鄧長(zhǎng)青 張京蘭 金海濤

(武漢市中醫(yī)醫(yī)院腦病科, 湖北 武漢 430014)

糖尿病(Diabetes mellitus,DM)的主要特征為胰島素分泌不足、高血糖和高脂血癥,屬于一種代謝性疾病,其發(fā)病率逐漸上升,造成DM患者死亡的主要原因是患者發(fā)生心血管并發(fā)癥,而心肌梗死是死亡率最高的并發(fā)癥,推測(cè)可能與DM心肌缺血損傷有關(guān)[1-2],因此深入探索DM心肌梗死引發(fā)的心肌損傷機(jī)制有利于開(kāi)發(fā)治療方案。黃芪甲苷(Astragaloside A,AS)是從黃芪中提取的黃酮類化合物,具有抗氧化、抗炎和抗腫瘤活性等廣泛的藥理活性,在缺血/再灌注(Ischemia/reperfusion,IR)損傷中可發(fā)揮保護(hù)心臟的作用[3]。據(jù)報(bào)道[4]鐵穩(wěn)態(tài)失衡與多種疾病有關(guān),如心臟病、神經(jīng)退行性疾病、癌癥和貧血等。膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(Ferroportin1,FPN1)是在哺乳動(dòng)物中唯一被發(fā)現(xiàn)的與鐵釋放相關(guān)的跨膜蛋白,在系統(tǒng)性鐵穩(wěn)態(tài)中起關(guān)鍵作用[5]。核因子E2相關(guān)因子2(Nuclear factor E2-related factor 2,NRF2)是抗氧化反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,參與保護(hù)心肌免于鐵死亡[6]。然而,AS能否通過(guò)NRF2/FPN1對(duì)DM心肌梗死心肌損傷產(chǎn)生影響尚不清楚。因此本研究通過(guò)建立DM心肌梗死大鼠模型,以不同濃度的AS干預(yù),探索其對(duì)DM心肌梗死大鼠心肌損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性Sprague-Dawley大鼠(200～220 g,6周齡)購(gòu)自博濟(jì)醫(yī)藥科技股份有限公司,許可證號(hào):SYXK(粵)2022-0279。將大鼠飼養(yǎng)在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室條件下,其中溫度為(25±2)℃,相對(duì)濕度為(60±15)%。所有實(shí)驗(yàn)程序均經(jīng)動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)批準(zhǔn),倫理批號(hào):2022-06-075。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 成都慕思生物科技有限公司購(gòu)入AS(純度≥98%);Sigma Chemical提供鏈脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)、2, 3, 5-氯化三苯基四唑(2, 3, 5-triphenyltetrazolium chloride,TTC);Med-ChemExpress公司提供ML385;Servicebio提供Prime-Script RT試劑盒、Abcam公司提供NRF2、FPN1、谷胱甘肽過(guò)氧化酶4(Glutathione peroxidase 4,GPX4)一抗以及鐵離子試劑盒。

1.3 方法

1.3.1 DM心肌梗死大鼠模型的制備及干預(yù) 所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d后,隨機(jī)分為假手術(shù)組(10只)及造模組(53只),選取造模組大鼠參照劉宇等[7]方法進(jìn)行制備DM大鼠模型,大鼠給予8周的高糖飼料喂養(yǎng),隨后腹腔注射65 mg/kg STZ,假手術(shù)組給予等體積的檸檬酸鈉緩沖液腹腔注射,并以普通飼料喂養(yǎng)。72 h后(禁食6 h),大鼠出現(xiàn)高血糖(血糖高于16.7 mmol/L),并伴隨多食、多飲、多尿癥狀,則認(rèn)為DM大鼠造模成功。將DM造模成功的50只大鼠(3只失敗)腹腔注射60 mg/kg戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉并進(jìn)行心電圖監(jiān)測(cè),將大鼠氣管插管,在大鼠左鎖骨中線第3～4肋間切開(kāi)肋骨,完全暴露心臟,在距左心耳下緣2 mm,以6-0尼龍線結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支,當(dāng)心尖區(qū)和左心室壁從紅色變?yōu)榘咨?心電圖ST段升高時(shí),表明DM心肌梗死大鼠模型構(gòu)建成功[7],假手術(shù)組僅進(jìn)行開(kāi)胸,但不結(jié)扎。將50只造模成功的DM心肌梗死大鼠隨機(jī)分為梗死組、AS低劑量(AS-L)組、AS中劑量(AS-M)組、AS高劑量(AS-H)組、AS-H+Nrf2抑制劑(ML385)組。AS-L組、AS-M組、AS-H組分別以20 mg/kg AS、40 mg/kg AS、80 mg/kg AS灌胃干預(yù)[8];AS-H+ML385組以80 mg/kg AS灌胃,同時(shí)進(jìn)行腹腔注射30 mg/kg ML385干預(yù)[9],其余各組進(jìn)行等體積的生理鹽水干預(yù),1次/d,連續(xù)30 d。

1.3.2 心功能指標(biāo)檢測(cè) 彩超采集數(shù)據(jù)計(jì)算大鼠左心室射血分?jǐn)?shù)(Left ventricular ejection fraction,LVEF);麻醉大鼠靜脈取血,全自動(dòng)生化儀分析肌酸激酶同工酶-MB(Creatine kinase isoenzyme-MB,CK-MB)、肌酸激酶(Creatine kinase,CK)水平。

1.3.3 TTC染色評(píng)估心肌梗死體積比 各組隨機(jī)選取3只大鼠,麻醉并使大鼠安樂(lè)死,取出心臟,在-20 ℃下冷凍30 min,然后制備組織2 mm厚切片,將切片在1% TTC緩沖液中孵育30 min,然后在10%甲醛溶液中固定24 h,對(duì)切片進(jìn)行成像,Image Pro Plus 7.0軟件測(cè)量心肌梗死體積,其百分比以梗塞體積與切片總體積的占比表示。

1.3.4 樣本采集 麻醉并處死各組剩余7只大鼠,取出心肌組織,一部分浸泡到甲醛溶液中;另一部分于-80 ℃保存。

1.3.5 HE檢測(cè)心肌組織病理學(xué)變化 取出固定于甲醛溶液中的心肌組織,然后將組織在一系列乙醇和二甲苯溶液中脫水并包埋在石蠟中,切片機(jī)將心臟組織切成4 μm厚的切片,使用蘇木精和伊紅染色檢查組織病理學(xué)變化。

1.3.6 試劑盒檢測(cè)鐵離子含量 取出-80 ℃保存的心肌組織,離心后按照試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)鐵離子含量。

1.3.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)心肌組織中NRF2、GPX4、FPN1 mRNA表達(dá)水平 Trizol試劑從心肌樣品中提取總RNA。然后以Prime-Script RT試劑盒說(shuō)明書(shū)將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板,通過(guò)Bio-Rad CFX Connect實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng),使用2-ΔΔCT方法分析基因的表達(dá),其中β-actin為參照。引物序列,見(jiàn)表1。

1.3.8 Western blot檢測(cè)心肌組織中NRF2、GPX4、FPN1蛋白表達(dá) 取出1.3.4中保存的心肌組織,采用預(yù)冷的RIPA裂解緩沖液中提取蛋白,取上清液并添加到蛋白質(zhì)緩沖液中。然后測(cè)量蛋白濃度并通過(guò)SDS-PAGE凝膠分離總蛋白,之后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,于脫脂牛奶中孵育1 h。將一抗(GPX4,1∶1000;NRF2,1∶1000;FPN1,1∶1000;β-actin,1∶1000)在4 ℃下與膜一起孵育過(guò)夜。然后在室溫下加入二抗(1∶5000)孵育1 h,Image J分析NRF2、GPX4、FPN1蛋白表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 AS對(duì)各組大鼠心功能指標(biāo)的影響 與假手術(shù)組相比,梗死組大鼠LVEF顯著降低,CK-MB、CK顯著增加(P<0.05);與梗死組相比,AS-L組、AS-M組、AS-H組大鼠LVEF顯著增加,CK-MB、CK顯著降低,呈現(xiàn)劑量依賴性(P<0.05);與AS-H組相比,AS-H+ML385組大鼠LVEF顯著降低,CK-MB、CK顯著增加(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠LVEF、CK-MB、CK比較

2.2 AS對(duì)各組大鼠心肌梗死體積比的影響 心肌梗死體積比:梗死組較假手術(shù)組、AS-H+ML385組較AS-H組均顯著增加,AS-L組、AS-M組、AS-H組較梗死組顯著降低,呈現(xiàn)劑量依賴性(均P<0.05),見(jiàn)圖2。

圖2 各組大鼠心肌梗死體積比比較

2.3 AS對(duì)各組大鼠心肌組織病理學(xué)的影響 假手術(shù)組大鼠無(wú)病理?yè)p傷出現(xiàn);梗死組大鼠出現(xiàn)嚴(yán)重水腫、炎癥發(fā)生并伴隨心肌壞死;AS-L組、AS-M組、AS-H組干預(yù)后,各組大鼠病理?yè)p傷逐漸得到改善,以AS-H組改善最為顯著;AS-H+ML385組水腫等病理現(xiàn)象較AS-H組加重。見(jiàn)圖3。

2.4 AS對(duì)各組大鼠鐵離子含量的影響 鐵離子含量:梗死組較假手術(shù)組顯著增加, AS-H+ML385組較AS-H組顯著增加(均P<0.05);AS-L組、AS-M組、AS-H組較梗死組顯著降低,呈現(xiàn)劑量依賴性(P<0.05)。見(jiàn)圖4。

圖4 各組大鼠鐵離子比較

2.5 AS對(duì)各組大鼠心肌組織中NRF2、GPX4、FPN1mRNA表達(dá)的影響 NRF2、GPX4、FPN1 mRNA表達(dá):梗死組較假手術(shù)組, AS-H+ML385組較AS-H組均顯著降低(P<0.05);AS-L組、AS-M組、AS-H組較梗死組顯著增加,呈現(xiàn)劑量依賴性(均P<0.05)。見(jiàn)圖5。

圖5 心肌組織NRF2、GPX4、FPN1 mRNA表達(dá)比較

2.6 AS對(duì)各組大鼠心肌組織中NRF2、GPX4、FPN1蛋白表達(dá)的影響 NRF2、GPX4、FPN1蛋白表達(dá):梗死組較假手術(shù)組, AS-H+ML385組較AS-H組均顯著降低(P<0.05);AS-L組、AS-M組、AS-H組較梗死組顯著增加,呈現(xiàn)劑量依賴性(P<0.05)。見(jiàn)圖6、表2。

圖6 心肌組織中NRF2、GPX4、FPN蛋白表達(dá)(Western blot圖)

表2 心肌組織中NRF2、GPX4、FPN1蛋白表達(dá)的比較

3 討論

心肌梗死嚴(yán)重威脅人們健康狀況和生活質(zhì)量,但對(duì)DM患者的威脅更大,是DM患者常見(jiàn)的并發(fā)癥,且預(yù)后差,死亡率更高,且在全球范圍內(nèi)產(chǎn)生醫(yī)療費(fèi)用較高,引起了人們的關(guān)注[10-11]。因此本研究通過(guò)高糖飼料及STZ建立DM大鼠模型,當(dāng)血糖高于16.7 mmol/L時(shí),并伴隨三多癥狀(多食、多飲、多尿),則認(rèn)為DM大鼠造模成功。將DM大鼠通過(guò)結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支,心電圖顯示ST段提高則表明DM心肌梗死大鼠模型構(gòu)建成功,可進(jìn)入下一步探究中。

AS是一種從柿子葉或綠茶種子中提取的黃酮類化合物,具有多種藥理特性,包括抗炎、抗氧化和抗病毒以及對(duì)皮炎和神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用[12]。吳紅偉等[13]研究發(fā)現(xiàn)AS具有保護(hù)心臟的作用。除此之外,在對(duì)心肌梗死大鼠的研究中,AS可改善大鼠心功能及心室重構(gòu)[14-15]。本研究發(fā)現(xiàn)梗死組大鼠病理?yè)p傷嚴(yán)重,梗死體積比增加,心功能受損,提示DM心肌梗死大鼠心肌嚴(yán)重受損。但經(jīng)AS-L、AS-M、AS-H干預(yù)后,大鼠心功能及病理?yè)p傷得到改善,梗死體積比減少,提示AS可保護(hù)DM心肌梗死大鼠心肌受損。

NRF2是一種應(yīng)激誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子,許多負(fù)責(zé)預(yù)防脂質(zhì)過(guò)氧化以及由此引發(fā)的鐵毒性的蛋白質(zhì)和酶均是NRF2靶基因[16]。FPN1是一種鐵運(yùn)轉(zhuǎn)氨酶哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的一種重要的鐵輸出物,受鐵水平的影響,其水平不足以維持鐵過(guò)載細(xì)胞中的鐵穩(wěn)態(tài),可導(dǎo)致活性氧(Reactive oxygen species,ROS)過(guò)度循環(huán)產(chǎn)生,引發(fā)氧化應(yīng)激損傷,導(dǎo)致鐵死亡[17]。而鐵死亡是一種新型的細(xì)胞死亡,與氧化應(yīng)激密切相關(guān),以產(chǎn)生ROS和脂質(zhì)過(guò)氧化為特征,研究[18]表明,鐵死亡是心肌梗死發(fā)展的關(guān)鍵機(jī)制。在谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(Glutathione peroxidase,GPx)家族成員中,已知GPX4特異性催化脂質(zhì)過(guò)氧化物的減少,從而清除脂質(zhì)ROS,與鐵死亡息息相關(guān)[19]。如柚皮素通過(guò)調(diào)節(jié)NRF2/GPX4軸抑制鐵生死亡減輕心肌缺血/再灌注損傷[20]。本研究發(fā)現(xiàn)梗死組大鼠鐵離子含量增加,NRF2、GPX4、FPN1 mRNA及蛋白表達(dá)降低,提示DM心肌梗死大鼠心肌受損可能通過(guò)抑制NRF2/FPN1通路發(fā)生鐵死亡實(shí)現(xiàn)。但經(jīng)AS-L、AS-M、AS-H干預(yù)后,NRF2、GPX4、FPN1mRNA及蛋白表達(dá)上調(diào),鐵含量減少,推測(cè)AS可通過(guò)激活NRF2/FPN1信號(hào)通路保護(hù)DM心肌梗死大鼠心肌受損,可能和鐵素相互作用,幫助蛋白質(zhì)與藥物結(jié)合,抑制鐵死亡,以調(diào)節(jié)疾病的進(jìn)展。為驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)推測(cè),以NRF2抑制劑-ML385回復(fù)驗(yàn)證,結(jié)果顯示,AS-H+ML385組LVEF、NRF2、GPX4、FPN1mRNA及蛋白表達(dá)顯著降低,梗死體積比、鐵離子含量、CK-MB、CK顯著增加,推測(cè)AS-H可DM心肌梗死大鼠心肌受損,但由于NRF2/FPN1通路被ML385阻斷,致使DM心肌梗死大鼠心肌受損,逆轉(zhuǎn)了AS-H對(duì)DM心肌梗死大鼠的保護(hù)作用,進(jìn)一步表明AS可通過(guò)激活NRF2/FPN1通路抑制鐵死亡保護(hù)DM心肌梗死大鼠心肌受損。

4 結(jié)論

AS通過(guò)激活NRF2/FPN1通路抑制鐵死亡,改善DM心肌梗死大鼠受損,為DM心肌梗死治療提供依據(jù),但由于機(jī)制復(fù)雜,后續(xù)需開(kāi)展細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步核實(shí)。