馬聰聰,陸紅祥,馬筱潔,史清海

1.新疆醫(yī)科大學研究生院,烏魯木齊 830054; 2.新疆軍區(qū)總醫(yī)院全軍臨床檢驗診斷中心,烏魯木齊 830000; 3.新疆軍區(qū)總醫(yī)院創(chuàng)傷骨科,烏魯木齊 830000; 4.新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院輸血科,烏魯木齊 830001

創(chuàng)傷是45歲以下人群的主要死亡原因。膿毒癥是創(chuàng)傷后期相關死亡的主要原因,被定義為由宿主對感染的反應失調引起危及生命的器官功能障礙[1-2]。創(chuàng)傷后膿毒癥增加了重癥患者的病死風險,創(chuàng)傷后膿毒癥的及時診斷和適當治療對于改善創(chuàng)傷患者的住院結局至關重要[3-4]。因此,探尋可能影響創(chuàng)傷后膿毒癥發(fā)生風險的關鍵分子及防治新靶標對提高嚴重創(chuàng)傷患者預后具有重要的臨床意義。

目前C反應蛋白(C-reaction protein,CRP)、白介素6(interleukin-6,IL-6)和降鈣素原(procalcitonin,PCT)作為非特異性炎癥標志物在膿毒癥的早期診斷中被廣泛應用,但其特異性一直飽受爭議[5-6]。特別在創(chuàng)傷患者中,早期CRP和血漿IL-6水平升高對膿毒癥的診斷意義不大。膜聯(lián)蛋白A3(annexin A3,ANXA3)是膜聯(lián)蛋白家族成員之一,屬于Ca2+依賴性磷脂和膜結合蛋白[7-8]。研究表明,該家族參與多種生物學過程,在細胞發(fā)育及信號轉導過程中具有重要作用[9]。ANXA3參與中性粒細胞的細胞內膜融合和顆粒聚集,在氧化應激、免疫炎癥反應中發(fā)揮重要作用。Toufiq等[10]系統(tǒng)分析了6個數(shù)據(jù)集中ANXA3的表達變化,分析結果發(fā)現(xiàn)ANXA3在膿毒癥患者中表達升高。同時,Yao等[11]發(fā)現(xiàn)ANXA3可鑒別膿毒癥和非膿毒癥患兒。但目前還沒有研究報道ANXA3在創(chuàng)傷后膿毒癥患者中的表達變化,同時ANXA3在創(chuàng)傷后膿毒癥患者中發(fā)揮作用的功能機制尚未見報道。

資料與方法

1 數(shù)據(jù)集篩選

在本研究中,根據(jù)檢索關鍵詞:Sepsis,Trauma,Post-injury,從Gene Expression Omnibus (GEO,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/GEO/)下載創(chuàng)傷后膿毒癥患者數(shù)據(jù)集,包括GSE28750[12]、GSE70311[2]及GSE12624。3個數(shù)據(jù)集的基本信息見表1。針對所有數(shù)據(jù)集進行歸一化及l(fā)og2化處理。從各個數(shù)據(jù)集中提取對應ANXA3 mRNA的表達數(shù)據(jù)用于后續(xù)分析。

表1 納入研究數(shù)據(jù)集的基本信息

2 生物信息學分析

利用R語言的Limma軟件包對GSE12624數(shù)據(jù)集中創(chuàng)傷后膿毒癥ANXA3高表達組與ANXA3低表達組中差異表達基因進行鑒定。以倍數(shù)變化FC(fold change)>1.5和FDR(false discovery rate)<0.05為閾值判斷差異表達基因的顯著性。為分析差異基因的功能,對差異表達基因進行GO富集和KEGG通路分析。FDR<0.05被認為有統(tǒng)計學意義。以上分析均通過在線分析網(wǎng)站臨床生信之家在線完成分析(https://www.aclbi.com/static/index.html#/)[13]。

3 統(tǒng)計學分析

結 果

1 ANXA3在創(chuàng)傷后膿毒癥患者中表達升高

在GSE28750數(shù)據(jù)集中,共包含20例健康志愿者,11例術后非膿毒癥患者及10例術后膿毒癥患者,分析結果發(fā)現(xiàn)ANXA3 mRNA表達水平在膿毒癥患者中較健康志愿者及非膿毒癥患者顯著上調(P<0.05,圖1a)。在GSE70311數(shù)據(jù)集中包含10例嚴重創(chuàng)傷患者傷后0、1、2、3、5、7、14、21d的轉錄組數(shù)據(jù),其中5例創(chuàng)傷后膿毒癥患者及5例創(chuàng)傷后非膿毒癥患者,分析結果發(fā)現(xiàn)膿毒癥患者的ANXA3 mRNA動態(tài)變化趨勢總體高于非膿毒癥患者,其中以傷后第2、21天天最為顯著(P均<0.05,圖1b)。因此,筆者考慮ANXA3可能在創(chuàng)傷后膿毒癥的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。

ANXA3:膜聯(lián)蛋白A3

2 ANXA3對創(chuàng)傷后膿毒癥患者的早期預警分析

為進一步探索ANXA3對創(chuàng)傷后膿毒癥的早期預警作用,筆者將樣本量最大的GSE12624數(shù)據(jù)集作為驗證數(shù)據(jù)集。在GSE12624數(shù)據(jù)集中共包含36例創(chuàng)傷后非膿毒癥患者及34例創(chuàng)傷后膿毒癥患者,分析結果同樣證實ANXA3 mRNA表達水平在創(chuàng)傷后膿毒癥患者中顯著上調(P<0.05,圖1c)。同時,筆者將GSE12624數(shù)據(jù)集中的ANXA3用于創(chuàng)傷后膿毒癥的早期預警,分析結果發(fā)現(xiàn),ANXA3的AUC=0.766(0.650～0.859),在最佳截斷值6.06,敏感性和特異性分別為76.47%和80.56%(圖1d)。因此,ANXA3可用于膿毒癥的早期預警。

3 ANXA3可能影響膿毒癥中免疫炎癥的表達變化

本研究在GSE12624的34例創(chuàng)傷后膿毒癥患者中進一步分析了ANXA3與細胞因子、趨化因子和表面分子等免疫炎癥相關分子的相關性,分析結果顯示ANXA3與細胞因子(IL-10、IL1R1)、趨化因子(CCL19、CXCL13)、表面分子(CD163、CD55、CD58)等呈正相關(圖2),提示ANXA3可能通過影響這些免疫炎癥相關分子的表達,從而參與膿毒癥的發(fā)生發(fā)展。

ANXA3:膜聯(lián)蛋白A3

4 ANXA3在膿毒癥中發(fā)揮作用的功能分析

為探尋ANXA3在膿毒癥中發(fā)揮作用的功能,本研究在GSE12624的34例創(chuàng)傷后膿毒癥中分析了ANXA3的可能作用。首先根據(jù)ANXA3的最佳截斷值6.06,將34例創(chuàng)傷后膿毒癥患者分為ANXA3高表達組與低表達組,然后比較兩組間的差異基因。分析結果發(fā)現(xiàn)共有416個基因差異表達(FC>1.5且FDR<0.05),其中包括221個上調基因及195個下調基因(圖3a、b),從圖中可以看出,在ANXA3高表達組與低表達組的差異表達基因分析中,ARG1、CLECIB、PCOLCE2、CPNE5、DNAJC5、CD177、CD163、IL-10等基因表達上調,這些基因受ANXA3正向調控,促進表達;另外,CPA3、USP16、CLC、IFI44L、P2RY14、P2RY14、ETV7、SERPINB2等基因表達下調,ANXA3使這些基因受負面調控,抑制其表達。GO分析提示上調基因主要參與中性粒細胞脫顆粒,參與免疫反應的中性粒細胞活化和對氧化應激的反應等通路的富集較為顯著(圖4),這提示膿毒癥期間以中性粒細胞為代表的固有免疫系統(tǒng)的改變;上調基因的KEGG分析發(fā)現(xiàn)主要參與細胞因子-細胞因子受體相互作用,河馬信號通路和胰島素信號傳導途徑等通路的富集最為顯著(圖5),這些結果表明,ANXA3通過影響免疫調節(jié)通路在膿毒癥中發(fā)揮作用。下調基因的GO分析提示主要參與免疫反應激活信號轉導,免疫應答激活細胞表面受體信號通路和抗原受體介導的途徑等信號通路的富集較為顯著(圖6);而KEGG分析的下調基因主要顯著富集在人類T細胞白血病病毒1的感染,PD-L1在腫瘤中的表達與PD-1檢查點通路和T細胞受體信號傳導途徑等通路(圖7);這提示膿毒癥期間T細胞功能出現(xiàn)障礙、免疫功能受損。以上GO及KEGG分析均表明ANXA3可通過免疫調節(jié)信號通路而引起創(chuàng)傷性膿毒癥。

ANXA3:膜聯(lián)蛋白A3

圖5 差異表達基因的京都基因與基因組數(shù)據(jù)庫分析以及相關上調信號通路富集分析氣泡圖(橫軸代表富集倍數(shù),縱軸代表各通路名稱,P值代表點的顏色,數(shù)量由點的大小表示,代表該通路中包含的基因與輸入基因列表交集的基因數(shù),泡泡的大小和色度顯示了基因表達的比例和調整后的P值)

圖6 差異表達基因的基因本體論分析以及相關下調信號通路富集分析氣泡圖(橫軸代表富集倍數(shù),縱軸代表各通路名稱,P值代表點的顏色,數(shù)量由點的大小表示,代表該通路中包含的基因與輸入基因列表交集的基因數(shù),泡泡的大小和色度顯示了基因表達的比例和調整后的P值)

圖7 差異表達基因的京都基因與基因組數(shù)據(jù)庫分析以及相關下調信號通路富集分析氣泡圖(橫軸代表富集倍數(shù),縱軸代表各通路名稱,P值代表點的顏色,數(shù)量由點的大小表示,代表該通路中包含的基因與輸入基因列表交集的基因數(shù),泡泡的大小和色度顯示了基因表達的比例和調整后的P值)

討 論

在本研究中筆者使用生物信息學方法分析了ANXA3在創(chuàng)傷后膿毒癥中的表達變化及功能。首先,在GEO中搜索與創(chuàng)傷后膿毒癥相關的數(shù)據(jù)集,最終納入3個數(shù)據(jù)集(GSE28750、GSE70311及GSE12624),分析結果均表明ANXA3在創(chuàng)傷后膿毒癥患者中表達升高,ANXA3可能參與創(chuàng)傷后膿毒癥的發(fā)生發(fā)展。進一步的功能分析發(fā)現(xiàn),在創(chuàng)傷后膿毒癥患者中ANXA3與細胞因子(IL10、IL1R1),趨化因子(CCL19、CXCL13),表面分子(CD163、CD55、CD58)等多種免疫基因表達相關。GO和KEGG富集分析均提示ANXA3在創(chuàng)傷后膿毒癥中通過影響免疫調節(jié)通路發(fā)揮作用。因此,ANXA3可能是作為創(chuàng)傷后膿毒癥早期預警的生物標志物及治療新靶標。

目前,多項研究證實ANXA3可以激活多種信號通路,通過促進血管生成、血栓形成、誘導炎性反應、調節(jié)免疫,在感染、腫瘤、自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用[14]。目前已有研究表明ANXA3轉錄組水平在膿毒癥患者中升高[10-11]。且有研究證實ANXA3蛋白在膿毒癥小鼠不同組織和細胞上的表達情況;利用ANXA3基因敲除小鼠通過不同的實驗模型,探索了ANXA3在膿毒癥中的作用,結果表明ANXA3可作為膿毒癥的生物標志物[15]。蔣萬威和楊國輝[16]對膿毒癥外周血及膿毒癥心肌功能障礙差異基因進行GO和KEGG富集分析,得出ANXA3是膿毒癥心肌功能障礙潛在的關鍵基因。在本研究中,筆者通過3個不同的創(chuàng)傷后膿毒癥數(shù)據(jù)集發(fā)現(xiàn)并驗證了ANXA3在創(chuàng)傷后膿毒癥中表達上調,進一步表明了ANXA3在膿毒癥的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。既往研究表明ANXA3參與多種疾病的免疫炎癥反應[14]。Zhu等[17]研究表明ANXA3通過誘導趨化因子CXCL8和CCL25釋放,從而上調中性粒細胞-淋巴細胞比率。Meng等[18]研究證明當ANXA3下調時血清中IL-6、TNF水平明顯降低。本研究中,筆者分析了ANXA3與細胞因子、趨化因子和表面分子等多種免疫應答分子的相關性,其中IL10、IL1R1、CCL19、CXCL13、CD163、CD55和CD58等與ANXA3表達呈正相關,進一步證實了ANXA3在創(chuàng)傷后膿毒癥中參與調控免疫應答途徑,從而在膿毒癥發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色。

為進一步探索ANXA3在創(chuàng)傷后膿毒癥中發(fā)揮作用的功能,本研究比較了創(chuàng)傷后膿毒癥患者中ANXA3高表達組與低表達組間的差異表達基因,共發(fā)現(xiàn)416個基因差異表達,并對其生物學功能和信號轉導途徑進行功能分析。GO和KEGG分析提示差異基因主要參與中性粒細胞脫顆?，F(xiàn)象、免疫反應的中性粒細胞活化和細胞因子-細胞因子受體的相互作用等通路。Perl等[19]研究發(fā)現(xiàn)ANXA3具有延長中性粒細胞壽命的作用,并與終末器官損傷有關。同時,目前的研究證實ANXA3介導鈣依賴顆粒-噬菌體融合,從而增強中性粒細胞對微生物的殺滅活性。因此,本研究進一步證實ANXA3可能通過介導上述生物學進程參與膿毒癥的發(fā)生發(fā)展。這些富集的信號通路也可能是創(chuàng)傷后膿毒癥患者的診療評估中的關鍵因素,為膿毒癥的治療提供新思路。

本研究尚有不足之處。一是由于本研究獲得的結果僅包含3個數(shù)據(jù)集,納入研究的樣本量有限,容易造成誤差,可進一步增加GEO芯片數(shù)據(jù)或聯(lián)合其他數(shù)據(jù)庫進行分析;二是本研究基于生物信息學分析,未進行大規(guī)模的臨床樣本驗證,需要更大的多中心前瞻性研究來進一步驗證。今后課題組的相關工作將基于臨床樣本進行實驗研究,以驗證本研究結果的準確性,并進一步探索ANXA3參與創(chuàng)傷后膿毒癥的作用機制。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)ANXA3在創(chuàng)傷后膿毒癥患者中表達上調,可能在創(chuàng)傷的早期階段預測膿毒癥的發(fā)生風險。同時,ANXA3在創(chuàng)傷后膿毒癥中參與調節(jié)多條免疫炎癥反應相關通路,為以ANXA3作為創(chuàng)傷后膿毒癥發(fā)生發(fā)展的分子靶標研究提供新的思路。

作者貢獻聲明：馬聰聰:論文起草及撰寫;陸紅祥:數(shù)據(jù)分析并制作圖表、論文修改;馬筱潔:數(shù)據(jù)收集整理;史清海:設計方案、論文修改及審校