蘭悅嘉，孟憲麗，吳嘉思

? 藥理與臨床?

黃芩素調(diào)控NLRP3/Caspase-1/GSDMD通路介導(dǎo)的焦亡減輕小鼠急性肺損傷作用

蘭悅嘉1，孟憲麗1*，吳嘉思2*

1. 成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 611137 2. 成都中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，四川 成都 611137

探究黃芩素對急性肺損傷（acute lung injure，ALI）小鼠的治療作用以及對NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域3（NOD-like receptor family pyrin domain containing 3，NLRP3）/半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1（cystein-asparate protease-1，Caspase-1）/消皮素D（gasdermin D，GSDMD）焦亡通路的調(diào)控作用。60只雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為對照組、模型組、Caspase-1抑制劑VX-765（30 mg/kg）組和黃芩素低、中、高劑量（10、20、40 mg/kg）組，每組10只。除對照組外，其余各組ip脂多糖（lipopolysaccharide，LPS，15 mg/kg），分別于造模前24 h和造模0.5 h后給予黃芩素或VX-765（30 mg/kg）干預(yù)。造模24 h后，檢測小鼠肺濕干質(zhì)量比以評價肺腫脹；蘇木素-伊紅（HE）染色法檢測肺組織病理變化；透射電子顯微鏡觀察肺組織中巨噬細(xì)胞損傷情況；ELISA法檢測小鼠血清和肺泡灌洗液中白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6、IL-18、IL-1α和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）水平；采用Western blotting檢測肺組織NLRP3、凋亡相關(guān)的斑點樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing CARD，ASC）、cleaved Caspase-1、pro Caspase-1、GSDMD-N以及GSDMD蛋白表達(dá)。人源單核細(xì)胞白血病THP-1細(xì)胞加入100 nmol/L佛波酯誘導(dǎo)24 h，貼壁后隨機(jī)分為對照組、模型組、VX-765（500 nmol/L）組和黃芩素低、中、高劑量（3、10、30 μmol/L）組，除對照組外，采用1 μg/mL LPS聯(lián)合5 mmol/L三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）刺激THP-1細(xì)胞建立細(xì)胞炎癥模型，給予黃芩素或VX-765干預(yù)，采用CCK-8法檢測細(xì)胞活力；ELISA法檢測上清液中IL-1β、IL-18和IL-1α水平；LDH試劑盒檢測上清液中乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）活力；免疫熒光評估NLRP3炎癥小體組裝情況；采用膜聯(lián)蛋白-V-PE（Annexin-V-PE）/7-氨基放線菌素（7-aminoactinomycin，7-AAD）試劑盒評價細(xì)胞焦亡情況；Western blotting檢測細(xì)胞NLRP3/Caspase-1/GSDMD通路相關(guān)蛋白表達(dá)。在ALI小鼠模型中，與模型組比較，VX-765組和黃芩素組小鼠肺腫脹程度明顯減輕（＜0.01），肺組織損傷評分顯著降低（＜0.01），肺組織中巨噬細(xì)胞炎性病變得到緩解，血清及肺泡灌洗液中IL-6、IL-1β、TNF-α、IL-18、IL-1α水平明顯降低（＜0.05、0.01），肺組織NLRP3、ASC、cleaved Caspase-1、pro Caspase-1、GSDMD-N以及GSDMD蛋白表達(dá)水平均顯著降低（＜0.05、0.01）。在細(xì)胞炎癥模型中，與模型組比較，VX-765組和黃芩素組THP-1細(xì)胞IL-1β、IL-18、IL-1α分泌量顯著降低（＜0.01），NLRP3/Caspase-1/GSDMD通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平明顯降低（＜0.05、0.01），NLRP3炎癥小體組裝明顯被抑制（＜0.05、0.01），LDH釋放量及細(xì)胞焦亡率顯著降低（＜0.01）。黃芩素通過抑制NLRP3/Caspase-1/GSDMD通路介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡，從而改善LPS誘導(dǎo)的小鼠ALI。

黃芩素；急性肺損傷；脂多糖；NLRP3/Caspase-1/GSDMD通路；細(xì)胞焦亡

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是膿毒癥患者常見的并發(fā)癥之一，其特征是肺泡上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞損傷、肺部炎癥細(xì)胞浸潤以及出現(xiàn)充血水腫等，屬于臨床常見的危重癥，其發(fā)病急驟、病死率高[1-2]。目前西醫(yī)治療以原發(fā)病的治療、呼吸支持為主，總體上缺乏特效的藥物及方法，不能達(dá)到理想的治療效果，此外，針對膿毒癥臨床治療所使用的抗生素、糖皮質(zhì)激素，因不良反應(yīng)大且易引起藥物依賴性[3]，故不宜長期應(yīng)用。因此，深入探究ALI發(fā)生的作用機(jī)制，尋找新型ALI預(yù)防及治療藥物的具有意義。

NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域3（NOD-like receptor family pyrin domain containing 3，NLRP3）/半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1（cystein-asparate protease-1，Caspase-1）/消皮素D（gasdermin D，GSDMD）為典型的炎癥通路，是ALI的發(fā)病核心[4]，其誘導(dǎo)的下游肺泡巨噬細(xì)胞焦亡是肺損傷和肺腫脹的主要原因之一[5]。據(jù)報道，抑制巨噬細(xì)胞中NLRP3的激活可減少白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-18的釋放，抑制炎癥反應(yīng)，緩解膿毒癥小鼠組織損傷[6]。此外，抑制Caspase-1介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡能夠明顯降低機(jī)體過度炎癥反應(yīng)，從而改善膿毒癥小鼠ALI并抑制脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的肺血管內(nèi)皮細(xì)胞和肺泡巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)[7]。因此，NLRP3/Caspase-1/GSDMD通路可作為治療膿毒癥的重要潛在靶點。

《太平圣惠方》中記載治療膿毒癥藥物使用頻次位于前5位的是大黃、黃芩、甘草、梔子、麥冬[8]。此外，黃芩作為臣藥在黃連解毒湯治療膿毒血癥過程中發(fā)揮了清瀉上焦心肺之火的效用[9]。成分-效應(yīng)研究結(jié)果顯示黃芩素是黃芩中含量最高的黃酮類化合物[10]，臨床常應(yīng)用于治療多種感染性疾病，有較好的解熱、抗炎及改善“熱、毒、瘀”狀態(tài)作用。既往研究表明黃芩素針對多種炎癥相關(guān)疾病具有明顯的改善作用，如對酒精誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷具有保護(hù)作用[11]；通過抑制缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）/血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）信號通路抑制類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎大鼠炎癥反應(yīng)及病理性血管生成等[12]。然而，黃芩素能否通過調(diào)控NLRP3/ Caspase-1/GSDMD通路改善LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和ALI尚不可知。因此，本研究主要探究黃芩素對膿毒癥小鼠ALI的影響及其作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動物

SPF級雄性C57BL/6小鼠60只，7～8周齡，體質(zhì)量（20±5）g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，動物許可證號SCXK（京）2019-0008。動物于12 h晝夜交替環(huán)境下適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。動物實驗經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)動物保護(hù)與使用委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號2022-79）。

1.2 細(xì)胞系

人源單核細(xì)胞白血病THP-1細(xì)胞、小鼠單核巨噬RAW264.7細(xì)胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司，并取第3～10代細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

1.3 藥品與試劑

黃芩素（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，批號MUST-21101117）購自成都曼思特生物科技有限公司；LPS（批號L4391-1MG）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO，批號RNBF8134）均購自美國Sigma公司；佛波酯（phorbol ester，PMA，批號514V021）、三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP，批號530S021）購自北京索萊寶科技有限公司；PBS（批號GA22090352838）、電鏡固定液（批號CR2203215）購自武漢賽維爾生物科技有限公司；THP-1細(xì)胞專用RPMI 1640培養(yǎng)基（批號WH1623N271）、RAW264.7細(xì)胞專用高糖DMEM培養(yǎng)基（批號WHAA23N141）購自武漢普諾賽生命科技有限公司；NLRP3、Caspase-1、cleaved Caspase-1、GSDMD、HMGB1抗體（批號分別為15101、83383S、67314S、46451S、6893）購自美國CST公司；凋亡相關(guān)的斑點樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing CARD，ASC）抗體（批號sc-365611）購自美國Santa Cruz Biotechnology公司；3-磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（批號BB12287199）、山羊抗兔IgG二抗（批號BA12163708）購自北京博奧森生物科技有限公司；Alexa Fluor 488標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（批號A0423）、Alexa Fluor 555標(biāo)記的驢抗小鼠IgG二抗（批號A0460）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）檢測試劑盒（批號C0016）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Caspase-1抑制劑Belnacasan（VX-765，批號S2228）購自美國Selleck公司；蛋白酶抑制劑PMSF（批號17E10A92）、RIPA裂解液（批號17K17B05）、CCK-8試劑盒（批號17K16B60）購自武漢博士德生物工程有限公司；IL-1β、IL-6、IL-1α、IL-18、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA試劑盒（批號分別為PA1064X87935、PA08L02H1995、PA02FDR00461、PA09FR8B5902、PA0684VL9962）購自武漢伊萊瑞特生物科技有限公司；膜聯(lián)蛋白-V-PE（Annexin-V-PE）/7-氨基放線菌素（7-aminoactinomycin，7-AAD）細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（批號C08A090）購自上海愛必信生物科技有限公司。

1.4 儀器

SpectraMaxR iD5型全波長多功能酶標(biāo)儀（美國美谷分子儀器有限公司）；CLM-170B-8-NF型培養(yǎng)箱（新加坡ESCO公司）；SP8SR STED型超高分辨激光共聚焦顯微鏡（德國Leica公司）；JEM-1400型FLASH透射電子顯微鏡（TEM，日本JEOL公司）；1384系列生物安全柜（美國Thermo Fisher Scientific公司）；AE2000型倒置顯微鏡（Motic股份有限公司）；Mini PROTEAN型蛋白電泳儀、Mini Trans-Blot蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）；UVP ChemStudio多功能成像儀（德國Jena公司）；Milli-Q Plus超級純水儀（美國Millipore公司）；FACSCanto Ⅱ型流式細(xì)胞儀（美國BD公司）；SK-O180-S型數(shù)顯圓周搖床（上海珂淮儀器有限公司）。

2 方法

2.1 體內(nèi)實驗

2.1.1 分組、造模與給藥 將60只雄性C57BL/6小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為對照組、模型組、VX-765（30 mg/kg）組和黃芩素低、中、高劑量（10、20、40 mg/kg）組，每組10只。參照文獻(xiàn)方法[13]構(gòu)建ALI小鼠模型，除對照組外，其余各組ip LPS（15 mg/kg），各給藥組分別于造模前24 h和造模0.5 h后ip黃芩素或VX-765，造模后24 h收集各組小鼠血液、肺組織及肺泡灌洗液。

2.1.2 肺組織病理學(xué)觀察 每組取4只小鼠的左肺組織于4%多聚甲醛中固定，脫水、透明、石蠟包埋，制備組織切片，切片厚度3～5 μm，進(jìn)行蘇木素-伊紅（HE）染色、封片后，于顯微鏡下觀察肺組織病理學(xué)變化，并進(jìn)行病理分析評分。

2.1.3 肺腫脹度評估 取“2.1.2”項下各組小鼠的右肺，生理鹽水清洗后，使用濾紙擦拭干凈水分，然后稱定質(zhì)量并標(biāo)記為濕質(zhì)量。隨后置于65 ℃烘箱內(nèi)24 h稱定質(zhì)量并標(biāo)記為干質(zhì)量，計算肺濕干質(zhì)量比。

2.1.4 TEM觀察肺組織超微結(jié)構(gòu) 取新鮮肺組織，組織體積2 mm×2 mm大小，于電鏡固定液內(nèi)室溫固定2 h，再用含1%鋨酸的0.1 mol/L磷酸緩沖液（pH 7.4）在室溫下固定2 h，0.1 mol/L磷酸緩沖液（pH 7.4）漂洗3次，每次15 min，然后以梯度丙酮進(jìn)行脫水，Epon812滲透包埋，采用超薄切片機(jī)制備60～90 nm超薄切片，以鈾鉛雙染色法染色，最后置于TEM下觀察，采集圖像并分析。

2.1.5 ELISA法檢測血清、肺泡灌洗液中IL-1β、IL-6、IL-18、IL-1α和TNF-α水平 小鼠血液樣本常溫靜置2 h后，4 ℃、4000 r/min離心10 min，吸取上層血清。按照文獻(xiàn)方法[14]收集小鼠肺泡灌洗液，離心后吸取上清。按照試劑盒說明書測定血清、肺泡灌洗液中IL-1β、IL-6、IL-18、IL-1α和TNF-α水平。

2.1.6 Western blotting法檢測肺組織相關(guān)蛋白表達(dá) 將剩余各組的肺組織于勻漿機(jī)中勻漿，取勻漿液100 mg與1 mL RIPA裂解液混合，再加10 μL PMSF混勻攪碎，離心取上清液，采用BCA法測定蛋白濃度，調(diào)整蛋白濃度并加入上樣緩沖液，加熱使蛋白變性。樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、TBST洗膜后，分別加入NLRP3、pro Caspase-1、cleaved Caspase-1、ASC、GSDMD抗體，4 ℃孵育過夜，TBST洗滌3次，每次10 min。加入二抗，室溫下?lián)u床孵育2 h，TBST洗滌3次，每次10 min。ECL顯色后曝光，采用Image J 1.8.0軟件分析。以GAPDH為內(nèi)參，計算目的蛋白相對表達(dá)量。

2.2 體外實驗

2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與處理 THP-1細(xì)胞用RPMI 1640培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實驗。THP-1細(xì)胞接種于96孔板或6孔板中，加入100 nmol/L PMA誘導(dǎo)24 h，貼壁后隨機(jī)分為對照組、模型組、VX-765（500 nmol/L）組和黃芩素低、中、高劑量（3、10、30 μmol/L）組。除對照組外，其余各組加入LPS（1 μg/mL）預(yù)處理3 h；各給藥組分別加入相應(yīng)藥物孵育3 h后，除對照組外各組另加入5 mmol/L ATP繼續(xù)刺激45 min。

2.2.2 CCK-8法測定細(xì)胞活力 THP-1細(xì)胞接種于96孔板中，加入100 nmol/L PMA誘導(dǎo)24 h，貼壁后分別加入0、1、10、30、50、100、200 μmol/L的黃芩素處理24 h，另設(shè)置不接種細(xì)胞不含藥物的空白孔。各孔更換為新鮮培養(yǎng)液，加入10 μL CCK-8溶液繼續(xù)培養(yǎng)1.5 h，采用酶標(biāo)儀測定各孔在450 nm處的吸光度（）值，計算細(xì)胞存活率。

細(xì)胞存活率＝(實驗－空白)/(對照－空白)

2.2.3 ELISA法檢測上清液中IL-1β、IL-18和IL-1α水平 按“2.2.1”項下方法進(jìn)行分組及處理，收集各組細(xì)胞上清液，按照試劑盒說明書測定IL-1β、IL-18和IL-1α水平。

2.2.4 Western blotting法檢測THP-1細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá) 按“2.2.1”項下方法進(jìn)行分組及處理，收集細(xì)胞，加入RIPA裂解液提取蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，于5%牛血清白蛋白中封閉，分別加入NLRP3、pro Caspase-1、cleaved Caspase-1、ASC、GSDMD、HMGB-1抗體，4 ℃孵育過夜；加入二抗，室溫孵育2 h，加入超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑，于凝膠成像儀中曝光顯影。

2.2.5 免疫熒光法觀察NLRP3炎癥小體組裝情況 THP-1細(xì)胞以4×105/mL接種于玻底小皿中，加入100 nmol/L PMA誘導(dǎo)24 h，貼壁后隨機(jī)分為對照組、模型組、VX-765（500 nmol/L）組和黃芩素高劑量（30 μmol/L）組。按“2.2.1”項下方法處理，用PBS清洗3次，用2.5%戊二醛固定細(xì)胞，分別加入含NLRP3兔抗、ASC鼠抗、pro Caspase-1兔抗、ASC鼠抗的5%牛血清白蛋白，4 ℃孵育過夜；加入Alexa Fluor 488標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗或Alexa Fluor 555標(biāo)記的驢抗小鼠IgG二抗，室溫孵育2 h，再進(jìn)行DAPI染色，最后在激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

2.2.6 Annexin-V/7-AAD檢測細(xì)胞焦亡 RAW264.7細(xì)胞以8×105/mL接種于6孔板中，貼壁12 h后隨機(jī)分為對照組、模型組、VX-765（500 nmol/L）和黃芩素低、中、高劑量（3、10、30 μmol/L）組。各給藥組分別加入相應(yīng)藥物預(yù)處理1 h后，除對照組外，其余各組加入LPS（500 ng/mL）處理12 h，再另加入5 mmol/L ATP繼續(xù)刺激45 min。最后使用Annexin-V/7-AAD試劑盒染色，并采用流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測。

2.2.7 LDH釋放量檢測 THP-1細(xì)胞接種于96孔板中，加入100 nmol/L PMA誘導(dǎo)24 h，貼壁后按“2.2.1”項下方法進(jìn)行分組及處理，收集細(xì)胞培養(yǎng)液，400×離心5 min，取上清液，根據(jù)LDH檢測試劑盒說明書測定LDH釋放量。

2.3 統(tǒng)計學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 黃芩素對ALI小鼠肺組織損傷的影響

如圖1-A所示，與對照組比較，模型組小鼠肺組織肺濕干質(zhì)量比顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，VX-765組和黃芩素中、高劑量組肺濕干質(zhì)量比顯著降低（＜0.01）。如圖1-B所示，對照組小鼠肺組織各級支氣管結(jié)構(gòu)無明顯異常，肺泡壁結(jié)構(gòu)清晰，未見明顯的炎性改變；模型組小鼠肺組織肺泡壁增厚，肺泡腔狹窄或消失，伴少量炎性細(xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤，偶見血管周圍水腫及少量出血；與模型組比較，VX-765組和黃芩素高劑量組肺組織結(jié)構(gòu)損傷減輕，包括肺水腫、肺泡壁增厚減輕，炎性細(xì)胞浸潤減少。此外，與對照組比較，模型組肺組織損傷評分顯著升高（＜0.01，圖1-C）；與模型組比較，各給藥組肺組織損傷評分均顯著降低（＜0.01）。采用TEM觀察各組小鼠肺組織超微結(jié)構(gòu)，如圖1-D所示，與對照組比較，模型組肺組織的巨噬細(xì)胞中線粒體明顯腫脹，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張呈囊狀，細(xì)胞膜出現(xiàn)破裂；與模型組比較，VX-765組和黃芩素高劑量組線粒體輕度腫脹，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張程度降低，其中黃芩素高劑量組發(fā)生自噬現(xiàn)象。以上結(jié)果表明黃芩素能明顯緩解LPS誘導(dǎo)的小鼠肺損傷，包括減輕肺水腫、減少炎性細(xì)胞浸潤以及阻止肺組織中巨噬細(xì)胞發(fā)生炎性病變等。

3.2 黃芩素對ALI小鼠血清和灌洗液中炎癥因子水平的影響

如圖2所示，與對照組比較，模型組小鼠血清和肺泡灌洗液中IL-6、IL-1β、TNF-α、IL-18、IL-1α水平均顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，VX-765組及黃芩素低、中、高劑量組小鼠血清IL-1β、TNF-α、IL-18和肺泡灌洗液TNF-α、IL-18、IL-1α水平均顯著降低（＜0.01），VX-765組及黃芩素中、高劑量組小鼠血清IL-6、IL-1α和肺泡灌洗液IL-6、IL-1β水平均顯著降低（＜0.01），且黃芩素作用呈劑量相關(guān)性。

A-肺組織濕干質(zhì)量比 B-肺組織病理變化（×200，黃箭頭表示炎性細(xì)胞浸潤聚集，綠箭頭表示出血，黑箭頭表示淋巴細(xì)胞浸潤） C-肺損傷評分 D-肺組織超微結(jié)構(gòu)（×25 000，黃箭頭表示細(xì)胞膜破裂，紅箭頭表示線粒體腫脹，橙箭頭表示粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，綠箭頭表示自噬） 與對照組比較：##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01，下圖同

圖2 黃芩素對ALI小鼠血清(A) 和肺泡灌洗液(B) 中IL-6、IL-1β、TNF-α、IL-18、IL-1α水平的影響(, n = 4)

3.3 黃芩素對ALI小鼠肺組織NLRP3通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

如圖3所示，與對照組比較，模型組小鼠肺組織NLRP3、ASC、cleaved Caspase-1、pro Caspase-1、GSDMD-N和GSDMD蛋白表達(dá)水平均顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，VX-765組及黃芩素中、高劑量組pro Caspase-1和GSDMD蛋白表達(dá)水平明顯降低（＜0.05、0.01），且呈劑量相關(guān)性；VX-765組及黃芩素高劑量組NLRP3、ASC、cleaved Caspase-1和GSDMD-N蛋白表達(dá)水平均顯著降低（＜0.05、0.01）。

3.4 黃芩素對LPS聯(lián)合ATP誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞NLRP3通路相關(guān)蛋白表達(dá)及炎癥因子水平的影響

如圖4-A所示，1、10 μmol/L的黃芩素促進(jìn)細(xì)胞增殖，30、50、100、200 μmol/L的黃芩素抑制細(xì)胞活力，且呈劑量相關(guān)性。如圖4-B、C所示，與對照組比較，LPS聯(lián)合ATP刺激后THP-1細(xì)胞IL-18和IL-1β分泌量顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，VX-765組及黃芩素低、中、高劑量組IL-1β分泌量顯著降低（＜0.01），VX-765組及黃芩素中、高劑量組IL-18分泌量顯著降低（＜0.01）。如圖4-D所示，與對照組比較，模型組NLRP3和cleaved Caspase-1蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，VX-765組及黃芩素中、高劑量組NLRP3蛋白表達(dá)水平顯著降低（＜0.05、0.01），VX-765組及黃芩素低、中、高劑量組cleaved Caspase-1蛋白表達(dá)水平顯著降低（＜0.05、0.01），各組間ASC蛋白表達(dá)水平無明顯差異。

圖3 黃芩素對ALI小鼠肺組織NLRP3/Caspase-1/GSDMD通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響(, n = 3)

圖4 黃芩素對THP-1細(xì)胞存活率(A)、LPS聯(lián)合ATP刺激后THP-1細(xì)胞中IL-18、IL-1β水平(B、C) 及NLRP3/Caspase-1/ GSDMD通路相關(guān)蛋白表達(dá)(D) 的影響(, n = 3)

3.5 黃芩素對LPS聯(lián)合ATP誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞NLRP3炎癥小體組裝的影響

如圖5所示，與對照組比較，LPS聯(lián)合ATP誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞中pro Caspase-1與ASC間、ASC與NLRP3間蛋白-蛋白相互綁定作用增強(qiáng)，且共定位系數(shù)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.01）；與模型組比較，VX-765組及黃芩素高劑量組顯著減弱以上蛋白間相互作用（＜0.05、0.01），表明黃芩素抑制了LPS聯(lián)合ATP刺激后THP-1細(xì)胞中NLRP3炎癥小體的組裝。

3.6 黃芩素對LPS聯(lián)合ATP誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞焦亡的影響

如圖6-A所示，與對照組比較，LPS聯(lián)合ATP刺激的THP-1細(xì)胞中LDH釋放量顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，VX-765組及黃芩素中、高劑量組LDH釋放量顯著降低（＜0.01）。如圖6-B所示，對照組細(xì)胞狀態(tài)優(yōu)良，極少量出現(xiàn)凋亡、壞死情況；而模型組在LPS聯(lián)合ATP刺激下出現(xiàn)明顯的焦亡現(xiàn)象（＜0.01）；與模型組比較，VX-765組及黃芩素低、中、高劑量組均不同程度地抑制了細(xì)胞焦亡（＜0.01），且黃芩素的作用呈劑量相關(guān)性。如圖6-C所示，LPS聯(lián)合ATP刺激介導(dǎo)焦亡標(biāo)志性蛋白GSDMD-N蛋白及下游炎癥因子HMGB-1的過表達(dá)（＜0.01）；而VX-765組及黃芩素中、高劑量組明顯降低GSDMD-N蛋白表達(dá)水平（＜0.05、0.01），VX-765組及黃芩素高劑量組明顯降低HMGB-1蛋白表達(dá)水平（＜0.05、0.01）。如圖6-D所示，模型組IL-1α分泌量顯著升高（＜0.01），而VX-765組及黃芩素中、高劑量組IL-1α分泌量明顯降低（＜0.01）。以上結(jié)果提示黃芩素逆轉(zhuǎn)LPS聯(lián)合ATP誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡。

圖5 黃芩素對LPS聯(lián)合ATP刺激后THP-1細(xì)胞NLRP3炎癥小體組裝的影響(, n = 3)

圖6 黃芩素對LPS聯(lián)合ATP刺激后THP-1細(xì)胞中LDH釋放量(A)、RAW264.7細(xì)胞焦亡(B)、NLRP3/Caspase-1/GSDMD通路相關(guān)蛋白表達(dá)(C)及IL-1α水平(D)的影響(, n = 3)

4 討論

ALI是臨床上常見的危重癥之一，主要發(fā)病機(jī)制為嚴(yán)重感染、創(chuàng)傷后的肺部或全身不可控的炎癥，其發(fā)生率和病死率均較高[15]。研究表明，內(nèi)毒素是導(dǎo)致ALI的重要因素，其主要成分LPS是建立ALI動物模型常用的誘導(dǎo)劑[16-17]。LPS可以激活肺組織中性粒細(xì)胞，誘導(dǎo)機(jī)體大量炎癥因子生成，使炎癥系統(tǒng)激活，觸發(fā)ALI的發(fā)生發(fā)展[18]。針對ALI目前臨床上主要有控制感染、機(jī)械通氣、抗生素等幾種治療方法，但以上方法均存在療效不確切和不良反應(yīng)大等問題[19]，因此開發(fā)具有治療潛力的藥物對于治療ALI具有重大意義。

黃芩是唇形科植物黃芩Georgi的干燥根，性寒味苦，具有清熱燥濕、瀉火解毒等功效，尤其擅長清上焦心肺熱。黃芩素是黃芩的主要活性成分之一，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗凋亡[20]等藥理作用。研究發(fā)現(xiàn)，黃芩素能改善膿毒癥大鼠肺水腫與肺部炎性病變，具有潛在的ALI治療價值[21]。但是目前有關(guān)黃芩素對ALI的作用機(jī)制尚不完全清楚。為此本研究首先采用LPS建立小鼠ALI模型，觀察黃芩素對其作用。結(jié)果顯示，模型組小鼠肺組織濕干質(zhì)量比增加，肺組織染色后中性粒細(xì)胞大量聚集，肺泡坍塌變形，肺組織中巨噬細(xì)胞壞死，細(xì)胞膜破裂，細(xì)胞器腫脹，血清及灌洗液中細(xì)胞因子TNF-α、IL-6等水平升高，提示ALI小鼠模型構(gòu)建成功。而黃芩素干預(yù)后，肺組織濕干質(zhì)量比明顯降低，肺組織結(jié)構(gòu)趨于完整，炎性細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤減少，進(jìn)一步檢測發(fā)現(xiàn)血清及灌洗液中炎癥因子含量顯著降低，表明黃芩素能夠有效緩解肺腫脹，明顯改善肺部炎性損傷，并抑制ALI小鼠體內(nèi)大量促炎細(xì)胞因子的釋放，進(jìn)而發(fā)揮治療ALI的作用。

細(xì)胞焦亡是一種同時具有壞死和凋亡表型特征，并介于二者之間的炎癥性、可逆的調(diào)節(jié)性死亡[22]，焦亡細(xì)胞表現(xiàn)為Annexin-V和7-AAD染色呈雙陽性[23]，因此通過流式細(xì)胞術(shù)準(zhǔn)確快速地檢測造模以及給藥前后RAW264.7細(xì)胞焦亡的發(fā)生率。此外研究證實，NLRP3炎性小體是細(xì)胞焦亡啟動的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[24]。焦亡是一種由外源刺激信號活化胞內(nèi)的炎癥信號通路，并伴隨著先天免疫受體蛋白NLRP3、適配蛋白ASC和炎性蛋白酶Caspase-1組裝的炎癥小體形成，同時激活Caspase-1，從而誘導(dǎo)的GSDMD依賴性的細(xì)胞程序性死亡。期間IL-1β、IL-18、IL-1α及HMGB-1等炎癥介質(zhì)相繼釋放，并最終參與炎癥反應(yīng)。近年來大量研究表明直接或間接抑制NLRP3/ Caspase-1/ASC炎癥小體介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞焦亡能顯著改善ALI的肺部損傷[25]。本研究發(fā)現(xiàn)ALI小鼠肺組織NLRP3/Caspase-1/GSDMD通路蛋白表達(dá)以及血清和灌洗液中炎癥因子IL-1β、IL-18、IL-1α釋放均明顯升高，而經(jīng)黃芩素干預(yù)后能夠明顯逆轉(zhuǎn)以上情況。為進(jìn)一步明確黃芩素是否通過調(diào)控NLRP3/ Caspase-1/GSDMD細(xì)胞焦亡通路來改善LPS誘導(dǎo)的ALI，通過體外培養(yǎng)THP-1細(xì)胞，考察黃芩素對LPS聯(lián)合ATP誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞焦亡的影響及機(jī)制。結(jié)果顯示，黃芩素能夠抑制細(xì)胞焦亡，顯著降低NLRP3/Caspase-1/GSDMD信號通路蛋白表達(dá)以及LDH、IL-1β、IL-18、IL-1α的釋放，與動物實驗結(jié)果一致。ALI小鼠肺組織中ASC蛋白表達(dá)水平增加，給藥后表達(dá)水平出現(xiàn)不同程度的降低，而在THP-1細(xì)胞中刺激前后各組ASC蛋白均穩(wěn)定表達(dá)，且并未受到黃芩素和VX-765干預(yù)的影響，這可能與LPS刺激后不影響ASC的轉(zhuǎn)錄和翻譯，但改變ASC斑點數(shù)量有關(guān)[26]。此外，黃芩素還能干預(yù)NLRP3炎癥小體的組裝，并抑制下游細(xì)胞焦亡。以上結(jié)果提示黃芩素可以通過抑制NLRP3/Caspase-1/ GSDMD介導(dǎo)細(xì)胞焦亡發(fā)揮ALI肺組織損傷的保護(hù)作用（圖7）。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為ALI屬于“外感熱病”，符合“溫?zé)岵　钡姆懂燵27]，而黃芩具有瀉實火、除濕熱的功效，臨床廣泛用于治療各種感染和炎癥性疾病。本研究明確了黃芩中重要黃酮類化合物黃芩素通過抑制NLRP3/Caspase-1/GSDMD通路，降低ALI細(xì)胞焦亡，改善肺損傷?；邳S連-黃芩聯(lián)合應(yīng)用發(fā)揮抗炎作用的文獻(xiàn)支撐，本課題組前期還研究了黃連中表小檗堿對ALI小鼠的作用及機(jī)制[28]，證明了表小檗堿對LPS介導(dǎo)的ALI也具有明顯的改善作用，與調(diào)控CD39-P2X7嘌呤能通路與下游NLRP3炎癥小體有關(guān)。這為黃連-黃芩聯(lián)合應(yīng)用作為臨床治療膿毒癥藥物提供理論基礎(chǔ)，為臨床抗膿毒癥新藥的選擇提供更多可能性。

圖7 黃芩素通過調(diào)控NLRP3/Caspase-1/GSDMD通路介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡減輕LPS誘導(dǎo)的ALI

以上研究結(jié)果為黃芩素治療ALI提供了潛在研究機(jī)制，但僅對其中的NLRP3炎癥小體信號通路進(jìn)行了初步研究，對于其他炎性小體如NLRP1、白介素-1β轉(zhuǎn)換酶激活因子（interleukin-1β-converting enzyme protease-activating factor，IPAF）、黑素瘤缺乏因子2（human absent in melanoma 2，AIM2）的相關(guān)性研究不足，對NLRP3炎癥小體通路上游以及更深的影響機(jī)制尚未完全闡明，因此仍需更多進(jìn)一步的實驗研究來豐富和發(fā)展ALI的相關(guān)理論基礎(chǔ)，以期最終改善疾病的預(yù)后。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Baicalein alleviates acute lung injury in mice by regulating NLRP3/Caspase-1/ GSDMD pathway mediated pyroptosis

LAN Yue-jia1, MENG Xian-li1, WU Jia-si2

1. School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, China 2. School of Acupuncture and Tuina, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, China

To investigate the therapeutic effect of baicalein on acute lung injure (ALI) mice and its regulatory effect on NOD-like receptor family pyrin domain containing 3 (NLRP3)/cysteine-aspartate protease-1 (Caspase-1)/gasdermin D (GSDMD) pyroptosis pathway.A total of 60 male C57BL/6 mice were randomly divided into control group, model group, Caspase-1 inhibitor (VX-765, 30 mg/kg), baicalein low-, medium- and high-dose (10, 20, 40 mg/kg) groups, with 10 mice in each group. Except for the control group, mice in the other groups were ip lipopolysaccharide (LPS, 15 mg/kg) to establish a mouse model of ALI, baicalein or VX-765 was given 24 h before and 0.5 h after modeling. The lung wet/dry weight ratio of mice was measured 24 h after LPS administration to evaluate lung swelling; The hematoxylin-eosin (HE) staining was used to detect lung tissue pathological changes; The injury of macrophages in lung tissue was observed by transmission electron microscopy (TEM); ELISA method was applied to detect interleukin-1β (IL-1β), IL-6, IL-18, IL-1α and tumor necrosis factor-α (TNF-α) levels in alveolar lavage fluid and serum of mice; Protein expressions of NLRP3, apoptosis-associated speck-like protein containing CARD (ASC), cleaved Caspase-1, pro Caspase-1, GSDMD-N, and GSDMD in lung tissue were determined by Western blotting. THP-1 cells were induced with 100 nmol/L phorbol ester for 24 h. After adherence, cells were randomly divided into control group, model group, VX-765 (500 nmol/L) group and baicalein low-, medium- and high-dose (3, 10, 30 μmol/L) groups. Except for the control group, THP-1 cells were stimulated with 1 μg/mL LPS combined with 5 mmol/L adenosine triphosphate (ATP) to replicate inflammatory model, baicalein or VX-765 was given for intervention, CCK-8 method was applied to determine the cell ability; IL-1β, IL-18, and IL-1α levels in supernatant were detected by ELISA; The lactate dehydrogenase (LDH) kit was used to measure LDH activity; The assembly of NLRP3 inflammasome was evaluated by immunofluorescence; Annexin V-PE/7-aminoactinomycin (7-AAD) kit was used to evaluate the cell pyroptosis; The expressions of NLRP3/Caspase-1/GSDMD pathway protein were detected by Western blotting.In ALI mice model, compared with model group, lung swelling of mice in VX-765 group and baicalein group weas significantly attenuated (< 0.01), lung injure score was decreased (< 0.01), inflammatory changes of macrophages in lung tissue were alleviated, levels of IL-6, IL-1β, TNF-α, IL-18 and IL-1α in serum and bronchoalveolar lavage fluid were significantly decreased (< 0.05, 0.01), NLRP3, ASC, cleaved Caspase-1, pro Caspase-1, GSDMD-N, and GSDMD protein expressions in lung tissues were decreased (< 0.05, 0.01). In cell inflammatory model,compared with model group, IL-1β, IL-18 and IL-1α secretions of THP-1 cells in VX-765 group and baicalein group were significantly decreased (< 0.01), the expressions of NLRP3/Caspase-1/GSDMD pathway related proteins were obviously decreased (< 0.05, 0.01), NLRP3 inflammasome assembly was inhibited (< 0.05, 0.01), LDH release and pyroptosis rate were significantly decreased (< 0.01).Baicalein can improve LPS-induced ALI in mice by inhibiting NLRP3/Caspase-1/GSDMD pathway-mediated pyroptosis.

baicalein; acute lung injury; lipopolysaccharide; NLRP3/Caspase-1/GSDMD pathway; pyroptosis

R285.5

A

0253 - 2670(2023)20 - 6694 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.20.013

2023-05-31

國家自然科學(xué)基金青年基金項目（82104491）；四川省自然科學(xué)基金面上項目（2023NSFSC0674）；中國博士后科學(xué)基金面上資助地區(qū)專項支持計劃項目（2021M693789）；成都中醫(yī)藥大學(xué)“杏林學(xué)者”學(xué)科人才科研提升計劃項目（XKTD2022013）

蘭悅嘉，碩士研究生，從事中藥藥理與毒理研究。E-mail: lanyuejia@stu.cdutcm.edu.cn

通信作者：孟憲麗，教授，博士生導(dǎo)師，從事中藥及民族藥藥理與毒理研究。E-mail: xlm999@cdutcm.edu.cn

吳嘉思，講師，博士后，碩士研究生導(dǎo)師，從事中藥藥理與毒理研究。E-mail: wujiasi@cdutcm.edu.cn

[責(zé)任編輯 李亞楠]