董 媛,李佳璐,王 宇,張曉莉

跨膜和螺旋結構域1(transmembrane and coiled-coil domains 1,TMCO1)是一種高度保守的跨膜蛋白,位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。作為一種鈣離子選擇性陽離子通道,TMCO1被發(fā)現(xiàn)能夠防止內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中細胞內(nèi)鈣庫過度充盈,并維持鈣穩(wěn)態(tài)[1]。TMCO1與腦面胸骨骼發(fā)育和青光眼有關[2,3]。文獻[4]表明,TMCO1在結腸癌中是一種新型的腫瘤促進因子,iASPP-TMCO1 軸抑制促進細胞溶質(zhì)鈣離子超載誘導的凋亡細胞死亡,減少體外和體內(nèi)腫瘤的生長。TMCO1與肺腺癌(lung adenocarcinoma,LUAD)治療有潛在相關性,抑制 TMCO1 表達水平可負調(diào)控肺腺癌細胞A549的凋亡和遷移[5]。此外,TMCO1被發(fā)現(xiàn)能夠維持顆粒細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的鈣離子穩(wěn)態(tài),TMCO1的破壞能夠?qū)е聝?nèi)質(zhì)網(wǎng)應激介導的細胞凋亡和活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平增加,從而導致卵巢的卵泡發(fā)育受損[6]。本研究綜合利用多種數(shù)據(jù)庫分析泛癌組織中TMCO1的表達水平差異,初步探討其對腫瘤預后的預測價值及其與腫瘤相關免疫反應的關聯(lián),為明確潛在的腫瘤免疫治療靶點提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 TMCO1基因表達量 TIMER2.0(http://timer.cistrome.org/)是分析不同癌癥類型的免疫浸潤及基因差異表達的網(wǎng)站[7],可以分析33種腫瘤中TMCO1的表達。GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn/)是基于TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫的一個新開發(fā)和交互式網(wǎng)絡服務器,能夠獲取不同分子在正常樣本和癌癥樣本中的差異表達情況[8]。GEPIA用于補充TIMER的數(shù)據(jù)。

1.2 與預后指標相關性 在GEPIA數(shù)據(jù)庫(http://gepia.cancer-pku. cn/)中獲取臨床資料,將樣本以基因表達中位數(shù)分為高低表達組,并分析TMCO1與腫瘤總生存期(overall survival,OS)和無復發(fā)生存期(relapse free survival,RFS)相關性,同時計算log-rankP值、95%置信區(qū)間(CI)和風險比率(HRs)。從UCSC(https://xenabrowser.net/)數(shù)據(jù)庫中下載經(jīng)統(tǒng)一標準化的泛癌數(shù)據(jù)集:TCGA TARGET GTEx (PANCAN,N=19131,G=60499),進一步從中提取TMCO1基因在各個樣本中的表達數(shù)據(jù),對每一個表達值進行l(wèi)og2(x+0.001)變換,剔除樣本數(shù)小于10個的癌種后進行可視化和統(tǒng)計學分析。

1.3 與免疫細胞浸潤及免疫檢查點基因表達相關性 通過sangerbox數(shù)據(jù)庫(http://sangerbox.com/Tool)探索TMCO1表達與腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment,TME)中免疫檢查點基因(immune checkpoint,ICP)相關性。根據(jù)先前研究選擇免疫檢查點基因[9]。本研究通過TIMER2.0數(shù)據(jù)庫下載38種癌癥的6種免疫細胞的評分數(shù)據(jù),分析其與TMCO1表達的免疫細胞評分相關性,使用R軟件包psych(version 2.1.6)的corr.test函數(shù)計算各個腫瘤中基因與免疫細胞浸潤評分的相關性并進行可視化。

1.4 在腫瘤相關基因的功能富集分析 在String蛋白網(wǎng)絡平臺(https://string-db.org/)收集蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用信息,包括TMCO1經(jīng)實驗評估的40個結合蛋白。從GEPIA數(shù)據(jù)庫(http://gepia.cancer-pku.cn/)中收集并分析100個TMCO1共表達基因,最終展示6個與TMCO1相關性最強的分子,結果以散點圖和熱圖表示。通過基因本體論數(shù)據(jù)庫(gene ontology,GO)和京都基因與基因組數(shù)據(jù)庫(kyoto encyclopedia of gene and genomes,KEGG)將上文得到的140個TMCO1的潛在相關分子進行富集分析。二者分析均通過R語言實現(xiàn)。

2 結 果

2.1 泛癌中TMCO1的mRNA和蛋白差異表達 結果顯示,在33種腫瘤中,TMCO1 mRNA表達量在膀胱尿路上皮癌、乳腺浸潤癌、膽管癌、食管癌、頭頸鱗狀細胞癌、肝細胞肝癌、肺腺癌、肺鱗癌和胃癌中表達較正常組織顯著升高(圖1A)。GEPIA數(shù)據(jù)庫為TIMER2.0數(shù)據(jù)庫中沒有配對的正常組織癌癥的補充結果。結果顯示,TMCO1 mRNA在彌漫性大B細胞淋巴瘤、腦低級別膠質(zhì)瘤、卵巢漿液性囊腺癌、皮膚黑色素瘤、胸腺癌中表達顯著升高(圖1B)。

圖1 TMCO1在泛癌中的表達差異

2.2 泛癌中TMCO1預后價值 GEPIA數(shù)據(jù)庫分析了基因表達與腫瘤的預后關系,其中TMCO1高表達與宮頸鱗癌、腺癌和肺腺癌的OS和RFS均相關(圖2A);TMCO1高表達與頭頸鱗狀細胞癌和腦低級別膠質(zhì)瘤的腫瘤OS相關,TMCO1低表達與腎透明細胞癌的OS相關。TMCO1高表達與膀胱尿路上皮癌和腎乳頭狀細胞癌的RFS相關(圖2B)。單因素Cox回歸分析函數(shù)分析基因表達與每個腫瘤的預后關系,結果顯示在膠質(zhì)瘤、腦低級別膠質(zhì)瘤、急性髓細胞樣白血病、乳腺浸潤癌、宮頸鱗癌和腺癌、腎乳頭狀細胞癌、頭頸鱗狀細胞癌、肝細胞肝癌、神經(jīng)母細胞瘤、葡萄膜黑色素瘤、白血病、嗜鉻細胞瘤和副神經(jīng)節(jié)瘤、腎上腺皮質(zhì)癌中,TMCO1高表達提示較差預后;在腎透明細胞癌中,TMCO1低表達提示較差預后。森林圖結果與GEPIA結果趨勢相同(圖3)。

2.3 與人類癌癥的免疫檢查點基因、免疫浸潤細胞的相關性 免疫檢查點基因(ICPA)對免疫細胞浸潤和免疫治療有較大影響[10]。本研究發(fā)現(xiàn)TMCO1表達密切相關的多種癌癥類型,如葡萄膜黑色素瘤、卵巢漿液性囊腺癌、混合腎癌、睪丸癌、乳腺浸潤癌、肺腺癌、胸腺癌、腎乳頭狀細胞癌、子宮內(nèi)膜癌、頭頸鱗狀細胞癌、肝細胞肝癌、黑色素瘤、腎透明細胞癌、前列腺癌、甲狀腺癌、膠質(zhì)瘤、腦低級別膠質(zhì)瘤、結腸癌、結直腸癌和膀胱尿路上皮癌。其中,TMCO1表達與葡萄膜黑色素瘤、卵巢漿液性囊腺癌、混合腎癌、腦低級別膠質(zhì)瘤、膠質(zhì)瘤的免疫檢查點呈正相關。以葡萄膜黑色素瘤為例,TMCO1與其50個免疫檢查點相關。TMCO1表達與睪丸癌和肺腺癌的免疫檢查點呈負相關(圖4)。以上表明TMCO1可能在不同的信號轉導途徑中協(xié)調(diào)ICP基因活性,并有可能成為免疫治療靶點。TMCO1高表達可能預示著針對ICP基因的免疫療法取得更好的治療效果。本研究通過sangerbox網(wǎng)站(http://sangerbox.com/Tool)探索了TMCO1表達與人類癌癥TME中6種免疫細胞的相關性,最終獲得38個腫瘤的6種免疫細胞浸潤評分,發(fā)現(xiàn)TMCO1與34個癌種存在顯著相關。TMCO1與21種腫瘤的B細胞、19種腫瘤的CD4+細胞、19種腫瘤的CD8+細胞、22種腫瘤的中性粒細胞、17種腫瘤的巨噬細胞和20種腫瘤的樹突狀細胞有較強關聯(lián)性(圖5)。

2.4 共表達網(wǎng)絡與免疫反應相關 用String獲得TMCO1結合蛋白并做成互作網(wǎng)絡圖(圖6A),通過GEPIA獲得100個TMCO1相關基因,并進行相關性分析。其中6個代表性靶基因在TMCO1表達中與多種腫瘤呈正相關(圖6B、C)。使用GO和KEGG對TMCO1結合與共表達基因進行富集分析。結果顯示,TMCO1共表達基因與霍亂弧菌感染、蛋白質(zhì)輸出、核糖體等信號通路相關,TMCO1共表達基因與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)靶向蛋白、SRP-依賴的靶向膜的共翻譯蛋白、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)定位的建立等密切相關(圖6D)。

A.TMCO1在宮頸癌和肺腺癌中的生存曲線;B.TMCO1在頭頸鱗癌、腦低級別膠質(zhì)瘤和腎透明細胞癌的OS曲線,在膀胱尿路上皮癌和腎乳頭狀細胞癌的RFS曲線。

3 討 論

TMCO1是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白,其作用于內(nèi)質(zhì)網(wǎng),防止細胞內(nèi)鈣庫過度充盈,維持鈣穩(wěn)態(tài)。近年研究發(fā)現(xiàn),TMCO1可通過多種途徑影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。本文研究了TMCO1在泛癌表達、預后、免疫檢查點和免疫細胞浸潤方面的相關性,收集其共表達基因及相關蛋白并進行富集分析,發(fā)現(xiàn)TMCO1可能與腫瘤免疫調(diào)節(jié)有關,或因此成為潛在的預后預測因子。

本研究首先使用GEPIA數(shù)據(jù)庫及TIMER2.0數(shù)據(jù)庫分析TMCO1在泛癌中的表達水平。TIMER2.0數(shù)據(jù)庫結果表明,TMCO1在膀胱尿路上皮癌、乳腺浸潤癌、膽管癌、食管癌、頭頸鱗狀細胞癌、肺腺癌、肺鱗癌和胃癌中表達較正常組織顯著升高。GEPIA補充了沒有配對正常組織的癌癥的差異結果。結果顯示,TMCO1在彌漫性大B細胞淋巴瘤、腦低級別膠質(zhì)瘤、卵巢漿液性囊腺癌、皮膚黑色素瘤和胸腺癌中表達顯著升高。預后分析顯示,TMCO1高表達與宮頸鱗癌、腺癌和肺腺癌的OS和RFS相關,與頭頸鱗狀細胞癌和腦低級別膠質(zhì)瘤的OS相關,與膀胱尿路上皮癌和腎乳頭狀細胞癌的RFS相關;TMCO1低表達與腎透明細胞癌的OS相關。綜合各類數(shù)據(jù)庫分析結果,TMCO1在肺腺癌、宮頸鱗癌和腺癌、頭頸鱗狀細胞癌、腦低級別膠質(zhì)瘤、膀胱尿路上皮癌和腎乳頭細胞癌中高表達預后較差,TMCO1在腎透明細胞癌中高表達預后好?；谏鲜鼋Y果我們推測TMCO1表達量可能與腫瘤預后有一定相關性。

圖5 TMCO1表達與免疫浸潤相關性

與傳統(tǒng)的化療和靶向治療相比,免疫檢查點抑制劑(immune checkpoint inhibitors,ICIs)可以阻斷免疫檢查點基因,緩解腫瘤細胞對免疫細胞的抑制作用,并在增強對癌細胞的免疫反應方面具有持久的效果和療效。常見的ICIs如PD-1/PD-L1的療效已在多種腫瘤中被驗證[11]。本文研究了TMCO1表達與免疫檢查點基因表達的相關性,結果提示TMCO1可能通過調(diào)節(jié)特定免疫檢查點基因表達來調(diào)節(jié)腫瘤免疫模式。TMCO1在葡萄膜黑色素瘤中上調(diào),高表達的TMCO1與免疫檢查點基因HMGB1、TNFSF4、BTN3A1、CXCL10的表達正相關;TMCO1在OV中上調(diào),高表達的TMCO1與免疫檢查點基因HMGB1、ENTPD1、BTN3A1、BTN3A2等表達正相關;TMCO1在DLBC中上調(diào),高表達的TMCO1與免疫檢查點基因TLR4、BTN3A1、ENTPD1、TNFSF4等表達正相關。這提示高表達TMCO1的腫瘤中,阻斷特定免疫檢查點或為免疫治療提供新思路。

腫瘤微環(huán)境被認為是影響腫瘤預后的重要因素,并為腫瘤免疫治療提供指導幫助[12]。癌細胞與各種腫瘤浸潤淋巴細胞之間的相互作用是腫瘤微環(huán)境重要組成部分,通過促進腫瘤免疫逃逸來促進腫瘤進展[13]。本文研究了TMCO1與免疫細胞的相關性發(fā)現(xiàn)TMCO1與34個癌種存在顯著相關。其中,TMCO1與21種腫瘤B細胞、19種腫瘤CD4+細胞、19種腫瘤CD8+細胞、22種腫瘤中性粒細胞、17種腫瘤巨噬細胞和20種腫瘤的樹突狀細胞有較強相關性。該結果提示,TMCO1與中性粒細胞為主的免疫細胞浸潤有關,其可能成為泛癌預后生物標志物。作為抵御病原體的首道防線,中性粒細胞可能與先天和適應性免疫系統(tǒng)的組成部分互相作用,參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[14,15]。腫瘤相關中性粒細胞(tumor associated neutrophils,TANs)是一組依賴于腫瘤的、不同種類的中性粒細胞,其對腫瘤發(fā)展有雙重作用[16]。在結直腸癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、膽管癌、肝細胞癌和宮頸癌等癌種中發(fā)現(xiàn),其對腫瘤發(fā)生發(fā)展有促進作用[17-22],這與高表達TMCO1預測較差腫瘤預后的腫瘤結果部分重合。因此推測TMCO1與中性粒細胞作用顯著相關潛在機制可能與TANs有關,這能夠為靶向免疫治療提供新思路。

圖6 TMCO1表達與人類癌癥共表達網(wǎng)絡相關性

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激出現(xiàn)于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能受損時,其具體表現(xiàn)為錯誤折疊、未折疊的蛋白質(zhì)(UPR)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)小室內(nèi)積聚和細胞內(nèi)鈣離子紊亂[23]。UPR已被證實能夠介導腫瘤與非腫瘤之間的串擾[24]。TMCO1已確定為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子泄露通道,丟失后可能導致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣儲存鈣超載和細胞內(nèi)游離鈣增加[25]。TMCO1在腫瘤中與激活轉錄因子6(ATF6)、染色體1開放閱讀框43(C1orf43)、SCY1 樣假激酶 3(SCYL3)、琥珀酸脫氫酶復合亞基C(SDHC)、TOR 信號通路調(diào)節(jié)因子樣蛋白(TIPRL)、U2 相關因子同源基序激酶 1(UHMK1)的表達呈顯著正相關關系。ATF6是一種II型跨膜糖蛋白,它能夠通過減少對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的壓力來保護胰腺β細胞[26],是參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的重要成員之一。此外,ATF6介導的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激已經(jīng)導致多種癌癥的發(fā)生[27,28]。提示了TMCO1發(fā)揮作用可能與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激有關。SDHC被報道在乳腺癌中成為藥物開發(fā)有吸引力的靶標[29]。這為研究TMCO1在腫瘤中差異表達的機制提供了可能方向。TMCO1表達在多腫瘤中與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)靶向蛋白、SRP依賴的靶向膜的共翻譯蛋白、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白的定位建立等密切相關,并與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)靶向蛋白、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)定位的建立相關[30,31],說明其可能參與了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激過程。目前TMCO1與SRP依賴的靶向膜的共翻譯蛋白關聯(lián)尚未有報道,其調(diào)控機制有待于進一步闡明。

綜上所述,筆者認為TMCO1在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)因子作用,該過程可能與中性粒細胞有關,TMCO1可能成為未來的腫瘤預后預測因子。