王子洋, 熊雨潔, 馮發(fā)運(yùn), 余向陽, 朱耀華, 張雷剛

(1.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,江蘇鎮(zhèn)江 212013; 2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所,江蘇南京 210014;3.河南省漯河市源匯區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣站,河南漯河 462000)

禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)是引起小麥赤霉病(Fusariumhead blight,FHB)的主要致病菌,可在小麥多個生長時期和部位侵染致病,不但造成產(chǎn)量損失,還會在麥粒中積累多種真菌毒素,危害食品安全[1]。2000—2018年期間,我國每年有超過5.4萬km2、約占總產(chǎn)量23%的小麥?zhǔn)茉摬∮绊?。由于缺乏有效的抗病品種和生防產(chǎn)品,目前仍以化學(xué)藥劑防治為主[2]。

生防真菌因具有廣譜的生防作用、貨架期長等特性,是目前應(yīng)用較為廣泛的一類生防制劑,如酵母菌(Saccharomycesspp.)、木霉菌(Trichodermaspp.)、綠僵菌(Metarhizumspp.)等[3]。寡雄腐霉(Pythiumoligandrum)屬真菌門卵菌綱霜霉目腐霉科腐霉屬,是一種強(qiáng)攻擊性重寄生微生物,廣泛存在于植物根際與土壤中[4]。作為具有優(yōu)良拮抗效果的生防真菌,寡雄腐霉可抵抗多種病原菌對植物的侵害,包括馬鈴薯炭疽病[5]、番茄根腐病[6]、草莓根腐病[7]、辣椒炭疽病[8]、葡萄霜霉病[9]、水稻立枯病[10]等,是一種具有應(yīng)用潛力與價值的生防因子。目前,針對寡雄腐霉生防機(jī)制的研究眾多,主要發(fā)現(xiàn)其能夠:(1)通過重寄生作用直接攻擊病原菌;(2)誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性;(3)分泌抗生物質(zhì);(4)促進(jìn)植物生長,間接抵抗病原菌;(5)與病原菌競爭營養(yǎng)與空間等多種手段來抑制病原菌[11]。重寄生作用是寡雄腐霉的主要生防手段,通過直接攻擊其他病原菌、產(chǎn)生細(xì)胞壁裂解酶并分泌抗生物質(zhì)來殺死病原菌。Benhamou等發(fā)現(xiàn),寡雄腐霉可與土壤中多種植物病原菌發(fā)生互作,并通過掃描電鏡發(fā)現(xiàn)在寡雄腐霉與其他病原菌接觸后會導(dǎo)致病原菌菌絲結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,病原菌菌絲被寡雄腐霉入侵,細(xì)胞膜潛在滲透位點發(fā)生改變[12]。

寡雄腐霉卵孢子是其能夠抑制病原菌侵染和促進(jìn)植物生長的主要作用成分,常見的制備方法是直接將寡雄腐霉菌碟接入液體培養(yǎng)基中以獲得菌絲體,然后通過攪打或振搖的方式使孢子脫離菌絲并游離至水中[8],此方法獲得的寡雄腐霉卵孢子數(shù)量和效率還有待提高。陳晨等發(fā)現(xiàn),在深綠木霉(Trichodermaatroviride)液體發(fā)酵過程中添加 127.4 mmol/L 鈣離子,其產(chǎn)孢量顯著提升[13]。梁玎玎等采用控制變量法篩選出了適合草莖點霉SYAU-06菌株產(chǎn)孢的培養(yǎng)基和誘導(dǎo)方法,鴨跖草汁的添加縮短了孢子器的形成時間[14]。曠文豐等的研究表明,通過優(yōu)化光照、營養(yǎng)成分等發(fā)酵和后處理工藝是提高木霉菌生防制劑產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)能力的重要策略[15]。本研究旨在通過離體和活體驗證寡雄腐霉卵孢子對禾谷鐮刀菌的防效,并利用正交試驗獲得產(chǎn)孢誘導(dǎo)劑的最優(yōu)配方,從而增加寡雄腐霉菌絲體數(shù)量并誘導(dǎo)其高效產(chǎn)孢,以期為寡雄腐霉生物防治產(chǎn)品研發(fā)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株 植物病原菌禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)標(biāo)準(zhǔn)菌株P(guān)H1、生防真菌寡雄腐霉(Pythiumoligandrum)PO-1及瓜果腐霉(Pythiumaphanidermatum)PA-1保藏于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)地環(huán)境研究中心。PH1與2種腐霉菌分別在PDA和V8培養(yǎng)基上保存,使用前 20 ℃ 活化2次。

1.1.2 培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基:200 g馬鈴薯煮沸 20 min 后用4層紗布濾出浸提液,加入20 g葡萄糖、15 g瓊脂粉,蒸餾水定容至1 L即為PDA液體培養(yǎng)基;YEPD培養(yǎng)基:10 g蛋白胨、3 g酵母提取物、20 g葡萄糖,蒸餾水定容至1 L;綠豆湯培養(yǎng)基:20 g綠豆煮沸30 min后用3層紗布濾出浸提液,蒸餾水定容至1 L;V8培養(yǎng)基:100 mL V8果汁中加入1 g CaCl2,7 000 r/min離心5 min收集上清液,蒸餾水定容至1 L即為V8液體培養(yǎng)基,再加入15 g瓊脂粉即為V8固體培養(yǎng)基。以上培養(yǎng)基均在121 ℃高壓滅菌15 min。

1.1.3 供試植物 小麥種子為市場購買的感病品種,4 ℃保存?zhèn)溆?。試驗?021年在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院開展。

1.2 P. oligandrum對F. graminearum菌絲生長的影響

平板對峙試驗:從平板邊緣劃取相同大小的新鮮菌餅,在距PDA平板邊緣約2 cm的相對應(yīng)的2點上分別接種禾谷鐮刀菌PH1菌餅和寡雄腐霉 PO-1 菌餅。以接種PH1和瓜果腐霉PA-1的處理為陽性對照,以接種PH1和PDA菌碟的處理為陰性對照。置于25 ℃培養(yǎng)箱中對峙培養(yǎng)2、4、6 d后分別觀察菌落形態(tài),使用Image J軟件測量PH1菌落面積。

1.3 P. oligandrum卵孢子液對F. graminearum孢子萌發(fā)的影響

PH1分生孢子懸浮液的制備:菌株在PDA上培養(yǎng)2～3 d,從新鮮培養(yǎng)的PH1平板邊緣劃取5～10個菌碟接種于綠豆湯培養(yǎng)液,25 ℃、170 r/min搖培 5～7 d,用無菌擦鏡紙過濾,濾液經(jīng)5 000 r/min離心10 min,棄上清,用滅菌水洗滌2次,顯微鏡下調(diào)整孢子懸浮液至適宜濃度。

PO-1卵孢子懸浮液的制備:在直徑為90 mm的圓形培養(yǎng)皿中倒入30 mL V8液體培養(yǎng)基,從新鮮的PO-1平板邊緣割取直徑為7.5 mm的菌絲塊倒置在培養(yǎng)基液面上,20 ℃避光培養(yǎng),5 d后取出菌毯并棄置固體培養(yǎng)基部位,加入無菌水用小型豆?jié){機(jī)勻漿,顯微鏡下調(diào)整PO-1卵孢子懸浮液至適宜濃度。

在50 mL錐形瓶中添加8 mL YEPD培養(yǎng)基和 1 mL 濃度為5×105個/mL的PH1孢子懸浮液,以無菌水為空白對照,加入1 mL濃度為5×105個/mL的PO-1卵孢子懸浮液。在25 ℃、180 r/min恒溫?fù)u床中培養(yǎng)8 h后觀察孢子萌發(fā)率,并使用Image J軟件測量萌發(fā)芽管長度(計算每個孢子最長芽管的長度),每個處理最少測量150個孢子。

1.4 P. oligandrum卵孢子液對F. graminearum活體侵染的影響

小麥幼苗培養(yǎng):小麥種子采用3%次氯酸鈉溶液浸泡5 min,無菌水沖洗干凈后,采用75%乙醇溶液浸泡5 min,再次用無菌水沖洗干凈。將完成滅菌的小麥種子放置于干凈的燒杯中,加入無菌水浸泡。24 h后挑選露白的種子轉(zhuǎn)移至鋪設(shè)8層紗布和1層濾紙的培養(yǎng)皿中,加入無菌水至濾紙微微濕潤后避光催芽36～48 h,期間用噴壺保持皿內(nèi)水分。

侵染與拮抗:挑選生長情況相對一致的幼苗轉(zhuǎn)移至新的放有8層紗布和1層濾紙的培養(yǎng)皿中,在 25 ℃ 養(yǎng)苗室內(nèi)12 h—12 h光暗交替培養(yǎng)。待葉尖稍露出胚芽鞘1～2 mm,剪去頂端3 mm制造傷口。在傷口處滴加2 μL濃度為1×105個/mL的PH1孢子懸浮液,2 h后噴灑10 mL濃度為1×105個/mL的PO-1卵孢子懸浮液,以噴灑10 mL無菌水為對照。后續(xù)每天噴灑2次,每次5 mL,7 d后觀察小麥發(fā)病情況并記錄病斑長度。每個處理設(shè)置3個平行,每個平行為25株小麥,試驗重復(fù)2次。

1.5 P. oligandrum產(chǎn)孢誘導(dǎo)劑的篩選

初篩:在V8培養(yǎng)基中分別添加硫酸鎂、硫酸銅、硫酸鋅、碘化鉀、氯化鈷、鉬酸鈉、硫酸銨和乙二胺二乙酸鐵鈉(EDTA鐵鈉)作為誘導(dǎo)劑,根據(jù)前期預(yù)試驗結(jié)果分別設(shè)置質(zhì)量分?jǐn)?shù)梯度:硫酸鎂、硫酸銅、硫酸鋅、碘化鉀、氯化鈷、鉬酸鈉設(shè)置6組質(zhì)量分?jǐn)?shù)梯度,分別為5、10、50、100、150、200 mg/L;硫酸銨設(shè)置6組質(zhì)量分?jǐn)?shù)梯度分別為10、100、200、300、400、500 mg/L;EDTA鐵鈉設(shè)置6組質(zhì)量分?jǐn)?shù)梯度分別為100、500、1 000、1 500、2 000、2 500 mg/L。與“1.3”節(jié)中的方法相同,20 ℃避光培養(yǎng)5 d后取出菌毯并棄置固體培養(yǎng)基部位,加入30 mL無菌水用小型豆?jié){機(jī)勻漿,顯微鏡下統(tǒng)計PO-1卵孢子數(shù)量。

正交試驗:在初篩試驗的基礎(chǔ)上,挑選對PO-1產(chǎn)孢具有促進(jìn)效果的誘導(dǎo)劑與其合適的梯度范圍,在梯度范圍內(nèi)選取合適的水平進(jìn)行正交試驗,并根據(jù)最優(yōu)組合對試驗結(jié)果進(jìn)行驗證。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗數(shù)據(jù)利用SPSS Statistics 26軟件進(jìn)行方差分析(α=0.05),計算所有均值的標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 P. oligandrum對F. graminearum菌絲擴(kuò)展的離體抑制效果

由圖1可知,通過對峙平板試驗發(fā)現(xiàn),與對照及PA-1處理相比,PO-1能夠顯著抑制病原菌PH1的菌絲擴(kuò)展。4 d時PO-1菌絲和PA-1菌絲分別與PH1菌絲接觸,此后PO-1明顯抑制了PH1菌絲生長,其擴(kuò)展速率幾乎停止,邊緣接觸位置的菌絲呈現(xiàn)出不正常的黃色,而PA-1則無明顯抑制作用,PH1菌絲覆蓋PA-1并繼續(xù)生長,邊緣位置菌絲生長情況與對照組無明顯差異(圖1-a)。根據(jù)菌絲面積圖像采集結(jié)果,2 d后PO-1處理的病原菌菌絲擴(kuò)展非常緩慢,4 d和6 d時菌落面積僅為空白對照的60.13%和53.60%,而PA-1處理的病原菌菌落面積與空白對照相當(dāng)(圖1-b)。

2.2 P. oligandrum卵孢子對F. graminearum孢子萌發(fā)的抑制效果

分生孢子萌發(fā)是F.graminearum侵染致病的重要方式。由圖2-a可知,正常芽管一般從兩端長出,長度達(dá)孢子長度的3～5倍,而PO-1卵孢子懸浮液處理的PH1分生孢子芽管發(fā)育不正常,萌發(fā)的位置隨機(jī)分布。通過顯微鏡觀察測定,由圖2-b可知,自然萌發(fā)的PH1孢子8 h后萌發(fā)率為99.9%,平均芽管長度為178.12 μm,而PO-1卵孢子懸浮液顯著抑制PH1孢子的萌發(fā)和芽管伸長(P<0.05),孢子萌發(fā)率僅為14.6%,平均芽管長度為 6.59 μm;表明P.oligandrum卵孢子對病原菌無性生殖能力具有顯著抑制作用。

2.3 P. oligandrum卵孢子對F. graminearum侵染小麥的活體抑制效果

通過活體接種的方式研究P.oligandrum對F.graminearum侵染小麥的防治效果。由圖3可知,在小麥傷口處接種PH1孢子懸浮液后,小麥莖基部出現(xiàn)黑斑,葉部尖端發(fā)黃枯萎,植物組織逐漸壞死,而噴灑PO-1卵孢子懸浮液后,小麥莖基部不發(fā)病或發(fā)病減緩,葉部尖端健康未枯萎;7 d后PO-1處理的莖基部被完全侵染的小麥植株(病斑長度≥15 mm)占14%,顯著低于對照組(68%),莖基部幾乎未發(fā)病的小麥植株(病斑長度<2 mm)占57%,顯著優(yōu)于對照組(8%)。

2.4 P. oligandrum產(chǎn)孢誘導(dǎo)劑配方的篩選

由圖4可知,不添加誘導(dǎo)劑的對照組5 d內(nèi)產(chǎn)孢數(shù)量為2.20×105個/mL,不同濃度的硫酸鎂、硫酸銅、硫酸鋅、碘化鉀和氯化鈷均無法促進(jìn)PO-1產(chǎn)孢,而5～150 mg/L 的鉬酸鈉、100～400 mg/L的硫酸銨、500～2 500 mg/L的EDTA鐵鈉均能不同程度地提高PO-1的產(chǎn)孢數(shù)量。

以鉬酸鈉、硫酸銨、EDTA鐵鈉3個誘導(dǎo)劑作為研究變量,在所得梯度濃度范圍內(nèi)分別選取4個水平進(jìn)行正交試驗,采用L16(43)正交試驗確定PO-1產(chǎn)孢誘導(dǎo)劑的最優(yōu)配方,所用正交試驗因素水平見表1,試驗結(jié)果見表2。

表1 PO-1產(chǎn)孢誘導(dǎo)劑篩選正交試驗因素水平

表2 產(chǎn)孢誘導(dǎo)劑篩選正交試驗結(jié)果

由表2可知,3個誘導(dǎo)劑對PO-1產(chǎn)孢數(shù)量的影響能力順序為 B>C>A,最優(yōu)組合為A3B3C2,即硫酸銨對產(chǎn)孢數(shù)量的影響最大,EDTA鐵鈉次之, 鉬酸鈉對產(chǎn)孢的影響最小,當(dāng)鉬酸銨、硫酸銨、EDTA鐵鈉濃度分別為30、150、1 000 mg/L時,PO-1產(chǎn)孢數(shù)量最多。由于正交試驗的組合中不包含最優(yōu)組合,故按照最優(yōu)組合的參數(shù)進(jìn)行驗證試驗,結(jié)果表明該組合所得卵孢子數(shù)為7.04×105個/mL,是對照組產(chǎn)孢量的3倍以上。

3 討論

研究表明,生防真菌的抑菌機(jī)制以重寄生作用和分泌抗生物質(zhì)為主。Zhang等從海洋環(huán)境中分離得到1株木霉菌HN082102.1,能夠包圍并分解尖孢鐮刀菌菌絲從而抑制黃瓜枯萎病[16];Yassin等在離體試驗中發(fā)現(xiàn),木霉菌屬能夠通過分泌多種細(xì)胞壁分解酶來分解真菌細(xì)胞壁,對小麥黑點病的多種致病菌均有抑制作用[17];Ferraz等發(fā)現(xiàn),釀酒酵母和異常威克漢姆酵母能夠通過死體營養(yǎng)寄生的方式控制可可植株的主要致病菌Moniliophthoraperniciosa,其中,異常威克漢姆酵母可通過菌毛相互連接形成傘狀網(wǎng)絡(luò),從而集體殺死病原菌[18];Horner等采用綠色熒光蛋白(GFP)標(biāo)記寡雄腐霉,發(fā)現(xiàn)寡雄腐霉菌絲可圍繞致病疫霉,并將其作為營養(yǎng)來源[19]。本研究通過離體對峙試驗發(fā)現(xiàn),禾谷鐮刀菌PH1與寡雄腐霉PO-1的菌絲接觸后,PH1菌絲生長明顯受阻,形態(tài)發(fā)生變化,直接接觸部位菌絲呈黃色。瓜果霉腐PA-1與PO-1同屬,兩者所需營養(yǎng)與空間相似,但PA-1與PH1菌絲接觸后不能阻礙其生長,也未使其菌絲形態(tài)發(fā)生變化,菌落形態(tài)與對照組一致。這與Ribeiro等的研究結(jié)果[20]相似,他們發(fā)現(xiàn)寡雄腐霉能夠抑制P.periplocum侵染甜菜根,而對同屬的棘腐霉(P.acanthicum)則不具有這種抑制作用。

禾谷鐮刀菌引起的小麥赤霉病是全球谷物生產(chǎn)面臨的關(guān)鍵問題之一,在全球范圍內(nèi)主要種植區(qū)均有報道[21]。大量研究證明,生物防治手段對禾谷鐮刀菌具有抑制作用。Chen等從小麥穗部微生物菌群中獲得1株高效生防細(xì)菌PseudomonaspisciumZJU60,它通過大量分泌抑菌活性物質(zhì)(吩嗪-1-甲酰胺)抑制赤霉病菌生長、致病和毒素合成[22]。Xu等分離出1株解淀粉芽孢桿菌,能夠抑制禾谷鐮刀菌并降解其產(chǎn)生的玉米赤霉烯酮(ZEN)毒素[23];Diabankana等發(fā)現(xiàn),芽孢桿菌PS17能夠在對峙試驗中抑制包括禾谷鐮刀菌在內(nèi)的多種鐮刀菌屬病原菌的生長[24]。目前,針對禾谷鐮刀菌的生物防治菌株以生防細(xì)菌為主,對生防真菌的研究較少。

分生孢子是高等真菌繁殖和病原菌傳播的主要方式和關(guān)鍵途徑,不但具有長期生存能力,還能在逆境中保護(hù)自身基因組免受傷害,孢子萌發(fā)是病原菌突破防線侵染植株的第一步[25];Ngolong等認(rèn)為孢子會廣泛分布在環(huán)境中,一旦感應(yīng)到外界條件適宜就會開始萌發(fā)并侵染植物[26]。抑制病原菌孢子萌發(fā)是防治植物病害的有效舉措之一,張瑩瑩等篩選出1株多黏類芽孢桿菌P1,可抑制71.3%的蕓薹根腫菌孢子萌發(fā),從而防治菜心根腫病[27];Liu等發(fā)現(xiàn),采用2 mg/L臭氧處理硫色鐮刀菌(F.sulphureum) 2 min 可損傷其菌絲和孢子結(jié)構(gòu),從而將馬鈴薯干腐病病斑直徑降低27.20%、蛇形菌素含量降低39.44%[28]。在離體試驗中,本研究發(fā)現(xiàn)PO-1能夠抑制PH1孢子萌發(fā),阻礙其芽管伸長,采用PO-1處理PH1侵染過的小麥植株,可顯著降低發(fā)病率,減緩病斑擴(kuò)展,提示PO-1可作為防治小麥赤霉病病害流行的有效手段。

孢子是生防真菌抑制病原菌控制病害的主要功能成分,但與細(xì)菌相比,生防真菌孢子產(chǎn)量較少,難以滿足大規(guī)模生產(chǎn)的要求,探究如何提高真菌孢子產(chǎn)量,是推動生防真菌實際應(yīng)用的必要保障。研究人員常通過改變培養(yǎng)基中碳氮等營養(yǎng)物質(zhì)、調(diào)節(jié)銨離子濃度或加入其他人工添加劑等方式來提高孢子產(chǎn)量[14-15]。本試驗對幾種常見的產(chǎn)孢誘導(dǎo)劑進(jìn)行了初步篩選,發(fā)現(xiàn)鉬酸鈉、硫酸銨和EDTA鐵鈉對PO-1產(chǎn)孢數(shù)量具有明顯影響,在V8培養(yǎng)基中加入30 mg/L鉬酸鈉、150 mg/L硫酸銨及 1 000 mg/L EDTA鐵鈉,20 ℃培養(yǎng)5 d后,產(chǎn)孢數(shù)量為7.04×105個/mL,是對照組產(chǎn)孢量的3倍以上,這為提高寡雄腐霉生防制劑的生產(chǎn)效率提供了重要的技術(shù)支撐。