代愉恒，高暢，梁新袖，盧莎，3，華雯，鄭鉅圣*，胡文勝，3*

1.310008 浙江省杭州市婦產(chǎn)科醫(yī)院

2.310024 浙江省杭州市，西湖大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院

3.310008 浙江省杭州市，杭州師范大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院

4.310053 浙江省杭州市，浙江中醫(yī)藥大學(xué)第四臨床醫(yī)學(xué)院

妊娠期糖尿病（gestational diabetes mellitus，GDM）不僅在短期內(nèi)與圍生期發(fā)病風(fēng)險的增加相關(guān)，而且在未來會增加母親和子代發(fā)生不良健康后果的風(fēng)險，如代謝綜合征、心血管疾病和肥胖癥［1］。最新的系統(tǒng)綜述和薈萃分析顯示我國GDM的總體患病率約為14.8%［2］。同樣作為妊娠期常見的疾病之一，妊娠期高血壓疾?。╤ypertension disorders of pregnancy，HDP）可嚴重危害孕婦健康及胎兒成長發(fā)育，可導(dǎo)致早產(chǎn)、死產(chǎn)等不良結(jié)局，在我國的發(fā)病率為6%～8%，而美國疾病控制與預(yù)防中心提供的數(shù)據(jù)顯示近年在分娩住院期間發(fā)生的孕產(chǎn)婦死亡中，31.6%存在HDP記錄［3-4］。GDM與HDP擁有共同的風(fēng)險因素，如BMI增加、胰島素抵抗和空腹高血糖［5］。一項大型前瞻研究表明，患有GDM的婦女在妊娠后患高血壓的風(fēng)險顯著增加［6］，而二者在妊娠期的共同存在可引發(fā)更嚴重的不良妊娠結(jié)局［7］。已有研究顯示，GDM和HDP的獨立發(fā)生、發(fā)展伴隨著腸道菌群的改變，且細菌的豐度和炎癥指標存在強相關(guān)性［8-9］。目前GDM并發(fā)HDP的發(fā)病機制尚不明晰，且較少有研究區(qū)分單獨存在GDM與GDM合并HDP兩類人群腸道菌群的差異。因此，本研究擬探討在GDM人群中母體孕中期腸道微生物群與并發(fā)HDP的關(guān)系，從而從微生態(tài)結(jié)構(gòu)的角度為GDM合并HDP的發(fā)病機制探究提供參考。

1 對象與方法

1.1 研究對象

本研究選取2019年8月—2020年1月在杭州市婦產(chǎn)科醫(yī)院行產(chǎn)前檢查的孕婦，孕前無高血壓病史，在妊娠24～28周期間被確診為GDM，并在全妊娠期均未被診斷為HDP的孕婦作為GDM組。同時選取同期在杭州市婦產(chǎn)科醫(yī)院行產(chǎn)前檢查并被確診為GDM，同時患有HDP的孕婦作為GDM合并HDP組，HDP包括妊娠期高血壓、子癇前期、子癇、妊娠合并慢性高血壓等，被確診為其中任一項即歸為GDM合并HDP組。納入標準：（1）年齡為20～40歲；（2）單胎妊娠；（3）產(chǎn)檢資料完整。排除標準：（1）妊娠前存在糖尿病；（2）多胎妊娠；（3）合并其他嚴重器質(zhì)性病變或者自身免疫性疾病等；（4）3個月內(nèi)有抗生素、免疫毒性藥物、激素拮抗劑和大劑量益生菌服用史。入組孕婦均由本人簽署知情同意書，本項目已通過杭州市婦產(chǎn)科醫(yī)院倫理委員會審批（2018-009-01）。

1.2 研究方法

1.2.1 相關(guān)診斷標準及定義：妊娠24～28周的孕婦經(jīng)由75 g口服葡萄糖耐量試驗（oral glucose tolerance test，OGTT），空腹及OGTT 1、2 h的血糖值應(yīng)分別低于5.1、10.0、8.5 mmol/L，任何一項血糖值達到或超過以上標準即診斷為GDM［10］。HDP診斷標準參考《妊娠期高血壓疾病診治指南（2015）》［11］。

1.2.2 臨床資料收集：記錄入組孕婦年齡、身高、體質(zhì)量、孕前BMI、基線孕周、家庭總年收入和受教育程度。

1.2.3 炎癥指標檢測：取入組孕婦的空腹靜脈血后，采用全自動血細胞分析儀（邁瑞，型號BC-6900）檢測白細胞計數(shù)、淋巴細胞計數(shù)、嗜酸粒細胞計數(shù)、中性粒細胞計數(shù)、嗜堿粒細胞計數(shù)和單核細胞計數(shù)，并用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測血清中超敏C反應(yīng)蛋白。

1.2.4 糞便樣本采集及腸道菌群檢測：所有入組孕婦于妊娠24～28周留取空腹糞便標本，后置于-80 ℃保存。采用Qiagen公司Stool DNA提取試劑盒提取糞便DNA，以DNA為擴增模板，使用通用338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）引物擴增16S rRNA基因的V3和V4區(qū)域；反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min，隨后進行18個循環(huán)（包括94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s），最后72 ℃延伸5 min，擴增序列經(jīng)2%瓊脂凝膠電泳測試檢驗質(zhì)量。產(chǎn)物純化使用Beckman Coulter Genomics公司的Agencourt AMPure XP回收試劑盒。

1.2.5 生物信息學(xué)分析：將等摩爾量的擴增產(chǎn)物匯集在一個試管中，匯集庫的濃度由Qubit定量系統(tǒng)測定。擴增子測序在Illuimina MiSeq系統(tǒng)上進行，并通過Quantitative Insights into Microbial Ecology（QIIME）軟件（1.9.0版）進行質(zhì)量過濾。使用Greengenes數(shù)據(jù)庫（13_8版）對擴增序列變體（Amplicon Sequence Variant，ASV）進行分類并注釋，得到對應(yīng)物種的豐度分布情況。為獲取有效數(shù)據(jù)，濾過并刪除了低豐度菌群（各水平覆蓋率＜10%，相對豐度＜0.01%的菌）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用Stata 15和R 3.5.3軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。經(jīng)正態(tài)性分布和方差齊性檢驗后，連續(xù)變量以（±s）表示，組間比較采用雙樣本t檢驗；分類變量以人數(shù)（百分比）表示，組間比較采用Pearson's chi-squared檢驗。采用4個指標，包括Shannon熵、Observed features指數(shù)、Faith's PD（Faith's Phylogenetic Diversity）指數(shù)和Pielou均勻度指數(shù)計算α-多樣性，并進行均一化處理?；贐ray-Curtis距離的主坐標分析（PCoA）和置換多元方差分析（permutational multivariate analysis of variance，PERMANOVA）（999次）觀察不同組別間在ASV組成的β-多樣性差異。采用LEfSe分析，對不同組別的孕婦腸道菌群科和屬水平上的相對豐度進行比較。采用Logistic回歸，在校正年齡、孕前BMI、基線孕周和產(chǎn)次的基礎(chǔ)上，分析探索腸道菌群α-多樣性與GDM合并HDP的關(guān)聯(lián)。后采用Spearman秩相關(guān)分析探究腸道菌群與炎癥指標的關(guān)聯(lián)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究對象基本特征

GDM組與GDM合并HDP組年齡、孕前BMI、基線孕周、產(chǎn)次、受教育程度比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。GDM組與GDM合并HDP組家庭總年收入比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 研究對象基本特征Table 1 Basic characteristics of the participants

2.2 腸道菌群組成比較

2.2.1α-多樣性分析：以GDM是否合并HDP（賦值：是=1，否=0）為因變量，以Shannon熵、Observed features指數(shù)、Faith's PD指數(shù)及Pielou均勻度指數(shù)4個α-多樣性指標（皆為連續(xù)變量，賦值為實測值）為自變量，在校正年齡、孕前BMI、基線孕周和產(chǎn)次后進行Logistic回歸分析，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)與GDM合并HDP的顯著相關(guān)的腸道菌群多樣性指標（P＞0.05），見表2。

表2 腸道菌群α-多樣性與GDM合并HDP關(guān)聯(lián)的Logistic回歸分析Table 2 Logistic regression analysis of the association between alphadiversity of gut microbiota and concurrent HDP in GDM

2.2.2β-多樣性分析：PCoA分析顯示，在屬水平，主成分1和2的解釋度分別為16.7%和11.6%，兩組腸道菌群組成上比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖1。

圖1 腸道菌群β-多樣性分析Figure 1 Beta-diversity analysis of gut microbiota

2.2.3 門水平分析：所有研究對象腸道菌群共檢測出厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Protecobacteria）4個主要的門，其中Firmicutes在兩組中占絕對優(yōu)勢。兩組在主要門水平上的菌群相對豐度比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖2。

圖2 腸道菌群門水平分析Figure 2 The analysis of gut microbiota at phylum level between the two groups

2.2.4 LEfSe分析：（1）科水平分析顯示，與GDM組相比，韋榮氏菌科（Veillonellaceae）在GDM合并HDP組明顯富集（P＜0.05），而柔膜菌綱RF39未分類菌科（Mollicutes RF39 unclassified family）和毛螺菌科（Lachnospiraceae）的相對豐度降低（P＜0.05）；（2）屬水平分析顯示，與GDM組相比，小桿菌屬（Dialister）、腸桿菌屬（Intestinibacter）、真桿菌屬（Eubacterium）和副薩特氏菌屬（Parasutterella）在GDM合并HDP組明顯富集（P＜0.05）；與GDM合并HDP組相比，嗜木聚糖真桿菌屬（［Eubacterium］ xylanophilum group）、Ruminiclostridium 6、柔膜菌綱RF39未分類菌屬（Mollicutes RF39 unclassified genus）和毛螺菌科未分類菌屬（Lachnospiraceae unclassified genus）在GDM組明顯富集（P＜0.05），見圖3。

圖3 兩組腸道菌群科水平和屬水平相對豐度比較Figure 3 Comparison of relative abundance of gut microbiota at family and genus levels between the two groups

2.3 腸道菌群與GDM合并HDP的Logistic回歸分析

以GDM基礎(chǔ)上是否合并HDP（賦值：是=1，否=0）為因變量，以2.2.4中組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義的菌科和菌屬的相對豐度為自變量（賦值：實測值），進行相同模型的Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，Veillonellaceae、Dialister、Intestinibacter豐度上升是GDM孕婦合并HDP的獨立危險因素（P＜0.05）；Lachnospiraceae unclassified genus豐度上升是GDM孕婦合并HDP的保護因素（P＜0.05），見表3。

表3 腸道菌群科水平和屬水平與GDM合并HDP的Logistic回歸分析Table 3 Logistic regression analysis of gut microbiota at family and genus levels in relation to concurrent HDP in GDM

2.4 腸道菌群與炎癥指標的相關(guān)性分析

基于2.3中Logistic回歸篩選出的與HDP結(jié)局顯著相關(guān)的科水平及屬水平菌群與炎癥指標進行Spearman秩相關(guān)分析，結(jié)果顯示：Veillonellaceae與單核細胞比例呈正相關(guān)（P＜0.05）；Dialister與白細胞計數(shù)、嗜酸粒細胞比例、嗜酸粒細胞計數(shù)呈正相關(guān)（P＜0.05），見表4。

3 討論

GDM及HDP均為妊娠期常見的代謝并發(fā)癥，GDM合并HDP可極大增加孕婦及子代近遠期不良結(jié)局的風(fēng)險。然而目前GDM及HDP的發(fā)病機制仍未完全闡明，大量研究證據(jù)表明腸道微生物的組成變化可作為GDM與HDP病理狀態(tài)的生物標志物，腸道菌群在免疫系統(tǒng)乃至全身充當(dāng)著重要的角色，可能在心血管疾病和代謝紊亂的發(fā)展中發(fā)揮著作用［12-15］。本研究中納入的204例GDM孕婦的腸道菌群主要由4個門Firmicutes、Bacteroidetes、Actinobacteria、Protecobacteria組成，其中Firmicutes相對豐度最高，這與近幾年針對GDM或HDP人群的同類菌群分析結(jié)果基本一致［8-9，12］。本研究結(jié)果顯示，Veillonellaceae、Dialister及Intestinibacter豐度上升是GDM合并HDP的獨立危險因素，而Lachnospiraceae unclassified genus豐度上升對于GDM合并HDP則呈現(xiàn)保護作用；并且Veillonellaceae和Dialister與機體炎癥指標（如嗜酸粒細胞、單核細胞）存在顯著正相關(guān)。

前期研究證明大鼠模型中Veillonellaceae與血壓呈顯著正向相關(guān)［16］。另一項研究表明，Veillonellaceae可誘導(dǎo)宮頸上皮細胞促炎反應(yīng)，使促炎細胞因子和趨化因子分泌上調(diào)［17］。本研究結(jié)果與上述結(jié)論一致，即GDM合并HDP組孕婦較單純GDM組腸道菌群中富集Veillonellaceae，并在Logistic回歸結(jié)果中得到驗證，且其豐度與單核細胞比例增加存在關(guān)聯(lián)，提示Veillonellaceae與高血壓表型及機體炎癥可能存在著潛在的聯(lián)系。既往研究證實Dialister作為脊柱關(guān)節(jié)炎疾病活動的微生物標志物，與腸道的炎癥反應(yīng)呈現(xiàn)強相關(guān)［18］。本研究發(fā)現(xiàn)，Dialister明顯富集于GDM合并HDP組，Logistic回歸分析得出Dialister豐度上升是GDM孕婦合并HDP不良妊娠結(jié)局的獨立危險因素，該菌屬更是與多個炎癥指標（白細胞計數(shù)、嗜酸粒細胞比例、嗜酸粒細胞計數(shù)）顯著相關(guān)，與既往研究基本一致［18］。

Lachnospiraceae unclassified genus屬于著名的丁酸生產(chǎn)者Lachnospiraceae［19］；短鏈脂肪酸，如丁酸，被證明有助于維持肥胖孕婦的正常血壓，并可直接影響血管的張緊度［9］。不僅如此，丁酸鹽還具有抗炎潛力，可抑制在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮核心作用的核因子κB（NFκB）的激活，從而降低促炎細胞因子mRNA的表達［20］。本研究同樣發(fā)現(xiàn)此菌對于GDM合并HDP呈現(xiàn)保護作用，即OR＜1（P＜0.05）。既往研究發(fā)現(xiàn)Intestinibacter在克羅恩病患者中富集［21］，本研究發(fā)現(xiàn)其與GDM合并HDP有顯著的正向關(guān)聯(lián)。另一方面，在一項涉及508名健康男性的橫斷面研究中，炎癥標志物（包括細胞間黏附分子1和白介素6）的濃度與血壓之間存在顯著的正相關(guān)［22］。由此，初步推測GDM患者菌群對并發(fā)HDP的可能影響機制如下：部分有益菌（如產(chǎn)短鏈脂肪酸的菌屬）減少及促炎相關(guān)菌增多，從而導(dǎo)致腸道微生物的代謝物，如丁酸的生產(chǎn)能力下降，由此造成纖溶酶原激活物抑制劑1（PAI-1）水平分泌增加，繼而引發(fā)機體炎癥反應(yīng)，伴隨高血壓和子癇前期的風(fēng)險增加［9，23-24］。但是上述結(jié)論需要在進一步的機制研究和更大規(guī)模的人群研究中進行驗證。

綜上所述，Veillonellaceae、Dialister、Intestinibacter豐度上升是GDM孕婦合并HDP的獨立危險因素，Lachnospiraceae unclassified genus豐度上升是GDM孕婦合并HDP的保護因素，其中Veillonellaceae、Dialister 與多項炎癥指標呈正相關(guān)，提示差異菌可能通過改變機體炎癥狀態(tài)而對GDM合并HDP的發(fā)生、發(fā)展產(chǎn)生影響，但是仍有待后續(xù)開展更多相關(guān)研究進一步確定發(fā)病機制以及因果關(guān)系，以改善不良妊娠結(jié)局造成的影響。

本研究特別關(guān)注GDM患者這一群體特有的腸道菌群特征與常見并發(fā)癥HDP之間的關(guān)聯(lián)性，將16S rDNA測序的物種注釋結(jié)果用于與GDM合并HDP的風(fēng)險進行關(guān)聯(lián)，提示了腸道菌群特征可作為GDM人群進行早期無創(chuàng)精準篩查HDP的良好指標之一，并啟示腸道菌群的差異性富集與GDM并發(fā)HDP病理機制之間的潛在關(guān)聯(lián)性。

作者貢獻：鄭鉅圣進行文章的構(gòu)思與研究的設(shè)計；高暢、梁新袖、盧莎、華雯進行數(shù)據(jù)收集及整理；梁新袖進行統(tǒng)計學(xué)處理；代愉恒、高暢負責(zé)撰寫論文，進行結(jié)果的分析與解釋；胡文勝進行論文的修訂，負責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校。

本文無利益沖突。