俞卓杭,唐鑫,張秋香,崔樹茂,毛丙永

(江南大學(xué) 食品學(xué)院,江蘇 無錫,214122)

胃動力障礙是由胃肌肉收縮的頻率、力量過低或過高、胃分泌功能紊亂引起的胃調(diào)節(jié)、胃排空異常[1-2],是引起功能性消化不良和胃輕癱的主要原因之一[3-4]。環(huán)境、遺傳、飲食、情緒都有可能導(dǎo)致胃動力障礙[5],促動力劑是目前一線的胃動力障礙治療藥物[6]。然而這些藥物有一定副作用,在許多地區(qū)、國家禁售[7-8]。在臨床治療當(dāng)中也常采用調(diào)整患者飲食結(jié)構(gòu)或使用消化酶膳食補充劑等非藥物治療方法[9-10],但只有當(dāng)患者的癥狀頻次滿足了相應(yīng)的診斷標(biāo)準(zhǔn)才會被納入相應(yīng)治療體系,這忽略了許多癥狀較為輕微但依然為此所擾的人群[11]。因此,基于實際的人群需求找到效果較好、安全無毒且起效機制較為明確的促胃動力藥替代品不可或缺。

我國許多消食導(dǎo)滯的藥食同源食物具有促消化、促胃動力的作用,如陳皮、山楂、雞內(nèi)金等。山楂具有促消化液分泌、促胃排空等作用調(diào)節(jié)胃腸運動[12-13];陳皮水提物具有促進(jìn)離體胃體平滑肌收縮的作用[14],其成分橘皮素等具有促胃液、胃蛋白酶排出的作用[15];雞內(nèi)金具有促進(jìn)功能性消化不良大鼠胃排空、提高胃泌素(gastrin,GAS)和胃動素(motilin,MTL)表達(dá)的作用,并能提高小鼠胃游離酸、總酸度和胃蛋白酶活力[16]。但這些食物的研究主要針對整體消化作用,對胃動力的影響尚不完全清楚。另外,通過調(diào)研發(fā)現(xiàn)菊苣可能具有促進(jìn)食欲、增加胃液分泌的功能[17],余甘子水提物具有改善胃腸激素的作用[18]。盡管這兩者極具潛力,卻幾乎未被傳統(tǒng)藥方用于配伍促胃動力配方。

綜上,5種食物皆有改善胃動力的作用,但發(fā)揮作用的機制可能不同。然而,目前沒有相關(guān)研究甄別其促胃動力機制和作用靶點的重疊性,也沒有統(tǒng)一模型下的效果比較。目前,以這些食品為原料開發(fā)的產(chǎn)品較多,包括各類山楂、陳皮、余甘子飲品,雞內(nèi)金和菊苣軟糖,以及近年來深受追捧的曬干藥食同源食物復(fù)配后的茶包、粉包等。但這些市售產(chǎn)品宣稱的功效往往缺乏依據(jù),大多只是簡單加和,容易誤導(dǎo)消費者。因此,對這些食物的促胃動力機制和效果研究十分迫切。

本研究旨在通過左旋精氨酸(L-arginine,L-arg)造模致胃動力障礙,基于該模型驗證、篩選有效的促胃動力藥食同源食物,通過對胃排空指標(biāo)的研究評價其是否具有促胃動力作用,通過對胃液相關(guān)指標(biāo)、興奮型血清胃腸激素GAS、MTL和饑餓素(ghrelin)、胃竇HE染色切片和間質(zhì)細(xì)胞(interstitial cell of Cajal,ICC)指示基因酪氨基酶受體基因(c-kit)和干細(xì)胞因子(stem cell factor,SCF)相對表達(dá)水平來觀察起效的可能途徑,從而比較這些藥食同源食物的促胃動力效果,明確其起效機制,進(jìn)而為開發(fā)新型促胃動力膳食補充劑的原材料選用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物

雄性SPF級SD大鼠64只,10周左右,體重(400±20)g,北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。

1.1.2 試劑

山楂、陳皮、雞內(nèi)金、菊苣、余甘子,北京同仁堂大藥房;多潘立酮,西安楊森制藥有限公司生產(chǎn),市售藥店;異氟烷,深圳市瑞沃德生命科技有限公司;NaCl、左旋精氨酸鹽酸鹽、多聚甲醛,國藥集團化學(xué)試劑有限公司;大鼠胃動素、胃泌素、饑餓素酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒,上海酶聯(lián)生物技術(shù)有限公司;Trizol裂解液,逆轉(zhuǎn)錄試劑盒,南京諾唯贊生物技術(shù)公司;PCR引物,生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備

EL3002型精密電子天平,梅特勒托利多科技(中國)有限公司;TG16A臺式離心機和TGL-16M冷凍離心機,上海盧湘儀離心機儀器有限公司;5424R高速離心機,德國Eppendorf公司;Thermo-994式-80 ℃冰箱、Multiscan Go多功能酶標(biāo)儀,美國賽默飛世爾科技公司;高通量組織研磨儀,寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組、模型建立

64只大鼠飼養(yǎng)于江南大學(xué)實驗動物中心SPF級屏障中[SYXK(蘇)2021-0056],溫度為(25±2)℃,相對濕度40%～60%,嚴(yán)格遵循光照12 h/黑夜12 h循環(huán),所有動物均喂食標(biāo)準(zhǔn)飼料和無菌水,并可自由飲食。適應(yīng)1周后開始實驗。動物實驗設(shè)計方法經(jīng)江南大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)(NO20211015S0961120),符合歐盟保護動物條例(2010/63/EU)。具體動物實驗設(shè)計方案見表1。

表1 動物實驗設(shè)計方案Table 1 Animal experimental design scheme

采用腹腔注射左旋精氨法誘導(dǎo)大鼠胃動力障礙模型[19],陽性參照多潘立酮組和各實驗組的灌胃劑量根據(jù)藥典推薦范圍選取,分別為成人每天多潘立酮30 mg,菊苣9 g,陳皮3 g,雞內(nèi)金3 g,山楂10 g[17],并根據(jù)人與大鼠的體表面積進(jìn)行劑量轉(zhuǎn)換后[13]即為表1中最終灌胃劑量[20]。

1.2.2 大鼠體重、攝食量記錄

實驗期間,每日記錄飼料用量、大鼠體重和攝食量變化。

1.2.3 胃排空率測定

每組一半的大鼠用半固體營養(yǎng)米糊法[21]測定胃排空率。灌胃半固體營養(yǎng)米糊(羧甲基纖維素鈉10 g、全脂奶粉16 g、淀粉8 g、炭粉2 g、蒸餾水200 g)3 mL/kg,30 min后處死動物,結(jié)扎賁門和幽門,取完整胃,稱胃全重,將胃組織沿胃大彎剪開,沖洗凈胃內(nèi)容物后,稱量胃凈重。按公式(1)計算胃排空率:

胃排空率/%=[固體糊狀物重-(胃全重-胃凈重)/固體糊狀物重]×100

(1)

1.2.4 胃液游離酸、總酸及蛋白酶測定

每組一半大鼠在處死前4 h用異氟烷麻醉,打開腹腔,結(jié)扎幽門部,再逐層縫合關(guān)閉腹腔,處死時結(jié)扎賁門后取完整胃,沿胃大彎處剪開,收集胃內(nèi)容物,3 000 r/min離心10 min后得到澄清液,記錄胃液量。

取0.5 mL胃液加入甲基橙和酚酞試劑,用20 mmol/L NaOH溶液滴定,紅色消失、橙色開始出現(xiàn)時,消耗的NaOH溶液量為游離酸終點量,橙色消失、微紅色出現(xiàn)時,消耗的NaOH的量為總酸終點量[22]。

取0.5 mL胃液加入具塞量筒中,加入7.5 mL 0.05 mol/L HCl溶液搖勻,放入2根自制的蛋白管,塞好瓶口于37 ℃恒溫箱中孵育24 h后取出,游標(biāo)卡尺測量蛋白管兩端透明長度,胃蛋白酶活力/(U/mL)=長度平均值2×16[22]。

1.2.5 血清胃腸激素檢測

各胃腸激素(GAS、MTL、ghrelin)的表達(dá)水平,均參照對應(yīng)的ELISA試劑盒說明書進(jìn)行測定。

1.2.6 胃竇組織c-kit和SCFmRNA表達(dá)的檢測

取適量胃竇組織,加入Trizol裂解液,冰上勻漿,提取組織中總RNA;引物參考IWASAKI等[23]的實驗,按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒要求合成cDNA,混入熒光Mix后,進(jìn)行熒光定量PCR分析(表2)。

表2 PCR引物Table 2 PCR Primers

1.2.7 胃竇組織HE染色觀察

將胃竇組織在質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛固定液中固定48 h,然后脫水、石蠟包埋、切片,蘇木精-伊紅染色,數(shù)字切片掃描儀對切片進(jìn)行掃描,使用CaseViewer 2.3軟件對組織病理損傷進(jìn)行觀察。

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,使用Graphpad Prism 8.0進(jìn)行可視化繪圖,使用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析,單因素方差分析采用最小顯著差別(least significant difference,LSD)事后分析。

2 實驗結(jié)果

2.1 藥食同源食物對大鼠每日攝食量、飲水量和體重變化的影響

如圖1所示,由造模后大鼠每日攝食量、飲水量和體重變化可知,與正常組相比,模型組大鼠每日攝食量顯著下降,飲水量無顯著性差異,體重增長速度明顯下降。與模型組相比較,菊苣組和余甘子組大鼠每日攝食量顯著提高(P<0.05);各組每日飲水量無明顯差異;多潘立酮使大鼠體重增加,菊苣和余甘子能使其體重下降,但都不顯著。

a-每日攝食量;b-每日飲水量;c-體重

2.2 藥食同源食物對大鼠胃排空率的影響

胃排空率是衡量胃動力大小的直接指標(biāo),如圖2所示,與空白組比較,模型組胃排空速率顯著降低(P<0.001),該造模方法可致使大鼠胃動力障礙。與模型組比較,多潘立酮組效果最好(P<0.001),幾乎恢復(fù)到了和空白組相同的水平。在藥食同源食物組當(dāng)中,菊苣、山楂和余甘子(P<0.05)對胃排空均有顯著的提升作用,陳皮和雞內(nèi)金也具有提升趨勢,但無顯著性差異。山楂具有促胃排空作用,這與陳青蓮等[24]的實驗結(jié)果一致,余甘子能夠促進(jìn)胃排空,這與LI等[18]的報道相似,而菊苣的促胃排空作用未見相關(guān)報道。

圖2 大鼠胃排空率Fig.2 Gastric emptying rate in rats

2.3 藥食同源食物對大鼠胃液、胃酸和胃蛋白酶的影響

大鼠胃液量、胃酸濃度和排出速率、胃蛋白酶活性和排出速率如表3和表4所示。相較于空白組,模型組胃液量顯著性下降(P<0.01),游離酸濃度和總酸濃度上升但沒有顯著性差異,蛋白酶活性顯著性下降(P<0.01),游離酸排出速率顯著下降(P<0.05),蛋白酶排出速率顯著性下降(P<0.001),表明胃動力障礙大鼠總體的胃液、游離酸和胃蛋白酶排出量相較于正常鼠總體呈現(xiàn)下降趨勢。與模型組相比,菊苣使總酸濃度呈顯著降低(P<0.05);菊苣和余甘子使游離酸濃度顯著降低(P<0.05);山楂使蛋白酶活性顯著性提升(P<0.05);雞內(nèi)金組總酸排出速率和游離酸排出速率提高但無顯著性,菊苣組、余甘子組游離酸排出速率顯著下降(P<0.05);多潘立酮組、山楂組和雞內(nèi)金組蛋白酶排出速率顯著提高(P<0.05)。

表3 總酸、游離酸、蛋白酶和胃液量測定Table 3 Content of total acid, free acid, pepsin, and gastric fluid

表4 總酸、游離酸和蛋白酶的排出速率測定Table 4 Discharge rate of total acid, free acid, and protease

胃液是消化道重要的消化液,高濃度氫離子和有機酸抑制胃排空[25]。胃蛋白酶輸出和胃酸存在并行控制機制,目前的研究普遍認(rèn)為胃運動和胃酸分泌存在聯(lián)系,但機制尚不清楚。本研究中胃動力障礙大鼠胃黏膜細(xì)胞泌酸功能紊亂,胃液量和胃蛋白酶排放量下降,但胃酸濃度反而增加。菊苣、陳皮和余甘子菊苣降低胃游離酸濃度及其排出速率,山楂提高胃蛋白酶活性和排放速率,它們對胃酸和胃蛋白酶的影響趨勢并不一致,其中的原因有待研究。

2.4 藥食同源食物對大鼠血清胃腸激素的影響

大鼠血清胃腸激素含量如圖3所示。相較于空白組,模型組血清GAS含量和ghrelin含量顯著降低(P<0.05),血清MTL含量下降但無顯著性差異,胃動力障礙大鼠興奮型胃腸激素整體分泌不足。相較于模型組,多潘立酮組血清MTL含量顯著上升,菊苣、陳皮、山楂組血清MTL含量上升但無顯著性差異;余甘子組血清GAS含量顯著上升(P<0.05);多潘立酮、菊苣和山楂組血清ghrelin含量顯著上升(P<0.05),陳皮和雞內(nèi)金組也呈上升趨勢但無顯著性差異。

a-血清ghrelin含量;b-血清GAS含量;c-血清MTL含量

MTL、GAS和ghrelin同屬興奮型胃腸激素,研究表明ghrelin可能是嚙齒類動物的MTL替代物,具有促食欲、促胃排空的效果[26];GAS與胃酸分泌、黏膜生長和胃運動有關(guān)[27];十二指腸和近端空腸黏膜M細(xì)胞產(chǎn)生的MTL是最經(jīng)典的促胃動力激素[28]。余甘子能夠促進(jìn)胃泌素分泌,并可能通過該途徑促進(jìn)胃動力,這與LI等[18]的研究結(jié)果一致;山楂能夠促進(jìn)ghrelin分泌,在WANG等[29]的研究中也有類似報道;而菊苣能促進(jìn)ghrelin的分泌,則是本研究的新發(fā)現(xiàn)。

2.5 藥食同源食物對大鼠胃竇組織c-kit和SCF mRNA表達(dá)的影響

ICC是胃腸道的起搏細(xì)胞,c-kit和SCF是ICC增殖分化的關(guān)鍵基因。研究表明胃動力障礙大鼠c-kit、SCFmRNA與蛋白水平表達(dá)降低,ICC的正常功能受損[30]。胃竇組織中c-kit和SCF的表達(dá)量由表5可知,相較于空白組,模型組大鼠c-kitmRNA(P<0.01)和SCFmRNA(P<0.001)表達(dá)量顯著下降,表明胃動力障礙大鼠ICC數(shù)量可能下降,胃起搏能力下降。相較于模型組,多潘立酮組和菊苣組c-kit相對表達(dá)量顯著提高(P<0.05),其他實驗組沒有明顯變化;多潘立酮組SCF相對表達(dá)量顯著提高,菊苣組、陳皮組和山楂組SCF相對表達(dá)量提高但無顯著性。

表5 大鼠胃竇組織c-kit、SCF mRNA表達(dá)Table 5 Expression of c-kit and SCF mRNA in rat antrum

本研究結(jié)果顯示,菊苣使c-kit基因表達(dá)量上升,其他食物均無該效果,提示菊苣可能通過c-kit/SCF信號通路促進(jìn)了胃動力提升,尚未有相關(guān)報道菊苣對c-kit/SCF通路的影響。

2.6 大鼠胃竇組織HE染色結(jié)果

如空白組(圖4-a)所示,正常大鼠胃底腺層約占黏膜厚度的1/2左右,模型組大鼠(圖4-b)胃竇組織結(jié)構(gòu)全面,未見明顯損傷,但是其胃竇黏膜層腺體僅占全黏膜厚度1/4左右,表明胃動力障礙大鼠胃底腺層功能受到影響。相較于模型組胃底腺體數(shù)量,多潘立酮組(圖4-c)和菊苣組(圖4-d)的胃底腺厚度增加,其余組沒有明顯的差異。

a-空白組;b-模型組;c-多潘立酮組;d-菊苣組;e-陳皮組;f-雞內(nèi)金組;g-山楂組;h-余甘子組

胃黏膜細(xì)胞受損不僅引起泌酸功能異常,也可能引起其他的激素水平下降,影響胃動力,切片觀察發(fā)現(xiàn)胃底分泌腺層厚度減少可能是胃動力異常的原因,而菊苣和余甘子體現(xiàn)出了一定的修復(fù)胃黏膜層的作用,這也可能是菊苣促激素釋放,進(jìn)而促胃排空的機制之一。

3 結(jié)論

本文通過12 d大鼠動物實驗,測定指標(biāo)對5種藥食同源食物的促胃動力作用進(jìn)行評價和機制解析。研究發(fā)現(xiàn),菊苣、山楂和余甘子組與模型組相比能顯著提升胃排空速率(P<0.05),具有直接的促胃動力效果。陳皮和雞內(nèi)金雖具有促胃排空的趨勢,無顯著性差異,2種食物實驗組的其他幾個指標(biāo)測定結(jié)果也類似。這兩者的效果不佳可能是由于陳皮、雞內(nèi)金的起效物質(zhì)多為醇溶性的黃酮類、揮發(fā)油或本身的酶,因此直接用常溫水混懸粉末灌胃,其功效物質(zhì)難以被吸收利用所致。對影響胃動力的指標(biāo)研究發(fā)現(xiàn),相較于模型組,菊苣組顯著降低總酸濃度、游離酸濃度和游離酸排出速率(P<0.05),余甘子組顯著降低游離酸濃度和排出速率(P<0.05),山楂組顯著提高胃蛋白酶活性(P<0.05)和排出速率(P<0.01);菊苣組顯著提高血清饑餓素水平(P<0.01),山楂組也顯著提高血清ghrelin水平(P<0.05),余甘子組顯著提高血清GAS水平;菊苣組具有修復(fù)胃底腺層的作用;菊苣能顯著提高c-kitmRNA的相對表達(dá)量(P<0.05)。研究證明菊苣、山楂和余甘子具促胃動力作用,且其起效的機制和途徑并不相同,可以制成單體或配方促胃動力產(chǎn)品,大力促進(jìn)食療領(lǐng)域新產(chǎn)品的開發(fā)。菊苣、余甘子的促胃動力量效關(guān)系及其促胃動力具體成分的解析,仍需進(jìn)一步的研究。