黃曉欣，談嘉莉，楊永星，顧哲銘，李雪珽，雷曉凌

（1. 廣東海洋大學(xué) 食品科技學(xué)院/廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省海洋食品工程技術(shù)研究中心/廣東省海洋生物制品工程實(shí)驗(yàn)室/水產(chǎn)品深加工廣東普通高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524088;2. 海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心/大連工業(yè)大學(xué)，遼寧 大連 116034）

微生物生長環(huán)境多樣，在生物進(jìn)化過程中形成了自己獨(dú)特的生長代謝機(jī)制。耐熱真菌是一類最高生長溫度在50℃左右（通常為40℃或40℃以上），最低生長溫度在20℃以下的特殊真菌類群[1]，極端環(huán)境（高溫、低溫、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、高鹽等）微生物有自己特定的代謝方式、獨(dú)特基因類型及特殊生理機(jī)制，耐熱真菌是可以在高溫條件下生長的適應(yīng)極端環(huán)境的真核微生物，其特殊生長代謝機(jī)制使產(chǎn)生特殊代謝產(chǎn)物、獲取新生物技術(shù)手段成為可能[2]。耐熱真菌的分布范圍廣泛，世界上已描述和報(bào)道的耐熱真菌有89種，我國報(bào)道的有23種[3]。Salar等[4]從印度北部的溫帶土壤中分離出19種嗜熱和耐熱真菌。Michele等[5]從番石榴葉中分離得到1株耐熱真菌擬青霉（Paecilomyces variotii），并從擬青霉中分離出以55℃為最適反應(yīng)溫度，pH為5.0的熱穩(wěn)定性糖化酶。詹發(fā)強(qiáng)等[6]從新疆棉花秸稈高溫堆肥中分離得到的耐熱真菌Z1、Z2在降解農(nóng)作物廢棄秸稈中具有較高的應(yīng)用價值。耐熱真菌的生理生長特點(diǎn)是耐熱性（最高溫度、最適溫度、最低溫度），這是區(qū)分耐熱真菌與非耐熱真菌的重要依據(jù)[2]。另外，通過菌株分離經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定等手段對耐熱真菌的種類鑒別意義重大。目前對于耐熱真菌的研究國內(nèi)外把重心放在菌種鑒定和生理特性研究上，而對產(chǎn)物活性研究報(bào)道不多。由于生長環(huán)境的不同，來源各異的耐熱菌存在特有的生長溫度、pH值、鹽濃度等的耐受性和其發(fā)酵產(chǎn)物的抗菌活性之間會有較大不同，深入研究可豐富相關(guān)基礎(chǔ)理論。

我國國土面積遼闊，氣候類型豐富多樣，為耐熱真菌提供良好生長環(huán)境。湖光巖瑪珥湖位于廣東省湛江市湖光巖風(fēng)景區(qū)內(nèi)，是經(jīng)火山噴發(fā)而形成的獨(dú)特湖泊，其受外界干擾小，特殊的生境為生物進(jìn)化形成新菌種提供可能。秦青英等[7]研究湖光巖瑪珥湖浮游細(xì)菌組成時發(fā)現(xiàn)其菌落結(jié)構(gòu)較為獨(dú)特，微生物資源豐富且新穎。劉穎等[8]分離了湖光巖土壤放線菌，并測定了其抗菌活性，分離出23株菌，且其中60.9%有抗菌活性。耐熱真菌的來源多種多樣，這表明極有可能從湖光巖獨(dú)特的地理環(huán)境中發(fā)現(xiàn)耐熱真菌。耐熱真菌有產(chǎn)酶等方面潛力，故以湖光巖瑪珥湖為開發(fā)來源的菌株的特殊功能和活性值得探究和開發(fā)。本研究以廣東省湛江市湖光巖瑪珥湖分離得到1株耐熱真菌HS1-1為出發(fā)菌株，對該菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)及分子水平鑒定，研究其生理特性，產(chǎn)酶能力及抗菌活性，以期為對該菌的進(jìn)一步研究與開發(fā)提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 2020年11月3日從湛江市湖光巖風(fēng)景區(qū)距離湖面1～2 m的岸上5～15 cm深度采集的土壤中分離獲得菌株，經(jīng)44℃初篩和19℃復(fù)篩[9-10]，確定為耐熱真菌。在取樣分離中以耐熱真菌條件共分離4株耐熱真菌， 選擇其中的HS1-1菌株為供試菌株。

抗菌活性指示菌：交替假單胞菌屬SL-1（Pseudoalteromonassp.，登錄號：FJ404757.1）、吉氏庫特氏菌屬SL-2（Kurthia gibsoniistrain，登錄號：EF032685.1）均為筆者所在的課題組從冷凍蝦仁中分離鑒定保存的優(yōu)勢腐敗菌；大腸桿菌（Escherichia coli）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）均為筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存的菌。

1.2 培養(yǎng)基來源 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；馬鈴薯葡萄糖肉湯（PDB）：杭州微生物試劑有限公司；改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；改良馬丁培養(yǎng)基：北京陸橋技術(shù)股份有限公司；營養(yǎng)瓊脂：北京陸橋技術(shù)股份有限公司。淀粉酶培養(yǎng)基[11]、糖苷酶培養(yǎng)基[12]、纖維素酶培養(yǎng)基[13]、殼聚糖酶培養(yǎng)基[14]4種產(chǎn)酶篩選培養(yǎng)基配制方法參照文獻(xiàn)并稍作修改，具體配方見表1。

表1 產(chǎn)酶培養(yǎng)基

1.3 耐熱真菌HS1-1的鑒定 用點(diǎn)植法將菌株HS1-1分別接種于PDA和改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基中，于35℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～5 d，觀察菌落形態(tài)特征。

從培養(yǎng)基挑取少許菌絲，用乳酸石炭酸綿藍(lán)染液染色，壓片法鏡檢，初步鑒定菌株[15]并完成的個體形態(tài)觀察。

將活化到第三代的菌株HS1-1送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行PCR擴(kuò)增、測序，完成分子鑒定。分子鑒定的具體內(nèi)容：分子生物學(xué)鑒定即采用內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）測序的方法，選用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′），采用菌落PCR的方法對篩選得到的耐熱真菌HS1-1的ITS序列進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系：引物ITS1和ITS4各1 μL，10 X PCR Buffer、dNTP(each 10 mmol·L-1)、TaqPlus DNA Polymerase（5 U·μL-1）共12.5 μL，50 mmol·L-1MgSO4和Template (DNA)各1 μL，ddH2O 9.5 μL，總體積為25 μL；PCR擴(kuò)增條件：95℃ 5 min；94℃ 30 s，57℃30 s，72℃ 90 s，共30次循環(huán)；72℃ 10 min。將PCR產(chǎn)物的測序結(jié)果用NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST對比分析，查找親緣性近、相似性高的菌株基因序列。采用MEGA 7軟件中N-J法（neighbor-joining method）自舉1 000次，確定菌種種屬并建立系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 耐熱真菌HS1-1的生理特性研究

1.4.1 溫度對菌株生長的影響 采用點(diǎn)植法將菌株接種于改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基中，倒置于15、20、25、30、35、40、45、50℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d，于HH.S11-2電熱恒溫水浴鍋55℃培養(yǎng)7 d，每個溫度條件設(shè)置3個平行，采用十字交叉法測量菌落直徑并觀察菌落形態(tài)。

1.4.2 鹽濃度對菌株生長的影響 在改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基中分別加入0、1%、2%、3%、4%、5%、6%、8%、10%的NaCl，用點(diǎn)植法接種菌株于培養(yǎng)基上，并置于35℃下培養(yǎng)，每個鹽濃度設(shè)置3個平行，測量菌落直徑并觀察菌落形態(tài)。

1.4.3 pH對菌株生長的影響 調(diào)節(jié)改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基的pH為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0。用點(diǎn)植法接種菌株于培養(yǎng)基上，并置于35℃下培養(yǎng)，每個梯度設(shè)置3個平行重復(fù)，測量菌落直徑及觀察菌落形態(tài)。

1.5 耐熱真菌HS1-1的產(chǎn)酶特性研究 將菌株HS1-1分別接種到4種產(chǎn)酶篩選培養(yǎng)基中，倒置于恒溫培養(yǎng)箱中35℃培養(yǎng)3～7 d，每種產(chǎn)酶培養(yǎng)基做3個平行。殼聚糖酶培養(yǎng)基能力的確定是通過觀察菌落周圍是否產(chǎn)生透明圈[14]，淀粉酶結(jié)果通過碘液染色觀察水解圈的大小來確定；檢測糖苷酶以菌落周圍有無藍(lán)色產(chǎn)生為依據(jù)，有則說明有產(chǎn)糖苷酶的能力，反之，則無。纖維素酶培養(yǎng)基需要用95%乙醇配制的0.1%剛果紅染色液染色，再用1 mol·L-1氯化鈉脫色，染色和脫色時間均為1 h[16]，觀察是否出現(xiàn)脫色圈。

1.6 耐熱真菌HS1-1的抗菌活性測定 將活化好的菌株HS1-1挑取一環(huán)分別接種到裝有100 mL PDB和改良馬丁培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，35℃，135 r·min-1搖床（HZQ-F160振蕩培養(yǎng)箱）培養(yǎng)7 d，經(jīng)真空抽濾和微孔濾膜過濾后，取部分發(fā)酵液，用N-1100D-WB旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮5倍，發(fā)酵原液和濃縮液均用于抗菌活性測定。

抗菌活性測定： 挑取活化好的指示菌，接種到生理鹽水中，振蕩均勻并稀釋不同倍數(shù)，制備成OD600值為0.6的菌懸液[17]。在提前制備好的素瓊脂平板中放好無菌牛津杯，倒入含有1∶100比例菌懸液的營養(yǎng)瓊脂，待凝固后拔出牛津杯并注入100 μL發(fā)酵液或發(fā)酵濃縮液，于4℃冰箱中擴(kuò)散3～4 h[18]，置于37℃培養(yǎng)24 h并測量抑菌圈直徑，抑菌圈直徑算上牛津杯直徑（牛津杯直徑為7.8 mm），無抑菌圈以牛津杯直徑計(jì)。

1.7 數(shù)據(jù)處理 對菌落直徑、抑菌圈直徑等數(shù)據(jù)均利用JMP Pro軟件進(jìn)行顯著性差異分析。取顯著性水平α為0.05，通過單因素方差分析，用所有對Tukey HSD來比較均值，P<0.05表示有顯著性差異，用不同英文字母表示具有顯著性差異，最后采用Origin軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐熱真菌HS1-1的形態(tài)學(xué)及分子鑒定

2.1.1 菌落形態(tài)觀察 耐熱真菌HS1-1在PDA和改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基上均能生長，且在改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基上生長較為良好，因而用改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基作為菌株培養(yǎng)的最適固體培養(yǎng)基。從圖1可見，35℃培養(yǎng)2～3 d的菌落形態(tài)觀察中發(fā)現(xiàn)菌落圓形平坦，菌絲自中央向外周延展，由致密到疏松，菌絲發(fā)達(dá)呈米黃色，有放射性皺褶和暈圈。隨著不同培養(yǎng)天數(shù)、pH、溫度和鹽濃度變化，菌落呈現(xiàn)輕微顏色差別，或煙綠色或米黃色。

圖1 改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基2 d菌落形態(tài)

2.1.2 個體形態(tài)觀察 經(jīng)顯微鏡觀察（圖2）發(fā)現(xiàn)，菌株HS1-1培養(yǎng)2 d后菌絲透明且顯青色，有分生孢子梗和分生孢子頭，頂囊成燒瓶狀，直徑約20 μm，小梗單層排列，成木柵狀，孢子為球型，直徑約2.5 μm。初步鑒定菌株HS1-1為曲霉屬。王世苗等[19]觀察煙曲霉呈絨狀，顏色為暗煙綠色；電子顯微鏡結(jié)果觀察到球形、綠色的分生孢子，分生孢子梗光滑，頂囊呈燒瓶狀，與本研究菌株相似。

圖2 菌株HS1-1分生孢子頭形態(tài)（10×40）

2.1.3 分子鑒定 經(jīng)基因組DNA提取，PCR擴(kuò)增和凝膠電泳觀察，菌株HS1-1在500～600 bp有清晰條帶。提交ITS序列至GenBank獲得登錄號，利用BLAST進(jìn)行同源性對比分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）。HS1-1（登錄號為MZ413293）與Aspergillus fumigatusIR-SGS-Y5聚在同一分支上，遺傳進(jìn)化距離相近。結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察和分子鑒定，確定該耐熱真菌為煙曲霉。

圖3 NJ法構(gòu)建HS1-1的ITS序列系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 耐熱真菌HS1-1的生理特性研究

2.2.1 生長溫度特性 不同溫度條件下菌株生長情況見圖4。菌株HS1-1在15～50℃的溫度范圍內(nèi)均能生長，15℃生長最緩慢，55℃則無法生長。從1～3 d可看出，40℃時生長速度明顯高于其他溫度，其次是35℃，因此該菌最適生長溫度為40℃，該菌在生長溫度范圍內(nèi)的生長能力強(qiáng)弱順序?yàn)?0℃、35℃、45℃、30℃、25℃、50℃、20℃、15℃。最適溫度是40℃，50℃仍能生長，具有明顯耐熱性，為耐熱真菌。煙曲霉最適生長溫度一般為37℃[20]，有研究發(fā)現(xiàn)煙曲霉在37℃培養(yǎng)時菌落直徑最大，且在50℃、55℃仍能生長[21]，這與本研究生長情況相似。觀察不同溫度菌落形態(tài)，在設(shè)置的溫度范圍內(nèi)，較高或者較低溫度條件下菌絲附著能力減弱，孢子易脫落，菌落溝紋加深，顏色較淺。

圖4 不同溫度條件對菌株HS1-1生長的影響

2.2.2 不同鹽濃度對菌株HS1-1的影響 菌株HS1-1在不同鹽濃度的生長情況見表2。在35℃時菌株在0～10%的鹽濃度范圍內(nèi)均能生長，2～3 d時1%～2%鹽濃度明顯優(yōu)于其他組，4 d時鹽濃度0～4%的菌落直徑均大于84.3 mm，接近平板直徑。故該菌適宜鹽濃度范圍為0～4%，最佳生長鹽濃度是1%～2%，具備一定耐鹽性。觀察菌株第7天的生長形態(tài)發(fā)現(xiàn)，不同鹽濃度的菌落形態(tài)差異不大，菌落中央向外周擴(kuò)散呈現(xiàn)黃色由深變淺。

表2 不同鹽濃度對菌株HS1-1生長的影響

2.2.3 不同pH對菌株HS1-1的影響 不同pH條件下菌株生長情況見表3。該菌在pH為3～12的范圍內(nèi)均能生長，pH在6～9時長勢良好，pH2時菌株不生長。1～4 d時pH為6和7時菌落直徑顯著大于其他pH（P<0.05），表明該菌最適宜pH范圍為6～7，且適應(yīng)酸堿范圍廣，具有極強(qiáng)耐酸堿能力。對比酸性條件（pH2～pH3），菌株在較堿性條件（pH11～pH12）生長更具優(yōu)勢，說明耐強(qiáng)堿能力強(qiáng)。不同pH菌落形態(tài)各異（圖5），pH3倒置培養(yǎng)時觀察到菌落中央向下生長，呈突起狀。pH為3～5時，菌落顏色較深，褶皺明顯，菌落邊緣不規(guī)整；pH≥6時，菌落顏色較淺，褶皺較少或無褶皺，菌落多呈圓形。

圖5 HS1-1在不同pH條件下第7天菌落形態(tài)

2.3 耐熱真菌HS1-1的產(chǎn)酶特性 耐熱真菌HS1-1在不同產(chǎn)酶篩選培養(yǎng)基的菌落生長情況見圖6。微生物不能直接利用淀粉、蛋白質(zhì)和脂肪等大分子，必須依靠產(chǎn)生的胞外酶將大分子物質(zhì)分解后才能利用。菌株在4種產(chǎn)酶培養(yǎng)基上均能生長，說明該菌能產(chǎn)生相應(yīng)的酶并以可溶性淀粉、乳糖、羧甲基纖維素和殼聚糖作為唯一碳源供自身生長，且利用可溶性淀粉、乳糖和羧甲基纖維素的能力較強(qiáng)，利用殼聚糖的能力較弱。

圖6 HS1-1在不同產(chǎn)酶篩選培養(yǎng)基生長情況

2.4 耐熱真菌HS1-1的抗菌活性 菌株HS1-1在PDB和改良馬丁培養(yǎng)基上所得的發(fā)酵液及發(fā)酵濃縮液（5倍濃縮）的抗菌情況見表4。該菌的PDB發(fā)酵產(chǎn)物對5種革蘭氏陰性和革蘭氏陽性菌均無明顯抑制效果；PDB發(fā)酵液經(jīng)5倍濃縮后均產(chǎn)生抑菌圈，推斷可能由于抑菌活性物質(zhì)富集而出現(xiàn)明顯抑菌效果；在改良馬丁培養(yǎng)基所得的發(fā)酵液對SL-1、大腸桿菌、銅綠假單胞菌、SL-2均有抗菌活性，而對金黃色葡萄球菌無明顯抗菌活性；改良馬丁培養(yǎng)基發(fā)酵液經(jīng)5倍濃縮后，以SL-1為指示菌時抑菌效果減弱，可能是在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)過程中高溫（50℃）破壞了部分抑制SL-1指示菌的活性成分，但其他指示菌的結(jié)果顯示抑菌效果都增強(qiáng)了。

表4 不同培養(yǎng)基發(fā)酵液與發(fā)酵濃縮液抗菌活性比較

3 討 論

本研究以1株湖光巖瑪珥湖來源的耐熱真菌HS1-1為研究對象，觀察其菌落特征，以菌絲形態(tài)、孢子、頂囊等特征初步判斷該菌為煙曲霉，結(jié)合分子水平鑒定確定該菌為煙曲霉。不同溫度、鹽濃度、pH條件下菌株的生長研究結(jié)果表明，耐熱煙曲霉HS1-1溫度生長范圍較廣，15～50℃均能生長，有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)煙曲霉在30～42℃都能較好生長[22]，這與本研究結(jié)果相符合，后續(xù)實(shí)驗(yàn)可以繼續(xù)補(bǔ)充探究15℃以下溫度條件以探究該菌的最低生長溫度。張晉卿等[23]發(fā)現(xiàn)煙曲霉AF293在酵母浸膏培養(yǎng)基中的最適宜生長溫度是37℃,而在改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基中耐熱煙曲霉HS1-1的最適生長溫度在40℃，說明湖光巖瑪珥湖來源的煙曲霉在特定適宜培養(yǎng)基上有更高的最適生長溫度，且在高溫條件下更具生長優(yōu)勢。菌株HS1-1的最適鹽濃度范圍在1%～2%，根據(jù)其對鹽濃度的適應(yīng)性，說明該菌屬于弱嗜鹽微生物。吳嘉鑫等[17]對1株海洋耐熱真菌C051進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)菌株C051在pH為3～9范圍內(nèi)均可以生長，而耐熱真菌HS1-1在pH為3～12的范圍內(nèi)均能生長，相比之下湖光巖來源菌株HS1-1能適應(yīng)較廣的酸堿環(huán)境，有較強(qiáng)抗逆性，并且對堿性環(huán)境的抗性更強(qiáng)，這可能是由于湖光巖特殊的環(huán)境所造就的，生物的特性更具有多樣化。有研究人員從不同堿性生境分離出多株真菌，并從其次生代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)多種新穎結(jié)構(gòu)化合物[24]，HS1-1在pH為12時仍能生長，說明耐熱真菌HS1-1可以適應(yīng)堿性生境，研究其次級代謝產(chǎn)物將有希望發(fā)現(xiàn)新穎結(jié)構(gòu)的化合物。

產(chǎn)酶研究發(fā)現(xiàn)該菌株周圍無產(chǎn)生水解圈和特定顏色變化，這可能與該菌株酶的分泌能力和生理特性有關(guān)。郭瀟等[25]在研究湖光巖細(xì)菌的纖維素酶降解活性也出現(xiàn)了這一現(xiàn)象。猜測該方法測定下菌株產(chǎn)生水解酶的量不多，在菌株生長的同時培養(yǎng)基的透明圈現(xiàn)象已被菌體生長所覆蓋。后續(xù)如做進(jìn)一步研究，可以考慮濃縮粗酶液于特定產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，具體參照Chirom等[26]的方法稍加修改來更加明確該菌的產(chǎn)酶特性。

抗菌活性是微生物研究的熱點(diǎn)，近年來研究人員致力于為抗菌物質(zhì)開發(fā)提供新手段和新渠道，倪孟祥等[27]從北極海泥中分離得到的其中1株菌株H5被鑒定為煙曲霉屬且其發(fā)酵液對細(xì)菌、真菌和耐藥菌有不同抑制活性。本研究也探究了對幾種常見革蘭氏陽性和陰性菌的拮抗性，耐熱真菌具有生長快的特點(diǎn)，下一步擬對菌株HS1-1的其他抗菌活性及生物活性進(jìn)行研究，為該菌的開發(fā)利用提供基礎(chǔ)。