丁小潔,劉嘉荔,楊靜文,胡雪芹,張洪斌

(合肥工業(yè)大學 食品與生物工程學院,安徽 合肥,230009)

手性化合物特別是非天然氨基酸及其衍生物是現(xiàn)代藥物、化學品和農(nóng)藥等的重要中間產(chǎn)物[1],現(xiàn)階段手性化合物通?？梢酝ㄟ^化學法、生物催化法合成[2-3]。但近些年來隨著藥物分子結(jié)構(gòu)的日益復雜,化學法合成手性藥物越來越復雜[4],生物催化法具有高效一步合成多個手性位點、綠色安全的特點而被廣泛關注[5]。轉(zhuǎn)氨酶(transaminase, TA)由于其已經(jīng)成功高效合成手性胺,且其有著嚴格的立體選擇性、高效一步合成、環(huán)境友好、不需要輔因子再生等優(yōu)點而被廣泛關注[6]。轉(zhuǎn)氨酶是磷酸吡哆醛(pyridoxal phosphate, PLP)作為輔酶,通過將氨基轉(zhuǎn)移至特定的受體來獲得高對映體產(chǎn)物的一類酶[7],轉(zhuǎn)氨酶現(xiàn)已經(jīng)廣泛應用于多種手性化合物的生產(chǎn)[8]。L-天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶作為最先研究的一類轉(zhuǎn)氨酶,其可以在氨基酸和酮酸之間發(fā)生轉(zhuǎn)氨反應,從而生成酮酸對應的手性氨基酸[9-10],且其催化反應徹底、催化產(chǎn)物手性單一有著很高的實用價值[6]。

在自然界中,氨基酸轉(zhuǎn)氨酶和脫羧酶都屬于PLP依賴性的酶,研究證明天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶和脫羧酶都屬于同一種折疊方式,且都只在PLP輔因子與活性位點共價結(jié)合時才具有活性[6],PLP和酶形成的復合物在酶催化反應過程中都起著至關重要的作用[11]。對于L-天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶催化的轉(zhuǎn)氨反應來說,是典型的乒乓機制動力學機制,即酶和底物無需形成三元絡合物,而是氨基供體通過將氨基轉(zhuǎn)移至PLP和酶復合物上生成酮酸副產(chǎn)物,離開催化中心;剩下的磷酸吡哆胺(pyridoxamine phosphate,PMP)以及被修飾的酶緊接著和氨基受體結(jié)合,接受氨基供體留下的氨基生成轉(zhuǎn)氨產(chǎn)物,同時PMP以及被修飾的酶回到原始形態(tài),繼續(xù)下一輪的催化反應[6]。同時脫羧酶也是一種PLP依賴性酶,不同的是脫羧酶將脫羧底物中的靠近官能團的羧基非氧化型脫羧,形成中間體的同時釋放CO2,接著發(fā)生質(zhì)子化等反應,脫羧產(chǎn)物釋放的同時,內(nèi)部的PLP和酶的復合物重新被建立[12]。該酶催化的2種反應有著諸多相似的地方,例如PLP在催化過程中的重要作用,推測該酶兩種催化活性共用一個結(jié)合PLP的活性中心,具體的底物結(jié)合中心有所不同,導致其具有不同的催化活性[13]。

雙功能酶是指酶蛋白一條肽鏈上同時具有兩種不同的催化活性,來催化2種不同反應[14]的一類酶。雙功能酶不同于由多個不同的單功能酶組成的酶系,由于其不同結(jié)構(gòu)間的靈活轉(zhuǎn)化機制使之有著比傳統(tǒng)的多酶反應體系有著更高的反應速率。L-天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶作為一種雙功能酶不僅具有氨基酸和酮酸之間的轉(zhuǎn)氨能力[15],同時也具有對二羧酸底物的非氧化脫羧能力,是一種研究較少的雙功能酶,對其進行系統(tǒng)研究顯得格外重要[16]。

本研究將L-天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因克隆表達,并培養(yǎng)純化出該酶,通過對該酶催化反應進行功能鑒定,結(jié)果表明該酶是一種具有催化氨基酸轉(zhuǎn)氨和二羧酸底物的非氧化脫羧兩種催化能力的雙功能酶,對酶催化機理進行了探討,并對該酶催化的2種反應進行研究,探究其具體反應方向,旨在為后續(xù)的研究和開發(fā)奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料和儀器

菌株細胞:克隆感受態(tài)菌株E.coliDH5α以及表達宿主菌株E.coliBL21(DE3),南京擎科生物有限公司;野生大腸桿菌菌株(菌株編號Bio-67405)以及表達載體pET-28a空載菌株均由本課題組保藏。

試劑及耗材:全基因組質(zhì)粒提取試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、PCR試劑盒、無縫克隆試劑盒,北京全式金生物有限公司;內(nèi)切酶BamH I、XhoI、DNA Marker、DNA Ladder、蛋白Marker、蛋白Ladder,南京擎科生物有限公司;谷氨酸、苯甲酰甲酸、酮戊二酸、PLP,阿拉丁試劑。H2SO4、高氯酸、各類無機鹽,國藥集團。如果沒有特殊說明,以上試劑均為化學純。

LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基(g/L):胰蛋白胨10,酵母提取物5,NaCl 10。

儀器:ETC821型PCR儀,東勝興業(yè)科學儀器;Tanon 1600凝膠成像系統(tǒng),上海天能科技;1350L高壓蒸汽滅菌鍋,上海博訊醫(yī)療公司;D-37520高速冷凍離心機,美國Beckman公司;SCIENT2-IID細胞超聲破碎儀,寧波新芝生物技術有限公司;Model 201型Lab Alliance高效液相色譜系統(tǒng),美國科學儀器公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 重組L-天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶質(zhì)粒的構(gòu)建

根據(jù)NCBI中大腸桿菌來源的天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因序列(CP026935.2),結(jié)合pET-28a的基因序列設計出帶有BamH I、XhoI 兩個酶切位點的如表1所示的2組引物。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

以大腸桿菌的基因組質(zhì)粒為模板,AspAT-F/AspAT-R為引物,進行PCR擴增,得到L-天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因片段。同樣以pET-28a空載質(zhì)粒為模板,Vector-R/Vector-F為引物,進行PCR擴增,得到和已獲得的基因片段有同源臂的pET-28a線性載體質(zhì)粒。將純化后的擴增產(chǎn)物使用無縫克隆試劑盒進行連接。

熱激法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α克隆感受態(tài)細胞中,涂至含卡那霉素(50 mg/L)的固體LB平板上,37 ℃過夜培養(yǎng)并挑取單菌落。對單菌落進行酶切及測序驗證重組質(zhì)粒正確構(gòu)建。驗證成功的菌株質(zhì)粒將轉(zhuǎn)至BL21(DE3)表達感受態(tài)中,構(gòu)建pET-28a(+)/L-AspAT菌株。

1.2.2 重組L-天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶的誘導表達

將構(gòu)建成功的產(chǎn)L-天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶菌株在LB培養(yǎng)基37 ℃,220 r/min過夜培養(yǎng)。按照接種量2%(體積分數(shù))將過夜菌液轉(zhuǎn)接至LB培養(yǎng)基中37 ℃,220 r/min培養(yǎng)6～8 h至其OD600為1.8～2.0時,添加異丙基β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactoside, IPTG)至終濃度為0.25 mmol/L,25 ℃,220 r/min培養(yǎng)6 h。

4 ℃低溫離心收集菌體沉淀,并重溶于Tris-HCl(0.1 mol/L pH 8)的緩沖液中,冰浴超聲破碎,離心收集上清液,即為粗酶液。

1.2.3 重組L-天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶的純化

使用親和層析(Proteinlso Ni-NTA Resin)對L-天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶蛋白進行純化。粗酶液經(jīng)0.22 μm的微孔濾頭過濾,上樣于NI-NTA重力預裝柱上。首先使用10倍柱體積的平衡緩沖液(300 mmol/L NaCl,50 mmol/L NaH2PO4,10 mmol/L咪唑,10 mmol/L Tris調(diào)pH 8.0)進行平衡,再分別依次使用含40～300 mmol/L咪唑的洗脫液進行洗脫,最后使用10 kDa的超濾管進行濃縮脫鹽。SDS-PAGE蛋白電泳進行分析純化結(jié)果,使用Bradford法,牛血清白蛋白作為標準曲線測定蛋白濃度,純化后的蛋白進行酶學性質(zhì)等后續(xù)實驗。

1.2.4 重組L-天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶酶活力測定

轉(zhuǎn)氨酶活力測定:谷氨酸40 mmol/L,苯甲酰甲酸20 mmol/L,PLP 5 mmol/L溶解于5 mL的pH 8的Tris-HCl緩沖液中,加入蛋白質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的純酶液500 μL,35 ℃反應1 h,煮沸停止反應,檢測反應液中苯甲酰甲酸的減少量。

一個酶活力單位(U)定義為:每小時催化消耗1 μmol苯甲酰甲酸所需的酶量。

脫羧酶活力測定:20 mmol/L酮戊二酸溶解于5 mL的pH 8的Tris-HCl緩沖液中,加入蛋白質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的純酶液500 μL,35 ℃反應1 h,煮沸停止反應,檢測反應液中酮戊二酸的減少量。

一個酶活力單位(U)定義為:每小時催化消耗1 μmol酮戊二酸所需的酶量。

苯甲酰甲酸、苯甘氨酸、酮戊二酸均使用高效液相色譜檢測,苯甲酰甲酸、酮戊二酸高效液相色譜檢測條件為:色譜柱為Bio-RAD生產(chǎn)的Organic Acid Analysis Column(300 mm×7.8 mm),流動相為5 mmol/L H2SO4水溶液,在214 nm下檢測,流速為0.6 mL/min,上樣量20 μL,柱溫25 ℃。苯甘氨酸液相檢測條件:色譜柱為Daicel corporation生產(chǎn)的Crownpak CR-I(+)(150 mm×3.9 mm),流動相為V(高氯酸水溶液)∶V(乙腈)=80∶20,200 nm下檢測,流速0.35 mL/min,上樣量2 μL,柱溫25 ℃。

質(zhì)譜檢測條件:美國Waters公司,ACQUITY UPLC LCT Premier XE儀器。

1.2.5 重組L-天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶兩種反應的表征

轉(zhuǎn)氨反應:分別取谷氨酸、苯甲酰甲酸,PLP溶解于pH 8的Tris-HCl緩沖液中,使其終濃度為40、20和5 mmol/L,加入酶液,35 ℃反應,滅活利用高效液相色譜檢測,觀察反應前后反應液中苯甲酰甲酸以及產(chǎn)物苯甘氨酸濃度的變化。

脫羧反應:取酮戊二酸溶解于 pH 8的Tris-HCl緩沖液中使其終濃度為20 mmol/L,加入酶液,35 ℃反應,煮沸停止反應,高效液相色譜檢測,觀察反應前后反應液中酮戊二酸濃度的變化以及反應后反應液的質(zhì)譜檢測。

1.2.6 反應過程中轉(zhuǎn)氨和脫羧反應關系

分別取谷氨酸、苯甲酰甲酸、PLP濃度溶解于 pH 8的Tris-HCl緩沖液中,使其終濃度為20 mmol/L、20 mmol/L、5 mmol/L,加入酶液,每隔1 h取樣,煮沸檢測反應液中的苯甲酰甲酸、酮戊二酸、苯甘氨酸、1,4-丁二酸濃度變化,并計算酮戊二酸以及苯甲酰甲酸轉(zhuǎn)化率。

1.2.7L-天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶的分子對接

L-天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶的蛋白結(jié)構(gòu)來自PDB(編號1AHG),對接所用酮戊二酸(SID:404770395)與L-苯甘氨酸(SID:198962634)的分子結(jié)構(gòu)均來自NCBI,分子對接由Discovery Studio Client完成,所有繪圖分析由PyMOL完成。

1.2.8 重組L-天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶酶學性質(zhì)測定

1.2.8.1 溫度、pH對重組酶酶活力的影響

最適溫度:在pH為8.0的Tris-HCl緩沖液中,分別在25、30、35、37、40 ℃下,測定L-天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶的轉(zhuǎn)氨和脫羧酶活力,以最高酶活力為100%,計算相對酶活力。

最適pH:在pH 7、8、9、10的Tris-HCl緩沖液以及pH 5、6、7、8、9下的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液中,分別測定L-天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶的轉(zhuǎn)氨和脫羧酶活力,以最高酶活力為100%,計算相對酶活力。

1.2.8.2 金屬離子對重組L-天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶活性影響

分別在反應液中加入終濃度為5 mmol/L MnCl2、MgCl2、NiCl2、Al2SO4、KCl、FeCl3、ZnCl2、NaCl、BaCl2、CaCl2、CuSO4、EDTA,觀察金屬離子對酶活力的影響,以不加離子的反應液的酶活力定義為100%,計算相對酶活力。

1.2.8.3 重組L-天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶的酶動力學參數(shù)

轉(zhuǎn)氨反應的酶動力參數(shù):苯甲酰甲酸20 mmol/L,PLP 5 mmol/L。谷氨酸分別以10～160 mmol/L溶解于5 mL的pH 8的Tris-HCl緩沖液中,加入500 μL的0.1 mg/mL的純酶液。35 ℃純酶催化反應10 min,高效液相色譜檢測不同反應組中苯甲酰甲酸的減少量從而計算酶動力學參數(shù)。

脫羧反應的酶動力學參數(shù):PLP 5 mmol/L以及酮戊二酸分別以10～160 mmol/L溶解于5 mL的pH 8的Tris-HCl緩沖液中,加入500 μL的0.1 mg/mL的純酶液。35 ℃,純酶催化反應10 min,高效液相色譜檢測不同反應液中酮戊二酸的減少量從而計算酶動力學參數(shù)。

2 結(jié)果和分析

2.1 重組酶蛋白表達及其純化結(jié)果

通過前期的基因克隆,對其質(zhì)粒進行雙酶切驗證、菌落PCR鑒定、測序等操作,認為pET-28a/L-AspAT重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、產(chǎn)酶,并對粗酶液進行蛋白純化操作。SDS-PAGE結(jié)果圖如增強出版附件圖1所示,L-AspAT的預測蛋白大小為43.5 kDa,對比Marker可知,蛋白表達正確,且純化效果較好,收集洗脫液,進行超濾脫鹽濃縮,得到的純化酶做接下來的酶催化反應。

2.2 重組酶催化功能鑒定

對L-AspAT催化的轉(zhuǎn)氨脫羧反應進行功能鑒定,并分析底物的減少以及不同反應的產(chǎn)物生成情況。圖1-a為苯甲酰甲酸標品的HPLC圖,其特征峰出峰時間為9.1 min,圖1-b為D型、L型苯甘氨酸標品的HPLC圖,3.5 min為D-苯甘氨酸的特征峰,13.1 min為L-苯甘氨酸特征峰。圖1-c和圖1-d為轉(zhuǎn)氨反應前后反應液的HPLC對比圖,從圖中可以看到,反應前后苯甲酰甲酸的峰面積減少,反應生成L-苯甘氨酸,同時在3.5 min并沒有D-苯甘氨酸的特征峰的產(chǎn)生,計算其ee值>98%,說明該酶催化轉(zhuǎn)氨反應的產(chǎn)物手性單一。

由圖2可知,圖2-a為酮戊二酸的標品,酮戊二酸在8.5 min左右有特征峰,結(jié)合脫羧反應前后的反應液的HPLC對比圖中(圖2-b及圖2-c)。當L-AspAT單獨催化酮戊二酸反應時,酮戊二酸有消耗的現(xiàn)象,通過檢測反應體系中生成的CO2以及特異性的還原端反應。脫羧反應后反應液的質(zhì)譜圖見增強出版附件圖2,在質(zhì)譜圖中可以看到117.01和101.02的特征峰,分別對應著1,4-丁二酸和4-氧代丁酸。結(jié)合液相和質(zhì)譜圖得到酮戊二酸在酶的催化作用下,發(fā)生了非氧化脫羧。生成了4-氧代丁酸,4-氧代丁酸不穩(wěn)定進而生成1,4-丁二酸,由于CO2在反應體系中不能積累的緣故,脫羧反應一般進行的比較徹底。

a-酮戊二酸標品;b-脫羧反應前;c-脫羧反應后

通過對該酶催化反應進行功能鑒定,實驗結(jié)果表明該酶是一種具有催化氨基酸轉(zhuǎn)氨和二羧酸底物的非氧化脫羧2種催化能力的雙功能酶。

2.3 反應過程底物產(chǎn)物隨時間變化

檢測反應液中不同成分在不同時間的濃度以及轉(zhuǎn)化率,結(jié)果如圖3所示。從圖3-a可以看出在反應前期即反應0～5 h,苯甲酰甲酸和酮戊二酸的轉(zhuǎn)化率基本持平,即反應前期以轉(zhuǎn)氨反應為主,酮戊二酸在反應液中并沒有積累較多,其濃度不高,體系中基本上不進行脫羧反應,反應體系中酮戊二酸的濃度增高。

a-L-AspAT催化反應轉(zhuǎn)化率;b-L-AspAT催化反應成分濃度

隨著反應進行,在反應進程中期時(即反應5～11 h時),酮戊二酸的增加量和苯甲酰甲酸的減少量開始不對等。推測隨著酮戊二酸濃度進一步增高,脫羧反應開始進行,但此時轉(zhuǎn)氨反應生成酮戊二酸的速率大于脫羧反應消耗酮戊二酸的速率,所以反應體系中酮戊二酸的濃度進一步增加,同時可以發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)氨反應速率相對于反應初期來說有所增加。

在反應后期,酮戊二酸的量基本達到最高值后,脫羧反應速率進一步增加,轉(zhuǎn)氨反應生成的酮戊二酸開始小于脫羧反應消耗的量,反應體系中酮戊二酸的濃度減少。隨著脫羧反應速率增高,反應體系中的轉(zhuǎn)氨反應速率進一步增加。

進一步檢測催化體系中不同物質(zhì)的濃度隨時間變化如圖3-b所示,可以看到,隨著時間的增加苯甲酰甲酸的量是持續(xù)下降的,同時作為轉(zhuǎn)氨反應的產(chǎn)物L-苯甘氨酸和酮戊二酸在反應前期均有一定程度的濃度上升,但隨著脫羧反應的進行,酮戊二酸的濃度開始下降,同時由于L-苯甘氨酸不進行脫羧反應其濃度一直隨著反應的進行而上升。在脫羧反應開始的同時,開始檢測到1,4-丁二酸的生成,使整個催化反應快速且使轉(zhuǎn)氨反應催化完全,目標產(chǎn)物L-苯甘氨酸的產(chǎn)量達到預期。

酮戊二酸作為轉(zhuǎn)氨反應的產(chǎn)物,被非氧化脫羧反應消耗后,能進一步促進轉(zhuǎn)氨反應的進行,轉(zhuǎn)氨反應速率的增加導致酮戊二酸生成更加迅速。反應中后期轉(zhuǎn)氨和脫羧反應的相互促進作用,不僅解除了轉(zhuǎn)氨反應的產(chǎn)物抑制作用,使其生成更多的所需非天然氨基酸L-苯甘氨酸,而且使轉(zhuǎn)氨和脫羧反應速率大大增加。

2.4 雙功能酶的反應機制探討

結(jié)合實驗現(xiàn)象和L-天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶催化原理以及LI等[17]關于PLP依賴型酶的綜述報道中對轉(zhuǎn)氨和脫羧的闡述,認為在底物為L-谷氨酸和苯甲酰甲酸的反應體系中,發(fā)生了圖4所示的反應,首先在反應前期,發(fā)生的轉(zhuǎn)氨反應,生成了轉(zhuǎn)氨反應產(chǎn)物L-苯甘氨酸和酮戊二酸,隨著產(chǎn)物酮戊二酸的積累,體系中開始發(fā)生脫羧反應,生成4-氧代丁酸進而生成1,4-丁二酸,同時產(chǎn)生副產(chǎn)物CO2。L-天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶催化的脫羧反應在一定程度上消耗了轉(zhuǎn)氨反應的產(chǎn)物,降低了轉(zhuǎn)氨反應的產(chǎn)物抑制程度,促進轉(zhuǎn)氨反應的進行,這有可能是雙功能酶在進化過程中發(fā)生了基因融合從而導致該酶有利于反應進行的生物學特性。

利用DS對L-天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶和小分子進行剛性對接,對接結(jié)果如圖5所示。可以明顯地看到對于L-天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶來說,轉(zhuǎn)氨和脫羧不同反應底物結(jié)合位點是不同的,2個反應有不同的催化中心。在整個反應體系中,轉(zhuǎn)氨反應生成的酮戊二酸可能經(jīng)過蛋白內(nèi)部通道到達脫羧反應的催化中心,使該反應能夠更好更徹底的進行。

圖5 分子對接結(jié)果圖Fig.5 Molecular docking result diagram

對蛋白和小分子相互作用進行進一步的模擬分析,如增強出版附件圖3所示,苯甲酰甲酸分別和L-天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶的128位脯氨酸,133位組氨酸,146位谷氨酸形成了氫鍵。同樣的是,如增強出版附件圖4所示,酮戊二酸分別和L-天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶蛋白的37位色氨酸,33位亮氨酸,30位天冬酰胺分別形成了氫鍵?？梢缘玫奖郊柞＜姿岷屯於嵩诿副砻娴牟煌恢眠M行結(jié)合,不同的催化中心催化2種反應,2種反應獨立又相互促進,符合雙功能酶的催化現(xiàn)象。

2.5 重組酶酶學性質(zhì)

2.5.1 溫度、pH對酶活力的影響

不同溫度下測量L-天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶的催化轉(zhuǎn)氨脫羧活性,結(jié)果如圖6所示,轉(zhuǎn)氨反應的最適溫度為35 ℃,同時脫羧反應的最適溫度為37 ℃,2種反應的最適溫度有所不同,但相差不多。對比不同來源的L-天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶的最適溫度基本和該酶相似,但來源于嗜熱菌ThermusthermophilusHB8的酶最適溫度為75 ℃,其較強的溫度耐受性可能和其來源有關[10]。

圖6 溫度對酶活力的影響Fig.6 Effects of temperature on the enzyme activity

在不同pH下測量L-天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶的催化轉(zhuǎn)氨脫羧活性,結(jié)果如圖7所示,在不同的緩沖體系中,當反應體系中pH為8時,轉(zhuǎn)氨和脫羧2種反應的相對酶活力都為最高,可以得到該酶2種酶活力的最適pH相同都為8。偏酸和偏堿情況下酶活力都有所損失,偏酸情況下?lián)p失的更加明顯。對比不同來源的L-天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶的最適pH基本相似都為8左右[10],這可能和轉(zhuǎn)氨反應所需的堿性環(huán)境有關。

圖7 pH對酶活力的影響Fig.7 Effects of pH on the enzyme activity

2.5.2 金屬離子對酶活力的影響

由圖8可知,不同離子對轉(zhuǎn)氨和脫羧反應的影響不同,對于轉(zhuǎn)氨反應來說,EDTA、Mg2+、Cu2+能顯著增加轉(zhuǎn)氨酶活力,而Na+、Ba2+存在的情況下,轉(zhuǎn)氨酶活力損失較為嚴重,其他離子存在的情況下,對轉(zhuǎn)氨酶活力沒有顯著影響。對于脫羧反應來說,EDTA、Ni+能顯著增加脫羧酶活力,而Al3+、K+、Ba2+、Cu2+存在的情況下,脫羧酶活力損失較為嚴重,其他離子存在的情況下,對脫羧酶活力沒有顯著影響。

圖8 金屬離子對酶活力的影響Fig.8 Effect of metal ion on the enzyme activity

同時Mg2+、Cu2+對轉(zhuǎn)氨反應酶活力有促進作用,同時對脫羧反應酶活力沒有影響甚至降低了脫羧反應的酶活力。Ni+對脫羧反應酶活力有著促進作用,同時對轉(zhuǎn)氨反應酶活力沒有太大影響,可能是和2種活力催化活性中心不同,導致不同的離子對脫羧和轉(zhuǎn)氨反應酶活力的影響不同。

2.5.3 酶動力參數(shù)

對L-天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶催化的2種反應,分別測酶動力學參數(shù),結(jié)果如表2所示,其中轉(zhuǎn)氨反應的Km值為138 mmol/L,kcat/Km值為0.015 s-1·(mmol/L)-1。脫羧反應的Km值為12.09 mmol/L,kcat/Km值為0.006 s-1·(mmol/L)-1,可以看出對于L-天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶來說,是以轉(zhuǎn)氨反應作為其主反應,脫羧反應為其副反應而進行的,對于該酶來說,轉(zhuǎn)氨反應速率是要大于脫羧反應的,轉(zhuǎn)氨反應相對而言是有較高的催化效率。

表2 轉(zhuǎn)氨脫羧反應的酶動力參數(shù)Table 2 Kinetic parameters of transammonia and decarboxylation reaction

3 結(jié)論

本文以大腸桿菌來源的L-天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因序列作為研究對象,成功克隆表達出了高產(chǎn)L-天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶的菌株,并通過親和層析得到純化酶。通過對該酶催化反應進行功能鑒定,驗證該酶是一種具有催化氨基酸轉(zhuǎn)氨和二羧酸底物的非氧化脫羧2種催化能力的雙功能酶。對該酶催化的2種反應進行了機理研究,進一步研究了L-天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶的轉(zhuǎn)氨反應和脫羧反應分別的酶學性質(zhì)得到了2種反應的最適溫度、最適pH和不同的離子對2種反應的影響,2種反應相類似的最適條件使該酶能夠更好地發(fā)生級聯(lián)反應,對該酶催化的主反應(轉(zhuǎn)氨反應)有著很好的促進作用。對反應過程中底物產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率進行檢測研究,并對該酶催化的2種不同的反應底物和酶蛋白進行分子對接操作,發(fā)現(xiàn)該酶有2個不同的結(jié)構(gòu)域來催化不同的反應,并得到了2種酶催化反應之間的關系,進一步驗證了該雙功能酶具體的催化進程,為后續(xù)研究提供了理論基礎。

L-天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶有著轉(zhuǎn)氨能力,同時也有著對二羧酸底物的非氧化脫羧作用。通過對反應進行研究認為轉(zhuǎn)氨反應是該酶催化的主要反應。同時對于雙功能酶來說,轉(zhuǎn)氨反應的產(chǎn)物酮戊二酸是脫羧反應的底物,酮戊二酸可能不需要通過溶液進入脫羧反應的催化中心,而是通過酶蛋白內(nèi)部之間進入催化中心。從而該雙功能酶比多個單功能酶組成的酶系更加快速有效,同時轉(zhuǎn)氨反應的速率也影響著脫羧反應[10]的進行,脫羧反應的進行也使轉(zhuǎn)氨反應解除產(chǎn)物抑制,打破反應平衡更加有利于整體反應的進行。對轉(zhuǎn)氨酶和脫羧酶的反應機理相關的驗證討論,認為該酶催化的2種反應都為PLP依賴型的酶,同時脫羧反應有利于轉(zhuǎn)氨反應的正向進行,可能在生物進化的過程中發(fā)生了2種酶的融合導致了該酶具有的雙功酶催化特性[18-19],利用Discovery Studio Client,結(jié)合生物信息學工具發(fā)現(xiàn)對于L-AspAT來說,其結(jié)合轉(zhuǎn)氨和脫羧反應底物的催化中心位于酶的不同位置,該雙功能酶催化2種反應時相互獨立,但同時其獨特的PLP依賴型的結(jié)構(gòu)也促使在反應液中同時有2種反應時,兩者相互促進,互相影響。

后續(xù)可以利用分子生物學以及生物信息學作為工具,對基因序列以及結(jié)構(gòu)進行研究,深入探討具體的協(xié)同機制,以及轉(zhuǎn)氨反應和脫羧反應催化中心的關系以及二羧酸底物可能的底物通道,更加深入了解該酶。