樊薛津，金博文，楊秋怡，葛士寧，宋 紋，張 營(yíng)，王躍飛，莊朋偉，張艷軍，尹清晟*，張密霞*

基于BDNF/TrkB/p-CREB信號(hào)通路探討血府逐瘀膠囊促進(jìn)神經(jīng)再生防治卒中后抑郁的作用及機(jī)制

樊薛津1，金博文1，楊秋怡1，葛士寧1，宋 紋2，張 營(yíng)2，王躍飛1，莊朋偉1，張艷軍3, 4，尹清晟1*，張密霞1*

1. 天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617 2. 天津宏仁堂藥業(yè)有限公司，天津 301617 3. 天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津 300381 4. 國(guó)家中醫(yī)針灸臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津 300381

探討血府逐瘀膠囊對(duì)卒中后抑郁（post-stroke depression，PSD）大鼠抑郁癥狀的改善作用，并基于神經(jīng)再生關(guān)鍵通路腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）/酪氨酸激酶受體B（tyrosine kinase receptor，TrkB）/ 磷酸化環(huán)腺苷酸應(yīng)答元件結(jié)合蛋白（phosphorylated cAMP response element-binding protein，p-CREB）探討其機(jī)制。采用短暫大腦中動(dòng)脈梗塞（transient middle cerebral artery occlusion，tMCAO）復(fù)合慢性不可預(yù)知應(yīng)激（chronic unpredictable mild stimulation，CUMS）方法復(fù)制PSD大鼠模型。大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組及血府逐瘀低、高劑量（0.43、0.86 g/kg）組和氟西?。?.8 mg/kg）組，每組18只。連續(xù)給予藥物干預(yù)28 d，利用神經(jīng)功能評(píng)分、糖水偏好實(shí)驗(yàn)、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)考察血府逐瘀膠囊對(duì)PSD大鼠神經(jīng)功能損傷以及抑郁癥狀的改善作用；高效液相色譜-電化學(xué)檢測(cè)法檢測(cè)額葉皮質(zhì)及海馬神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺（dopamine，DA）和5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）含量；免疫熒光染色檢測(cè)海馬5-溴脫氧尿嘧啶核苷（5-bromo-2-deoxyuridine，BrdU）、雙皮質(zhì)素（doublecortin，DCX）和巢蛋白（neuroepithelial stem cell protein，Nestin）表達(dá)評(píng)價(jià)神經(jīng)再生情況；Western blotting檢測(cè)海馬BDNF/TrkB/p-CREB蛋白表達(dá)。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分顯著提高（＜0.001），糖水偏好率顯著下降（＜0.05），強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間顯著增長(zhǎng)（＜0.05）；前額葉皮質(zhì)、海馬組織DA以及海馬組織5-TH含量明顯減少（＜0.05）；BrdU、DCX陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯降低（＜0.05、0.01），Nestin陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量減少；海馬BDNF、TrkB、p-CREB表達(dá)顯著降低（＜0.05、0.01）。與模型組比較，血府逐瘀膠囊組神經(jīng)功能評(píng)分顯著降低（＜0.01），糖水偏好率明顯升高（＜0.05），強(qiáng)迫游泳的不動(dòng)時(shí)間明顯減少（＜0.05、0.01）；前額葉皮質(zhì)和海馬DA、5-TH含量均顯著增加（＜0.05、0.01）；BrdU、Nestin、DCX陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯增加（＜0.05、0.01）；海馬BDNF表達(dá)有增加的趨勢(shì)，TrkB、p-CREB表達(dá)均明顯增加（＜0.05）。血府逐瘀膠囊可通過(guò)BDNF/TrkB/p-CREB通路促進(jìn)神經(jīng)再生進(jìn)而發(fā)揮治療PSD作用。

血府逐瘀膠囊；卒中后抑郁；神經(jīng)遞質(zhì)；神經(jīng)再生；BDNF/TrkB/p-CREB信號(hào)通路

卒中后抑郁（post-stroke depression，PSD）是腦血管疾病發(fā)生后較常見(jiàn)的精神障礙類(lèi)并發(fā)癥。研究表明有近30%的患者會(huì)在卒中后5年內(nèi)出現(xiàn)抑郁癥癥狀[1]，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量且給社會(huì)帶來(lái)了沉重經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。目前基于單胺遞質(zhì)學(xué)說(shuō)的抗抑郁藥是PSD一線治療藥物，但長(zhǎng)期服用會(huì)誘發(fā)較為嚴(yán)重的安全性問(wèn)題[2]。中醫(yī)認(rèn)為PSD屬“郁證”范疇，病機(jī)為素體不足、氣滯血瘀，治法以活血化瘀、行氣止痛為主。血府逐瘀緣起于王清任的《醫(yī)林改錯(cuò)》，具有活血化瘀、行氣止痛之功效。大量臨床研究表明血府逐瘀膠囊具有緩解PSD患者臨床抑郁癥狀、改善患者生活質(zhì)量的作用[3-4]，但具體機(jī)制仍需探索。

神經(jīng)再生障礙是抑郁癥的重要病理特征，促神經(jīng)再生可減輕焦慮和抑郁樣行為。腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）是一類(lèi)重要的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，在調(diào)控神經(jīng)元增殖、分化、成熟及促神經(jīng)元再生方面發(fā)揮重要作用，是目前抑郁癥研究的核心因子[5]。BDNF表達(dá)受到包括環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cAMP response element binding protein，CREB）在內(nèi)的多種信號(hào)調(diào)控，且其活性需與酪氨酸激酶受體B（tyrosine kinase receptor，TrkB）受體結(jié)合[6-7]，BDNF/TrkB信號(hào)傳導(dǎo)的激活導(dǎo)致CREB的磷酸化。因此，本研究重點(diǎn)基于BDNF/TrkB/p-CREB信號(hào)介導(dǎo)的神經(jīng)再生考察血府逐瘀膠囊改善PSD作用機(jī)制，以期為血府逐瘀方臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性Wistar大鼠90只，體質(zhì)量270～300 g，購(gòu)自北京維通利華生物科技有限公司，許可證號(hào)SCXK（京）2016-0006。動(dòng)物飼養(yǎng)室調(diào)節(jié)燈光12 h晝夜交替，溫度（24±2）℃，相對(duì)濕度（35±5）%，自由進(jìn)食飲水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)天津中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)TCM-LAEC2021271）。

1.2 藥品與試劑

血府逐瘀膠囊（0.4 g/粒，批號(hào)BL03223）由天津宏仁堂藥業(yè)有限公司提供；氟西汀（批號(hào)H20073985）購(gòu)自山西仟源醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司；多巴胺（dopamine，DA，批號(hào)D9520）、5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT，批號(hào)SA5230）、尼氏染色試劑盒（甲基紫法，批號(hào)G1432）、DAPI（批號(hào)C0065）、抗熒光淬滅封片劑（批號(hào)S2110）、蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒（批號(hào)G1120）、驢血清（批號(hào)SL050）均購(gòu)自北京Solarbio公司；巢蛋白（neuroepithelial stem cell protein，Nestin）抗體（批號(hào)bs-8203R）、雙皮質(zhì)素（doublecortin，DCX）抗體（批號(hào)bs-20797R）購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；5-溴脫氧尿嘧啶核苷（5-bromo-2-deoxyuridine，BrdU）抗體（批號(hào)AB6326）、Alexa Fluor 488標(biāo)記驢抗小鼠二抗（批號(hào)ab150105）、Alexa Fluor 647標(biāo)記驢抗兔二抗（批號(hào)ab150075）購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；β-actin抗體（批號(hào)AP0060）購(gòu)自Bioworld公司；BDNF抗體（批號(hào)PB9075）、TrkB抗體（批號(hào)PB0475）均購(gòu)自武漢博士德生物有限公司；p-CREB抗體（批號(hào)AP0019）購(gòu)自武漢愛(ài)博泰克生物科技有限公司；羊抗兔二抗（批號(hào)A0208）購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3 儀器

R500型通用型小動(dòng)物麻醉機(jī)（深圳市瑞沃德生命科技有限公司）；Agilent 1260 Infinity II型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）；DM750型倒置熒光顯微鏡（德國(guó)Leica公司）；Spark酶標(biāo)儀（瑞士Tecan公司）。

2 方法

2.1 PSD模型的復(fù)制

采用短暫大腦中動(dòng)脈梗塞（transient middle cerebral artery occlusion，tMCAO）聯(lián)合慢性不可預(yù)見(jiàn)溫和應(yīng)激法（chronic unpredictable mild stimulation，CUMS）進(jìn)行造模[8-13]。大鼠經(jīng)異氟烷麻醉后，分離頸部肌肉，暴露血管，分離右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈。從右側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈插入線栓向前推進(jìn)至大腦中動(dòng)脈，插入線栓60 min后，緩慢拔除線栓，恢復(fù)供血。假手術(shù)組僅做頸外動(dòng)脈結(jié)扎處理。術(shù)后第8天應(yīng)激開(kāi)始，28 d內(nèi)隨機(jī)接受7種不同的應(yīng)激方式：①24 h內(nèi)大鼠禁食；②24 h內(nèi)大鼠禁水；③晝夜顛倒；④潮濕墊料；⑤水平搖晃；⑥45°斜籠24 h；⑦4 ℃冰水游泳。每日1種，每1種出現(xiàn)4次且每種刺激不重復(fù)出現(xiàn)[14]。

2.2 動(dòng)物分組和給藥

將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組及血府逐瘀低、高劑量（0.43、0.86 g/kg，分別相當(dāng)于1、2倍臨床等效劑量）組和氟西汀（1.8 mg/kg）組，每組18只。術(shù)后第8天開(kāi)始應(yīng)激并ig藥物，假手術(shù)組和模型組ig等體積蒸餾水，1次/d，連續(xù)28 d。術(shù)后經(jīng)神經(jīng)功能缺損評(píng)分進(jìn)行重新分組，最后選取每組15只進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。在tMCAO復(fù)合CUMS造模以及藥物治療過(guò)程中，共有9只大鼠死亡。

2.3 神經(jīng)功能評(píng)分

于大鼠應(yīng)激第28天，采用Longa神經(jīng)功能評(píng)分[15]評(píng)定大鼠神經(jīng)功能缺損。

2.4 行為學(xué)檢測(cè)

于大鼠開(kāi)始應(yīng)激后第29天，進(jìn)行糖水偏好實(shí)驗(yàn)、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)。

2.4.1 糖水偏好實(shí)驗(yàn) 各組大鼠在應(yīng)激后第29天進(jìn)行糖水偏好實(shí)驗(yàn)[16]，并計(jì)算糖水偏好率。

糖水偏好率＝糖水消耗量/(純水消耗量＋糖水消耗量)

2.4.2 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn) 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)采用開(kāi)口的觀察盒（100 cm×100 cm×40 cm）并用與大鼠毛色相反的顏色覆蓋滿內(nèi)壁，將底部分為25等份的方塊。把大鼠置于觀察盒底的中央部分（50 cm×50 cm）適應(yīng)1 min，然后開(kāi)始測(cè)試，用攝像機(jī)記錄5 min內(nèi)總距離和直立次數(shù)[17]。

2.4.3 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn) 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)通過(guò)圓柱形透明Pyrex游泳筒完成，筒高40 cm，筒底部直徑20 cm，水深30 cm，水溫23～25 ℃，記錄6 min內(nèi)大鼠靜止不動(dòng)行為的時(shí)間評(píng)價(jià)大鼠的絕望行為[16,18]。

2.5 HPLC檢測(cè)大鼠前額葉皮質(zhì)及海馬DA和5-HT含量

2.5.1 樣品制備 將各組大鼠麻醉，心臟灌流后，迅速斷頭取腦，放置在冰盒上，迅速剝離出腦組織，剝離出前額葉皮層、海馬。組織稱(chēng)定質(zhì)量后，以10 μL/mg比例加入0.1 mol/L高氯酸溶液，4 ℃、14 000 r/min離心20 min，取上清液，置于冰上備用。

2.5.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取10 mg DA和10 mg 5-HT，分別添加高氯酸定容至10 mL，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，取濾液備用。

2.5.3 色譜條件 Waters 反相C18色譜柱（150 mm×4.5 mm，5 μm）；流動(dòng)相為10%乙腈-90%緩沖鹽溶液（含醋酸鈉0.041 mol/L、檸檬酸0.025 mol/L、辛烷磺酸鈉0.92 mmol/L、EDTA-2Na 0.001 2 mmol/L）；柱溫35 ℃；體積流量1 mL/min；進(jìn)樣體積10 μL。

2.5.4 DA和5-HT含量測(cè)定 采用標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程及相關(guān)系數(shù)進(jìn)行含量計(jì)算。

2.6 血府逐瘀膠囊對(duì)PSD模型大鼠神經(jīng)再生的影響

2.6.1 免疫熒光檢測(cè)新生神經(jīng)元數(shù)量 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，各組大鼠麻醉后心臟灌流，迅速剝離大腦，4%多聚甲醛室溫固定24 h。將標(biāo)本轉(zhuǎn)入10倍體積的30%蔗糖溶液，4 ℃脫水至組織沉底，OCT包埋，冷凍至OCT完全凝固，使用冷凍切片機(jī)切片。取冰凍切片室溫放置30 min，檸檬酸鹽緩沖液熱修復(fù)10 min，0.25% Triton X-100通透10 min，10%驢血清孵育30 min，分別滴加一抗BrdU（1∶200）、Nestin（1∶200）、DCX（1∶200），4 ℃孵育過(guò)夜，37 ℃復(fù)溫后，滴加熒光二抗（1∶1000），避光孵育2 h，DAPI孵育5 min，滴加抗熒光淬滅封片劑，蓋玻片封片，顯微鏡下觀察，采集圖像進(jìn)行分析。

2.6.2 Western blotting檢測(cè)海馬BDNF、TrkB和p-CREB蛋白表達(dá) 取海馬組織30 mg，按20∶1的比例加入含有蛋白酶抑制劑的裂解液600 μL，振蕩研磨，冰上裂解30 min后，4 ℃、14 000 r/min離心10 min，取上清，BCA法測(cè)定樣品蛋白濃度。蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，分別加入兔源β-actin（1∶500）、BDNF（1∶1000）、TrkB（1∶1000）以及p-CREB（1∶1000）抗體，4 ℃孵育過(guò)夜，加入羊抗兔二抗（1∶1000）室溫孵育2 h，TBST洗膜5次，5 min/次。加入ECL化學(xué)發(fā)光顯影液顯影后，Image J軟件進(jìn)行結(jié)果分析。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 血府逐瘀膠囊對(duì)PSD模型大鼠神經(jīng)功能的影響

如圖1所示，在應(yīng)激28 d后，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分顯著升高（＜0.001），提示造模后大鼠存在神經(jīng)功能損傷；與模型組比較，各給藥組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分均顯著降低（＜0.01），表明血府逐瘀膠囊具有改善PSD大鼠神經(jīng)功能損傷的作用。

3.2 血府逐瘀膠囊對(duì)PSD模型大鼠抑郁樣癥狀的影響

為考察血府逐瘀膠囊對(duì)PSD大鼠抑郁樣癥狀的改善作用，采用糖水偏好、強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)來(lái)考察PSD模型大鼠的抑郁狀態(tài)，糖水偏好率越高，游泳不動(dòng)時(shí)間越短、直立次數(shù)越多、總距離越遠(yuǎn)，則說(shuō)明大鼠抑郁癥狀改善。如圖2所示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠糖水偏好率顯著下降（＜0.05），游泳不動(dòng)時(shí)間顯著增長(zhǎng)（＜0.05），活動(dòng)總距離和直立次數(shù)有減少趨勢(shì)，表明動(dòng)物出現(xiàn)明顯抑郁樣癥狀，PSD造模成功；與模型組比較，各給藥組大鼠糖水偏好率明顯升高（＜0.05），游泳不動(dòng)時(shí)間均明顯減少（＜0.05、0.01），曠場(chǎng)運(yùn)動(dòng)總距離均有增加的趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。血府逐瘀膠囊低劑量組大鼠直立次數(shù)顯著增加（＜0.05），血府逐瘀膠囊高劑量組和氟西汀組大鼠直立次數(shù)有增加的趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果表明血府逐瘀膠囊具有改善PSD大鼠抑郁樣癥狀的作用。

與假手術(shù)組比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001；與模型組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01，下圖同

圖2 血府逐瘀膠囊對(duì)PSD模型大鼠行為學(xué)的影響(, n = 15)

3.3 血府逐瘀膠囊對(duì)PSD模型大鼠前額葉皮質(zhì)及海馬神經(jīng)遞質(zhì)含量的影響

腦內(nèi)單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)水平（如DA、5-HT）降低是抑郁癥主要病理特征，因此考察了血府逐瘀膠囊對(duì)PSD大鼠腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)的影響。如圖3所示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠前額葉皮質(zhì)DA含量和海馬DA、5-TH含量均明顯降低（＜0.05），前額葉皮質(zhì)5-HT有降低趨勢(shì)；與模型組比較，血府逐瘀膠囊低劑量組和氟西汀組前額葉皮質(zhì)DA、5-HT含量均顯著增加（＜0.05、0.01），血府逐瘀膠囊高劑量組和氟西汀組海馬DA含量均顯著增加（＜0.05），血府逐瘀膠囊低劑量組海馬5-HT含量顯著增加（＜0.05），表明血府逐瘀膠囊具有增加PSD大鼠腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)含量的作用。

3.4 血府逐瘀膠囊對(duì)PSD模型大鼠神經(jīng)再生的影響

神經(jīng)再生障礙是抑郁癥的重要病理特征，促神經(jīng)再生可減輕焦慮和抑郁樣行為。因此考察了血府逐瘀膠囊對(duì)PSD模型大鼠神經(jīng)再生的影響。如圖4所示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬中DCX、BrdU的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量顯著降低（＜0.05、0.01），Nestin的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量有減少趨勢(shì)；與模型組比較，血府逐瘀膠囊低劑量組BrdU、Nestin、DCX陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量顯著增加（＜0.05、0.01），氟西汀組DCX陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量顯著增加（＜0.05），Nestin和BrdU有所增加。結(jié)果表明血府逐瘀膠囊能夠促進(jìn)PSD大鼠的海馬新生神經(jīng)元數(shù)量增加。

圖3 血府逐瘀膠囊對(duì)PSD模型大鼠前額葉皮質(zhì)(A) 及海馬(B) 中DA和5-HT含量的影響(, n = 10)

3.5 血府逐瘀膠囊對(duì)PSD模型大鼠海馬BDNF、TrkB和p-CREB蛋白表達(dá)的影響

BDNF的表達(dá)受到多種信號(hào)通路的調(diào)節(jié)，BDNF與TrkB受體結(jié)合后激活相關(guān)信號(hào)通路，使CREB磷酸化，從而調(diào)節(jié)BDNF的表達(dá)。如圖5所示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬組織BDNF、TrkB和p-CREB蛋白表達(dá)水平均顯著降低（＜0.05、0.01）；與模型組比較，血府逐瘀膠囊低劑量組TrkB、p-CREB蛋白表達(dá)水平均顯著升高（＜0.05），BDNF表達(dá)有增加趨勢(shì)；氟西汀組p-CREB蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.05），BDNF、TrkB表達(dá)有增加趨勢(shì)。結(jié)果表明血府逐瘀膠囊可通過(guò)BDNF/ TrkB/p-CREB通路對(duì)PSD大鼠起到治療作用。

圖5 血府逐瘀膠囊對(duì)PSD模型大鼠海馬組織BDNF、TrkB和p-CREB蛋白表達(dá)的影響(, n = 3)

4 討論

PSD是一種高發(fā)的卒中相關(guān)情緒障礙，癥狀包括情緒低落、快感缺乏、精力喪失、注意力下降、精神遲鈍、失眠或嗜睡和內(nèi)疚等。這些情緒障礙對(duì)患者卒中后的預(yù)后產(chǎn)生負(fù)面影響，患者日?；顒?dòng)依賴性增加、認(rèn)知較差、社交活動(dòng)延遲、康復(fù)效率降低，降低患者生活質(zhì)量，增加死亡率[19-21]。但抑郁癥狀在卒中幸存者中較為普遍，這與社會(huì)關(guān)系、健康程度和受教育程度具有一定相關(guān)性[22-23]。PSD對(duì)于中醫(yī)來(lái)說(shuō)可稱(chēng)之為“中風(fēng)”和“郁癥”的合病。血府逐瘀湯方中君藥紅花善活血、散瘀以止痛，桃仁善破血、行滯而潤(rùn)燥，紅花和桃仁相互配合，增強(qiáng)活血化瘀的力量。川芎善行氣活血、祛風(fēng)止痛；赤芍善清熱涼血、散瘀止痛、活血化瘀止痛以助君藥；牛膝長(zhǎng)于祛瘀通脈，引瘀血下行，3藥共為臣藥。生地黃涼血清熱，以除瘀熱；枳殼理氣寬中疏胸中氣滯；當(dāng)歸養(yǎng)血活血潤(rùn)燥，祛瘀生新不傷正；桔梗宣散肺氣，以利寬中理氣，并載藥上行，與枳殼配伍，升降相輔，開(kāi)胸行氣；柴胡疏肝解郁、升舉清陽(yáng)，共為佐藥。甘草調(diào)和諸藥又緩急止痛，其為使藥。本方活血行氣、祛瘀生新，既解血的瘀滯，又解氣的郁結(jié)，可作為通治一切血瘀氣滯的基礎(chǔ)方[24-26]，是活血理氣的代表方藥。血府逐瘀膠囊是經(jīng)過(guò)現(xiàn)代制劑及加工工藝制成的中成藥，制劑工藝和藥效物質(zhì)相對(duì)明確。

本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)血府逐瘀膠囊可以通過(guò)改善腸屏障功能而間接發(fā)揮腦保護(hù)防治PSD的藥效作用[27]，然而其腦內(nèi)相關(guān)效應(yīng)機(jī)制尚不清楚。本研究首先通過(guò)神經(jīng)功能評(píng)分、行為學(xué)、神經(jīng)遞質(zhì)水平等確認(rèn)了血府逐瘀膠囊防治PSD的藥效作用，發(fā)現(xiàn)血府逐瘀膠囊明顯改善了PSD大鼠的神經(jīng)功能損傷，提高了PSD大鼠糖水偏好率，提升了其自主活動(dòng)能力，明顯縮短了PSD大鼠的不動(dòng)時(shí)間?！皢伟芳僬f(shuō)”是抑郁癥的一個(gè)重要假說(shuō)，它表明DA、5-HT和去甲腎上腺素在抑郁癥中起著關(guān)鍵作用[28]。本研究結(jié)果表明，PSD大鼠前額葉皮質(zhì)以及海馬中DA和5-HT含量均降低，經(jīng)過(guò)血府逐瘀膠囊治療后明顯地恢復(fù)，證明在血府逐瘀膠囊干預(yù)后可以增加PSD大鼠中神經(jīng)遞質(zhì)的含量。

BrdU在神經(jīng)科學(xué)研究中經(jīng)常被用作新分裂細(xì)胞的標(biāo)志，被認(rèn)為是鑒定神經(jīng)再生的“金標(biāo)準(zhǔn)”方法[29]。Nestin是神經(jīng)上皮干細(xì)胞蛋白，Nestin表達(dá)細(xì)胞經(jīng)常出現(xiàn)在神經(jīng)再生區(qū)域，并且在神經(jīng)干細(xì)胞的自我更新和存活中具有重要作用[30-31]。DCX是遷移和分化神經(jīng)元中包含的微管相關(guān)蛋白之一，在發(fā)育和成熟中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元前體中特異性表達(dá)，神經(jīng)元前體細(xì)胞的遷移與DCX的表達(dá)有關(guān)，并且DCX在分化的神經(jīng)元中表達(dá)，表明DCX在神經(jīng)元可塑性、軸突生長(zhǎng)或合成中都起到重要作用。因此，DCX經(jīng)常被用作新生成神經(jīng)元而非神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志[32-33]。為探究血府逐瘀膠囊在神經(jīng)再生機(jī)制方向的治療作用，采用免疫熒光檢測(cè)BrdU、DCX和Nestin的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)相較于PSD大鼠，血府逐瘀膠囊低劑量組以上蛋白表達(dá)均有增加，說(shuō)明血府逐瘀膠囊干預(yù)后可增加PSD大鼠海馬新生神經(jīng)元數(shù)量，為血府逐瘀膠囊治療PSD的神經(jīng)再生機(jī)制探究奠定了基礎(chǔ)。

BDNF通過(guò)影響細(xì)胞分化、神經(jīng)元發(fā)育、生長(zhǎng)和存活、神經(jīng)發(fā)生、突觸發(fā)生和突觸可塑性，在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中起關(guān)鍵作用[34]。研究報(bào)道，BDNF水平降低與腦卒中后抑郁樣行為增加之間存在很強(qiáng)的相關(guān)性，腦卒中人類(lèi)患者血清BDNF水平降低，因此，BDNF的表達(dá)變化在PSD的發(fā)生發(fā)展中可能起關(guān)鍵作用[35]。從樹(shù)突釋放的成熟BDNF可與特異性受體TrkB結(jié)合并激活TrkB受體，在神經(jīng)元生長(zhǎng)、成熟（分化）和維持中起到重要作用[36-37]。CREB是胚胎皮質(zhì)神經(jīng)元中BDNF誘導(dǎo)基因表達(dá)的重要調(diào)節(jié)因子，參與調(diào)節(jié)神經(jīng)元生長(zhǎng)發(fā)育、突觸可塑性和長(zhǎng)期記憶形成，CREB磷酸化激活可抑制細(xì)胞凋亡并促進(jìn)損傷后的細(xì)胞分化和修復(fù)[38]。CREB在BDNF/TrkB信號(hào)傳導(dǎo)被激活后被磷酸化，上調(diào)BDNF的表達(dá)[39]。這是一種目前廣泛認(rèn)可與抑郁和抗抑郁樣反應(yīng)有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子。BDNF/CREB信號(hào)被認(rèn)為是細(xì)胞存活、突觸結(jié)構(gòu)等許多神經(jīng)元生物學(xué)過(guò)程中的關(guān)鍵信號(hào)[40]。本研究通過(guò)Western blotting檢測(cè)海馬BDNF、TrkB、p-CREB蛋白的表達(dá)，給予血府逐瘀膠囊干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，海馬中BDNF、TrkB、p-CREB蛋白的表達(dá)相較于模型組大鼠明顯升高，表明血府逐瘀膠囊可通過(guò)BDNF/TrkB/p-CREB通路發(fā)揮對(duì)PSD的治療作用。

綜上，本研究證實(shí)了血府逐瘀膠囊對(duì)PSD的潛在治療作用。并且發(fā)現(xiàn)其可通過(guò)BDNF/TrkB/p-CREB通路促進(jìn)神經(jīng)再生，進(jìn)而發(fā)揮防治PSD的作用。本研究對(duì)血府逐瘀膠囊的現(xiàn)代研究和臨床合理用藥具有一定參考價(jià)值，并為進(jìn)一步深入探究血府逐瘀膠囊防治PSD的作用機(jī)制提供線索。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] Hackett M L, Pickles K. Part I: Frequency of depression after stroke: An updated systematic review and meta-analysis of observational studies [J]., 2014, 9(8): 1017-1025.

[2] Das J, Rajanikant G K. Post stroke depression: The sequelae of cerebral stroke [J]., 2018, 90: 104-114.

[3] 楊華. 血府逐瘀湯加味方對(duì)腦卒中后抑郁患者神經(jīng)評(píng)分及睡眠質(zhì)量的影響 [J]. 現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志, 2020, 29(28): 3159-3162.

[4] 李巖峰. 血府逐瘀湯聯(lián)合黛力新治療缺血性腦卒中后伴抑郁的療效觀察 [J]. 內(nèi)蒙古中醫(yī)藥, 2020, 39(4): 81-82.

[5] Bj?rkholm C, Monteggia L M. BDNF—A key transducer of antidepressant effects [J]., 2016, 102: 72-79.

[6] Ruan J, Liu L, Shan X,. Anti-depressant effects of oil fromvia PKA-CREB-BDNF signaling [J]., 2019, 39(4): BSR20190141.

[7] Wang C Y, Guo J Y, Guo R J. Effect of XingPiJieYu Decoction on spatial learning and memory and cAMP-PKA-CREB-BDNF pathway in rat model of depression through chronic unpredictable stress [J]., 2017, 17(1): 73.

[8] 羅琳. 從MAPK/ERK信號(hào)通路探討補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)卒中后抑郁大鼠海馬神經(jīng)再生的影響 [D]. 長(zhǎng)沙: 湖南中醫(yī)藥大學(xué), 2015.

[9] 蔡華. 暢郁逍遙散對(duì)腦卒中后抑郁 (PSD) 小鼠作用機(jī)理的實(shí)驗(yàn)研究 [D]. 武漢: 湖北中醫(yī)藥大學(xué), 2010.

[10] 展淑琴, 高亞亞, 張凌峰, 等. 大鼠大腦中動(dòng)脈永久性缺血和缺血再灌注模型的比較 [J]. 陜西醫(yī)學(xué)雜志, 2013, 42(6): 643-646.

[11] Sicard K M, Fisher M. Animal models of focal brain ischemia [J]., 2009, 1: 7.

[12] Fluri F, Schuhmann M K, Kleinschnitz C. Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research [J]., 2015, 9: 3445-3454.

[13] Chiang T, Messing R O, Chou W H. Mouse model of middle cerebral artery occlusion [J]., 2011(48): 2761.

[14] Qiao H, Li M X, Xu C,. Dendritic spines in depression: What we learned from animal models [J]., 2016, 2016: 8056370.

[15] Mei Z G, Huang Y G, Feng Z T,. Electroacupuncture ameliorates cerebral ischemia/reperfusion injury by suppressing autophagy via the SIRT1-FOXO1 signaling pathway [J]., 2020, 12(13): 13187-13205.

[16] Bogdanova O V, Kanekar S, D'Anci K E,. Factors influencing behavior in the forced swim test [J]., 2013, 118: 227-239.

[17] Katz R J, Roth K A, Carroll B J. Acute and chronic stress effects on open field activity in the rat: Implications for a model of depression [J]., 1981, 5(2): 247-251.

[18] Porsolt R D, Bertin A, Jalfre M. Behavioral despair in mice: A primary screening test for antidepressants [J]., 1977, 229(2): 327-336.

[19] Kim J S. Post-stroke mood and emotional disturbances: Pharmacological therapy based on mechanisms [J]., 2016, 18(3): 244-255.

[20] Babkair L A. Risk factors for poststroke depression: An integrative review [J]., 2017, 49(2): 73-84.

[21] Villa R F, Ferrari F, Moretti A. Post-stroke depression: Mechanisms and pharmacological treatment [J]., 2018, 184: 131-144.

[22] Dong L M, Sánchez B N, Skolarus L E,. Ethnic differences in prevalence of post-stroke depression [J]., 2018, 11(2): e004222.

[23] Santos E B, Rodrigues R A P, Pontes-Neto O M. Prevalence and predictors of post stroke depression among elderly stroke survivors [J]., 2016, 74(8): 621-625.

[24] 孟瑤, 趙丹陽(yáng), 隋月皎. 血府逐瘀膠囊治療冠心病療效的Meta分析[J]. 藥物評(píng)價(jià)研究, 2021, 44(9): 1990-1997.

[25] 楊麗麗. 血府逐瘀湯治療頭痛臨床體會(huì) [J]. 光明中醫(yī), 2022, 37(4): 693-695.

[26] 王璐瑤, 張亞平, 穆琦瑄, 等. 基于超分子傳感技術(shù)研究血府逐瘀湯對(duì)三甲胺結(jié)腸吸收的影響[J]. 中草藥, 2022, 53(6): 1783-1789.

[27] 鄭舒, 金博文, 李東娜, 等. 基于腸屏障功能探討血府逐瘀膠囊防治卒中后抑郁作用研究 [J]. 中南藥學(xué), 2022, 20(12): 2823-2830.

[28] Gu S M, He Z M, Xu Q Y,. The relationship between 5-hydroxytryptamine and its metabolite changes with post-stroke depression [J]., 2022, 13: 871754.

[29] Cooperrider J, Chan H H, Gale J T,. BrdU-induced hyperlocomotion in the stroked rat [J]., 2019, 703: 96-98.

[30] Park D, Xiang A P, Mao F F,. Nestin is required for the proper self-renewal of neural stem cells [J]., 2010, 28(12): 2162-2171.

[31] Bernal A, Arranz L. Nestin-expressing progenitor cells: Function, identity and therapeutic implications [J]., 2018, 75(12): 2177-2195.

[32] Hwang I K, Yoo K Y, Li H,. Differences in doublecortin immunoreactivity and protein levels in the hippocampal dentate gyrus between adult and aged dogs [J]., 2007, 32(9): 1604-1609.

[33] Hwang I K, Yoon Y S, Choi J H,. Doublecortin- immunoreactive neuronal precursors in the dentate gyrus of spontaneously hypertensive rats at various age stages: Comparison with Sprague-Dawley rats [J]., 2008, 70(4): 373-377.

[34] Palasz E, Wysocka A, Gasiorowska A,. BDNF as a promising therapeutic agent in Parkinson’s disease [J]., 2020, 21(3): 1170.

[35] Shan D, Zheng Y D, Froud K. Brain-derived neurotrophic factor as a clinical biomarker in predicting the development of post-stroke depression: A review of evidence [J]., 2021, 13(6): e15662.

[36] Zhang E, Liao P. Brain-derived neurotrophic factor and post-stroke depression [J]., 2020, 98(3): 537-548.

[37] Chen F, Zhou C C, Yang Y,. GM1 ameliorates lead-induced cognitive deficits and brain damage through activating the SIRT1/CREB/BDNF pathway in the developing male rat hippocampus [J]., 2019, 190(2): 425-436.

[38] Li Y Z, Wu Z Y, Zhu B Q,. The BDNF-TrkB-CREB signalling pathway is involved in bisphenol S-induced neurotoxicity in male mice by regulating methylation [J]., 2022, 10(8): 413.

[39] Liu S, Li X H, Gao J M,. Icariside II, a phosphodiesterase-5 inhibitor, attenuates beta-amyloid- induced cognitive deficits via BDNF/TrkB/CREB signaling [J]., 2018, 49(3): 985.

[40] Xue W, Wang W, Gong T,. PKA-CREB-BDNF signaling regulated long lasting antidepressant activities of Yueju but not ketamine [J]., 2016, 6: 26331.

Effect and mechanism of Xuefu Zhuyu Capsule on promoting nerve regeneration and preventing post-stroke depression based on BDNF/TrkB/p-CREB signaling pathway

FAN Xue-jin1, JIN Bo-wen1, YANG Qiu-yi1, GE Shi-ning1, SONG Wen2, ZHANG Ying2, WANG Yue-fei1, ZHUANG Peng-wei1, ZHANG Yan-jun3, 4, YIN Qing-sheng1, ZHANG Mi-xia1

1. Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 301617, China 2. Tinjin Hong Ren Tang Pharmaceutical Co., Ltd., Tianjin 301617, China 3. First Teaching Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 300381, China 4. National Clinical Research Center for Chinese Medicine Acupuncture and Moxibustion, Tianjin 300381, China

To explore the improvement effect of Xuefu Zhuyu Capsule (血府逐瘀膠囊) on depression symptoms in post-stroke depression (PSD) rats, and explore its mechanism based on the key pathway of neural regeneration [brain derived neurotrophic factor (BDNF)/tyrosine kinase receptor B (TrkB)/phosphorylated cAMP response element binding protein (p-CREB)].The rats model of PSD was established by transient middle cerebral artery occlusion (tMCAO) and chronic unpredictable mild stimulation (CUMS). Rats were randomly divided into sham group, model group, Xuefu Zhuyu Capsule low-and high-dose (0.43, 0.86 g/kg) groups and fluoxetine (1.8 mg/kg) group, with 18 rats in each group. Continuous medication intervention was given for 28 d, and the improvement effect of Xuefu Zhuyu Capsule on neurological function damage and depressive symptoms in PSD rats was investigated by neurological function scores, sugar preference experiments, open field experiments and forced swimming experiments; High performance liquid chromatography-electrochemical detection method was used to detect the contents of neurotransmitters dopamine (DA) and 5-hydroxytryptamine (5-HT) in frontal cortex and hippocampus; Immunofluorescence staining was used to detect the expressions of 5-bromo-2-deoxyuridine (BrdU), doublecortin (DCX) and neuroepithelial stem cell protein (Nestin) in hippocampus to evaluate nerve regeneration; Western blotting was used to detect the expressions of BDNF/TrkB/p-CREB protein.Compared with sham group, neurological deficit score of rats in model group was significantly increased (< 0.001), the sugar water preference rate was significantly decreased (< 0.05), and duration of forced swimming immobility was significantly increased (< 0.05). The levels of DA in prefrontal cortex and hippocampus and 5-TH in hippocampus were significantly reduced (< 0.05). The number of BrdU and DCX positive cells were significantly decreased (< 0.05, 0.01), while the number of Nestin positive cells was decreased. The expressions of BDNF, TrkB and p-CREB in hippocampus were significantly reduced (< 0.05, 0.01). Compared with model group, neurological deficit score in Xuefu Zhuyu Capsule group was significantly reduced (< 0.01), the sugar water preference rate was significantly increased (< 0.05), and the immobility time of forced swimming was significantly reduced (< 0.05, 0.01). The levels of DA and 5-HT in prefrontal cortex and hippocampus were significantly increased (< 0.05, 0.01). The number of BrdU, Nestin and DCX positive cells were significantly increased (< 0.05, 0.01). The expression of BDNF in hippocampus showed an increasing trend, and the expressions of TrkB and p-CREB were significantly increased (< 0.05).Xuefu Zhuyu Capsule can promote nerve regeneration through BDNF/TrkB/p-CREB pathway and thus exert therapeutic effects on PSD.

Xuefu Zhuyu Capsule; post-stroke depression; neurotransmitter; neuronal regeneration; BDNF/TrkB/p-CREB signaling pathway

R285.5

A

0253 - 2670(2023)20 - 6704 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.20.014

2023-06-19

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81873192）

樊薛津（2000—），女，漢族，碩士研究生，從事中藥藥理學(xué)研究。E-mail: 13302001628@163.com

通信作者：張密霞（1976—），女，漢族，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，博士，主要從事中藥藥理學(xué)研究。Email: mimimixia@sina.com

尹清晟（1994—），男，漢族，助理研究員，博士，主要從事中藥藥理學(xué)研究。Email: carrysable@163.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]