. 當(dāng)PLGA@Cur NPs 濃度為200 μg/mL 時， 可以去除超過70%的， 且其清除效率強于Cur. 我們推測PLGA@Cur NPs清除·OH和的效率強于Cur的原因在于， PLGA@Cur NPs的分散性較好， 可更充分地發(fā)揮其抗氧化性， 清除溶液中的活性氧.

Fig.4 ·OH scavenging capability after different treatments

Fig.5 O·2- scavenging capability after different treatments

2.5 PLGA@Cur NPs的生物相容性

為了在細(xì)胞水平驗證PLGA@Cur NPs 的性能， 首先通過CCK-8 檢測了PLGA@Cur NPs 對RAW 264.7 巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒性. 測試結(jié)果顯示（圖6）， 當(dāng)濃度高達200 μg/mL 時， PLGA， Cur 和PLGA@Cur NPs 均不會對細(xì)胞的增殖產(chǎn)生影響. 此外， 還測試了PLGA@Cur NPs 的溶血性能（圖7）. 與陽性對照組相比， PLGA@Cur NPs并未出現(xiàn)溶血現(xiàn)象， 表明其具有良好的細(xì)胞相容性.

Fig.7 Hemolysis analysis of red blood cells(RBCs)

2.6 PLGA@Cur NPs在細(xì)胞水平的抗氧化性能和抗炎性能

驗證了材料的細(xì)胞毒性后， 使用TBHP 預(yù)處理RAW 264.7 細(xì)胞， 誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生ROS［28］， 然后用PLGA@Cur NPs 處理， 以2'，7'-二氯二氫熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）為探針評估細(xì)胞內(nèi)ROS 水平. 在TBHP的刺激下， 細(xì)胞中觀察到亮綠色的熒光， 表明ROS的產(chǎn)生（圖8）. 相反， PLGA@Cur NPs處理導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)熒光強度明顯下降， 而Cur 處理后細(xì)胞內(nèi)熒光強度下降不明顯. 為驗證PLGA@Cur NPs 的抗炎性能， 使用免疫刺激劑CpG刺激RAW 264.7（圖9）. PLGA@Cur NPs 保留了Cur的抗炎性能， 使細(xì)胞中的炎癥因子TNF-α恢復(fù)正常. 這些結(jié)果表明， PLGA@Cur NPs可在體外清除細(xì)胞內(nèi)ROS， 緩解細(xì)胞水平的炎癥.

Fig.8 Intracellular ROS imaging of macrophages after different treatments

Fig.9 TNF-α cytokine generated by macrophages after different treatments for 24 h

3 結(jié) 論

通過雙乳液溶劑揮發(fā)法成功制備了包載Cur的PLGA納米顆粒PLGA@Cur NPs. 經(jīng)測定， 所生成的PLGA@Cur3水動力學(xué)尺寸為340 nm， 包封率為15.09%， 載藥率為34.85%. 該納米顆粒具有良好的分散性和穩(wěn)定性， 在水溶液中可穩(wěn)定存在7 d. 此外， PLGA@Cur NPs還可以有效清除·OH和O·2-兩種活性氧， 且清除效果強于Cur. PLGA@Cur NPs 具有良好的生物相容性， 能有效清除細(xì)胞內(nèi)ROS， 具有良好的抗炎性能， 可緩解細(xì)胞水平的炎癥. 可見， PLGA@Cur NPs 是一種具有優(yōu)異抗氧化性和抗炎性能的藥物遞送系統(tǒng)， 其作為一種生物安全性材料有望應(yīng)用于炎癥疾病的治療.