翟永喜,孫林林

1.鄭州市第七人民醫(yī)院骨科,鄭州 450000; 2.鄭州市第七人民醫(yī)院神經(jīng)外科,鄭州 450000

交通事故、墜落、自然災(zāi)害常常導(dǎo)致身體多發(fā)損傷,而脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)是臨床常見的創(chuàng)傷性中樞神經(jīng)疾病[1],具有較高的病死率及致殘率,嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量,給家庭及社會(huì)經(jīng)濟(jì)帶來沉重的負(fù)擔(dān)[2]。目前SCI仍是骨科和神經(jīng)外科治療的熱點(diǎn)和難點(diǎn)[3]。原發(fā)性SCI后常伴繼發(fā)性損傷,發(fā)生神經(jīng)細(xì)胞的病理生理改變(細(xì)胞自噬、凋亡、焦亡等),進(jìn)一步引起神經(jīng)組織的相關(guān)損傷,因此針對(duì)減輕SCI后神經(jīng)損傷的保護(hù)性藥物及相關(guān)機(jī)制的研究至關(guān)重要[4-5]。鐵死亡是神經(jīng)細(xì)胞死亡的重要方式,其主要特征是依賴鐵的程序性死亡方式,產(chǎn)生大量活性氧(reactive oxygen species,ROS),導(dǎo)致谷胱甘肽過氧化物酶4(GPX4)減少,引起細(xì)胞損傷或死亡。既往研究[6-7]表明,鐵死亡在SCI中存在形態(tài)學(xué)及分子細(xì)胞水平的證據(jù),且抑制劑去鐵胺干預(yù)鐵死亡后修復(fù)了SCI,改善了大鼠的肢體功能。目前很多研究證實(shí),抑制鐵死亡具有神經(jīng)保護(hù)作用,特別對(duì)創(chuàng)傷性神經(jīng)損傷具有修復(fù)作用,然而影響鐵死亡的關(guān)鍵蛋白尚處于探索階段。

法舒地爾(fasudil hydrochloride,Fasudil)是異喹啉磺酰類藥物,是一種血管擴(kuò)張劑,通過抑制肌球蛋白輕鏈磷酸化,進(jìn)一步作用于Rho/ROCK激酶發(fā)揮作用,主要影響細(xì)胞骨架分化遷移、平滑肌收縮等多種功能,參與細(xì)胞生長、發(fā)育、遷移和凋亡等生命活動(dòng)[8]。ROCK1與ROCK2是Rho激酶(Rho亞家族蛋白A/相關(guān)卷曲螺旋形成蛋白激酶,ROCK)的亞型,互為同分異構(gòu)體,ROCK2主要在神經(jīng)系統(tǒng)中聚集[9]。而Fasudil以及Rho/ROCK2激酶對(duì)SCI大鼠鐵死亡的研究國內(nèi)外報(bào)道甚少。本研究通過撞擊法制備大鼠SCI模型,給予法舒地爾進(jìn)行治療,觀察SCI大鼠Rho/ROCK2激酶及鐵死亡相關(guān)蛋白的變化,對(duì)SCI發(fā)生的分子機(jī)制進(jìn)行研究,為SCI的臨床救治提供新的理論基礎(chǔ)。

材料與方法

1 材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年雄性SD大鼠,12周齡(體質(zhì)量225.2～245.5g),購于鄭州市華興實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖場,于鄭州市第七人民醫(yī)院6號(hào)樓動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng),光照及黑暗各12h交替,動(dòng)物房溫度22℃,食水自由,操作輕柔減少不良反應(yīng)及大鼠的痛苦。本研究所有動(dòng)物的處理及操作通過鄭州市第七人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批(20191015)。

1.2主要試劑與儀器 Fasudil注射液 (天津紅日藥業(yè),30mg;2mL,中國),鐵檢測試劑盒、活性氧( Reactive oxygen species,ROS)(碧云天生物有限公司,中國),Rho/ROCK2抗體(Wanleibio,中國),xCT及GPX4抗體(Abcam公司,英國)、PVDF膜(Millipore公司,美國),DAB顯色試劑盒(中杉金橋,中國),冰箱(-20℃,-80℃,海爾公司,中國),電轉(zhuǎn)儀、電泳儀(北京六一,中國)。微量轉(zhuǎn)移器(Eppendorf公司,德國)。

2 方法

2.1動(dòng)物分組與SCI模型制作[10]大鼠編碼后按隨機(jī)數(shù)字表法分Sham組(假手術(shù)組)、SCI組(脊髓損傷組)、Fasudil組(SCI+ Rho/ROCK2抑制劑Fasudil組),各12只。大鼠腹腔注射戊巴比妥(2%,50mg/kg)麻醉,麻醉成功后俯臥位于大鼠固定裝置,皮膚消毒并切開,暴露T9～T11,咬骨鉗咬除T9～T11棘突及椎板等骨性組織,顯微剪刀剪開硬脊膜,顯微鑷子打開暴露頸髓。用脊髓損傷器準(zhǔn)確撞擊大鼠脊髓(高度6cm,重量10g),制備SCI模型,逐層縫合,消毒并包扎。保溫復(fù)蘇后繼續(xù)飼養(yǎng)。造模成功標(biāo)準(zhǔn):硬膜下大鼠軀體及雙下肢痙攣性回縮,癱瘓狀態(tài)。術(shù)后每天進(jìn)行膀胱按摩2次促進(jìn)排尿,直至排尿功能恢復(fù)。大鼠無死亡及傷口感染。

Sham組只咬除T9～T11棘突及椎板等骨性組織,不造成SCI。Fasudil組:造模成功后每日1次腹腔注射Fasudil(10mg/kg),治療2周[11]。Sham組與SCI組給予同劑量生理鹽水。

2.2Basso-Beattie-Bresnahan locomotor scale(BBB)評(píng)分 各組大鼠分別于第1、3、7、14、21、28天進(jìn)行BBB評(píng)分。大鼠放置于盆中,輕敲使其爬行,觀察并記錄四肢運(yùn)動(dòng)及協(xié)調(diào)情況,BBB評(píng)分包括:后肢運(yùn)動(dòng)及活動(dòng)度(0～7分),后肢的步態(tài)及前后肢體協(xié)調(diào)(8～13分),運(yùn)動(dòng)中足趾及尾巴精細(xì)動(dòng)作(14～21分)。后肢全癱無活動(dòng)為0分,活動(dòng)正常為21分。BBB評(píng)分結(jié)束后進(jìn)行組織檢測。

2.3Fe2+含量檢測 麻醉大鼠,取各組大鼠脊髓組織,洗滌、勻漿、離心后取上清液待測,配制工作液,按順序加入待測液,形成絡(luò)合物,在波長520nm檢測吸光值,計(jì)算并記錄Fe2+含量。

2.4ROS含量檢測 麻醉大鼠,取各組大鼠脊髓組織,酶解法分解,2’,7’-二氯二氫熒光素二乙酸酯(DCFH-DA) ROS熒光探針檢測樣品中ROS含量(詳細(xì)步驟按ROS試劑盒說明書進(jìn)行操作),激發(fā)波長為502nm,發(fā)射波長為530nm附近波峰最大,結(jié)果用平均熒光強(qiáng)度表示。

2.5免疫印跡法實(shí)驗(yàn) 麻醉大鼠,于損傷部位上下收集脊髓組織,存于-80℃,用時(shí)取出放置于EP管中剪碎,超聲震碎,溶解于裂解液中,離心取上清液,測定蛋白濃度,配比取20μg蛋白上樣,濃縮膠分離膠電泳,PVDF轉(zhuǎn)膜,封閉。加入抗體xCT(1∶1200),GPX4(1∶1200),β-actin(1∶5000),二抗孵育,ECL顯影保存條帶,Image J軟件定量條帶灰度值,β-actin為內(nèi)參對(duì)照。

3 統(tǒng)計(jì)分析

結(jié) 果

1 運(yùn)動(dòng)功能

BBB評(píng)分評(píng)估大鼠28d內(nèi)的運(yùn)動(dòng)功能情況,Sham組評(píng)分正常, SCI組大鼠評(píng)分均低于Shan組(P<0.05),隨著時(shí)間的延長,SCI大鼠的評(píng)分逐漸升高。 對(duì)比SCI組,Fasudil組第14、21 及28天時(shí)明顯改善[(9.58 ± 2.19)分vs.(6.33 ± 2.35)分,t=4.33,P<0.05]、[(13.83 ± 4.47)分vs.(8.92 ± 2.47)分,t=5.90,P<0.05]、[(15.67 ± 4.36)分vs.(12.08 ± 2.65)分,t=2.98,P<0.05]。這表明SCI后大鼠運(yùn)動(dòng)功能逐漸恢復(fù),而使用Fasudil治療后BBB評(píng)分進(jìn)一步升高,進(jìn)一步促進(jìn)了大鼠的運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)。見圖1。

圖1 Fasudil增加大鼠的BBB評(píng)分,與Sham組比較,aP<0.05,bP<0.05,cP<0.05;與SCI組比較:aP<0.05,bP<0.05,cP<0.05

2 Fe2+含量

Sham組脊髓組織Fe2+含量較低為(84.2±11.2)%,對(duì)比Sham組,SCI組SCI部位組織Fe2+含量明顯增多(176 .7±31.5)%(t=5.91,P<0.001)。對(duì)比SCI組, Fasudil組SCI部位組織Fe2+含量明顯降低(127.8±33.1)%(t=3.11,P<0.05)。見圖2。

圖2 各組大鼠SCI部位組織Fe2+含量,與Sham組比較,aP<0.001;與SCI組比較:bP<0.05

3 ROS含量

Sham組脊髓組織ROS含量較低為(95.8±12.0)%,對(duì)比Sham組,SCI組SCI部位組織ROS含量明顯增多(162.2±28.0)%(t=4.86,P<0.001)。對(duì)比SCI組, Fasudil組SCI部位組織ROS含量明顯減少(123.8±27.6)%(t=2.83,P<0.05)。見圖3。

圖3 各組大鼠SCI部位組織ROS含量。與Sham組比較,aP<0.001;與SCI組比較:bP<0.05

4 免疫印跡法中 Rho/ROCK2、xCT及GPX4的變化

Sham組可見Rho/ROCK2少量表達(dá)(0.28±0.039),xCT及GPX4大量表達(dá)(0.92±0.092)、(0.84±0.21),對(duì)比Sham組,SCI組SCI部位組織可見Rho/ROCK2表達(dá)增多(0.85±0.13)(t=7.81,P<0.001),xCT及GPX4表達(dá)減少(0.39±0.041)及(0.36±0.049)(t=14.43,5.78,P<0.001)。對(duì)比SCI組, Fasudil組SCI部位組織可見Rho/ROCK2表達(dá)減少(0.65±0.17)(t=2.71,P<0.05),xCT及GPX4表達(dá)增多(0.64±0.033)及(0.55±0.11)(t=6.91,2.35,P<0.05)。見圖4。

圖4 a.大鼠SCI組織ROCK2、xCT及GPX4的表達(dá);b.ROCK2/β-actin比值;c.xCT/β-actin比值;d.GPX4/β-actin比值。與Sham組比較:aP<0.001;與SCI組比較:bP<0.05

討 論

各種創(chuàng)傷因素導(dǎo)致SCI后,損傷周圍組織的內(nèi)外環(huán)境受到影響[12],血供被破壞,細(xì)胞通透性增強(qiáng),局部Fe2+含量的增高,鐵超載進(jìn)一步影響增加了ROS的堆積,抑制神經(jīng)軸突再生[13]。相關(guān)體內(nèi)研究也發(fā)現(xiàn),在SCI模型中,早期的繼發(fā)性SCI的組織內(nèi)的Fe2+發(fā)揮著非常重要作用,與損傷程度呈正相關(guān)[14]。本研究中,SCI后脊髓組織的Fe2+及ROS水平明顯升高,這與上述研究結(jié)果一致。而使用法舒地爾治療后,大鼠脊髓組織內(nèi)Fe2+及ROS水平降低,大鼠的BBB評(píng)分升高,表明法舒地爾在SCI后可以減輕脊髓受損并改善運(yùn)動(dòng)功能。Fe2+含量增多后誘發(fā)脂質(zhì)過氧化,谷胱甘肽大量消耗,GPX4大量失活,抗氧化防御系統(tǒng)調(diào)控失衡,脂質(zhì)醇生成增多,過氧化物蓄積及細(xì)胞損傷,誘發(fā)鐵死亡[15]。應(yīng)用鐵死亡特異性抑制劑及鐵螯合劑處理SCI大鼠,在損傷的脊髓組織中發(fā)現(xiàn)鐵死亡相關(guān)蛋白的表達(dá),降低炎癥因子,促進(jìn)組織修復(fù),減少了活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞,明顯改善大鼠肢體活動(dòng)[6-7]。這些鐵死亡的體外研究表明,修復(fù)SCI的機(jī)制可能是通過抑制鐵死亡通路實(shí)現(xiàn),此結(jié)論與本研究結(jié)論一致,通過法舒地爾進(jìn)行干預(yù)后SCI大鼠脊髓組織中Fe2+含量減少,鐵死亡負(fù)調(diào)控相關(guān)蛋白xCT及GPX4表達(dá)增多,鐵死亡減少,大鼠SCI減輕,肢體運(yùn)動(dòng)功能改善。筆者推測法舒地爾的具體干預(yù)靶點(diǎn)對(duì)鐵死亡有重要影響,因此對(duì)實(shí)驗(yàn)過程中的Rho/ROCK2激酶進(jìn)行了檢測。

Rho蛋白是小G蛋白家族的亞家族成員,參與SCI的炎癥反應(yīng),對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)黏附、骨架重組有重要調(diào)控作用。SCI的體外實(shí)驗(yàn)[16]中Rho/ROCK2表達(dá)異常增高,與大鼠的預(yù)后有著密切關(guān)系。SCI后神經(jīng)髓鞘分泌軸突抑制劑,與NgR形成復(fù)合物,激活下游級(jí)聯(lián)反應(yīng),通過信號(hào)通路及其他旁路激活ROCK2通路,重組細(xì)胞骨架,導(dǎo)致軸突塌陷和神經(jīng)突出生長抑制,抑制細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)及細(xì)胞再生[17]。Zhao等[18]研究表明可能反應(yīng)性星形細(xì)胞增生引起的神經(jīng)膠質(zhì)瘢痕可能是影響軸突再生的重要原因,通過基因修飾抑制NgR通路后可減少神經(jīng)膠質(zhì)瘢痕產(chǎn)生,明顯改善SCI后軸突再生和功能,而NgR可以影響ROCK2通路。因此,RHO/ROCK2激酶是SCI影響的一個(gè)重要因素,而RHO/ROCK2激酶對(duì)鐵死亡的報(bào)道甚少。以上結(jié)論與本研究結(jié)論相似,SCI后大鼠脊髓中的Fe2+含量增多,ROCK2表達(dá)增高,鐵死亡增強(qiáng),肢體運(yùn)動(dòng)功能損傷,而用ROCK2特異性抑制劑法舒地爾治療后Fe2+含量減少,ROCK2表達(dá)明顯降低,鐵死亡減弱,大鼠肢體活動(dòng)改善。RHO/ROCK2激酶的底物種類多,作用靶點(diǎn)多,有潛在的不良反應(yīng),后期需要進(jìn)一步研究及防治。

綜上,法舒地爾可能通過抑制RHO/ROCK2激酶,降低了鐵死亡,改善了大鼠肢體功能,RHO/ROCK2激酶可能是治療SCI的一條重要調(diào)節(jié)通路。

作者貢獻(xiàn)聲明：翟永喜:實(shí)驗(yàn)實(shí)施、論文撰寫;孫林林:SCI模型制作、實(shí)驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)、統(tǒng)計(jì)分析及論文修改