劉宇彪 周花玩 鞠上

(1.中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院南區(qū)外科,北京 102600; 2.天承金象中醫(yī)診所,北京 100045; 3.北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院周圍血管科,北京 100061)

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年1月—2021年1月中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院南區(qū)接診的糖尿病足患者60例作為糖尿病足組,選擇同期因外傷在我院行清創(chuàng)手術的2型糖尿病非病足組患者19例作為糖尿病非病足組,并選取同期因外傷在我院接受清創(chuàng)手術的無糖尿病病史且無創(chuàng)面感染的患者60例作為對照組。納入標準:①相關診斷符合《中國老年2型糖尿病診斷措施專家共識(2018)版》[12]。②糖尿病足患者除滿足①外,糖尿病足分級:Wagner分級≥1。③臨床資料完整。④診斷為糖尿病足均為初次且未進行任何治療。⑤近期未使用利尿劑、抗凝劑。排除標準:①合并惡性腫瘤、嚴重創(chuàng)傷及肝腎功能嚴重異常。②機體處于感染的應急狀態(tài)。③不具有完整的臨床資料。④痛風史、激素類藥物服用史。⑤合并免疫系統(tǒng)疾病。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準通過,所有研究對象均簽署知情同意。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料收集 通過回顧性分析查閱患者基線資料,主要包括:年齡、性別、糖尿病病程、血壓、血糖、血生化指標、白細胞計數(shù)、血脂、Wanger分級及住院時間等。計算質量體質量指數(shù)(BMI)及腰臀比(Waist-to-Hip Ratio, WHR)。使用全自動生化儀對纖維蛋白原(FG)、三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C)、血肌酐(SCr)、血尿酸(UA)等實驗室指標進行檢測。檢測糖化血紅蛋白(HbA1c)通過使用高效液相色譜法。ELISA法檢測血清中1L-6、1L-4、TNF-β、hs-CRP水平。

1.2.2 創(chuàng)面標本采集 研究對象治療常規(guī)換藥處理過程中,創(chuàng)面覆蓋凡士林紗布,每日更換,不使用含外源性細胞因子和藥物或敷料,于換藥時用組織剪留取創(chuàng)面中央部位肉芽組織。清洗后,冷凍20～30 min于液氮中,-70 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 創(chuàng)面組織中HOX13蛋白表達檢測 將研究所取組織標本放入遇冷的研缽中,將其粉碎至粉末。加適量裂解液30 min后,進行冰上裂解反應,后在4 ℃條件下,離心5 min取上清(4 ℃,12000 r/min)。根據(jù)BCA試劑盒(Promega生物技術有限公司,美國)說明檢測蛋白濃度。100 ℃條件下蛋白樣品變性3～5 min,上樣緩沖液與變性蛋白80 μg進行充分混勻,后恒壓電泳。在行濃縮膠(90 V電壓),分離膠(120 V電壓),停止電泳在電泳至距離分離膠下端約1 cm處。后取出凝膠,進行轉膜處理,完成后封閉2 h(5%脫脂奶粉),后依次加入1∶1000稀釋后的一抗HOX13單克隆抗體(美國Abcam公司)、1∶1000稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG(美國Abcam公司)反應,顯色液滴加,轉移至暗室,曝光處理,加入內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH),分析蛋白水平。

1.2.4 Western blot檢測蛋白表達 各組細胞培養(yǎng)48 h后,提取蛋白,再檢測HOX13、TNF-β、hs-CRP、1L-6、1L-4的表達,參照1.2.3中步驟。

1.2.5 HOX13免疫組化染色 固定樣本組織通過使用4%多聚甲醛,后制成石蠟切片(5 μm)。使用3%過氧化氫溶液去除脫水后的石蠟切片中的內(nèi)源性過氧化物酶,封閉組織切片30 min通過3%的胎牛血清白蛋白(美國Hyclone公司)。兔抗人HOX13單克隆抗體(Sigma公司,美國)滴加處理,在4 ℃條件下對其進行孵育過夜處理;二抗滴加。在室溫條件下進行孵育(1 h)。對其進行沖洗處理使用PBS,SABC孵育。對其進行顯色處理使用DAB,蘇木素復染。有經(jīng)驗病理師按照盲法對檢測結果進行獨立判斷。判讀標準:陽性細胞為細胞漿呈棕色著色,陰性細胞為無棕色著色。

總之，對有攻擊性行為的幼兒，應更多地強調(diào)愛和平靜、溫和的教育，注意在平時培養(yǎng)他們的愛心和善良的品格，鏟除孩子產(chǎn)生攻擊性行為的土壤，讓幼兒從小學會愛自己、愛別人，尊重自己、尊重別人。

1.2.6 細胞模型構建與分組 HOX13基因質粒構建:采用GenBank查找序列獲得HOX13過表達以及敲除靶點,通過Peimer-BLAST工具在靶點上設計引物序列,獲得基因過表達與敲除質粒,以上操作由上海吉瑪公司完成。①細胞分離培養(yǎng)與分組:無菌條件下于超凈工作臺上取標本組織,去髓核、表皮及結締組織后將組織切成2～3 mm后置于培養(yǎng)皿中,PBS清洗2次后密度以1～2塊組織/cm2排列整齊,表面滴加1～2滴胎牛血清于每顆組織表面,置于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中進行6～8 h培養(yǎng)后組織塊貼壁,后培養(yǎng)箱中加入適量DMEM(包含10%體積分數(shù)胎牛血清),培養(yǎng)過夜,于第2 d觀察培養(yǎng)基無污染后換液,后換液每2～3 d一次,觀察有成纖維細胞組織遷移出于1周后,可傳代待貼壁生長達80%以上時。而后通過Lipo2000轉染試劑轉染2 μgHOX13基因過表達、敲除質粒,換液在24 h后,在質粒完成轉染48 h后通過1 μg/ml嘌呤霉素進行篩選,篩選時長為72 h,后繼續(xù)培養(yǎng)細胞,通過流式細胞儀對細胞進行分選至96孔板上,最終分組為敲除組(轉染敲除HOX13質粒)、過表達組(轉染過表達HOX13質粒)、空白組(未做任何處理)。② HOX13轉染效率鑒定:采用實時熒光定量PCR法鑒定HOX13 基因轉染效率,取3組細胞提取細胞總RNA,測定RNA純度和含量,通過逆轉錄試劑盒進行逆轉錄獲得cDNA,通過RT-PCR法鑒定HOX13基因轉染效率,通過2-△△CC法計算。

1.2.7 CCK-8檢測細胞增殖 在96孔板中共設8個孔/組,密度為3×103個/孔均勻鋪滿。在細胞培養(yǎng)箱(5% CO2、37 ℃)進行72 h的培養(yǎng)至出現(xiàn)細胞形態(tài)正常且細胞貼壁。吸去其內(nèi)舊液,使用PBS緩沖液進行2次沖洗,加入含HOX13蛋白2 μg/ml培養(yǎng)基。孵育72 h后,吸出培養(yǎng)液使用排槍,加入CCK-8溶液按10%濃度配置,每孔加入100 μL混合液,37 ℃條件下孵育30 min。調(diào)節(jié)分光光度計,檢測吸光度(Optical density,OD)于450 nm波長處。

1.2.8 EDU實驗檢測細胞增殖數(shù)目 1×104/孔細胞培養(yǎng)在96孔細胞培養(yǎng)板,按照實驗分組添加10 μmol/L5-乙炔基2′-脫氧尿苷(5-ethynyl-2′-deoxyuridine,EdU)試劑; 37 ℃、5%CO2培養(yǎng)6 h后,4%多聚甲醛溶液固定45 min,按照EdU試劑盒說明書進行后續(xù)實驗; 并用5 mg/LDAPI染細胞核20 min,TCSSP2激光掃描共焦顯微鏡觀察。Image-Pro Plus 6.0.1圖像軟件分析細胞增殖數(shù)目。

1.2.9 流式細胞術檢測細胞凋亡 同前的細胞處理,對目的培養(yǎng)基進行更換根據(jù)實驗分組,進行72 h的培養(yǎng),消化處理后洗滌使用PBS,Annexin VFITC 聯(lián)合PI雙染法檢測細胞凋亡。

2 結果

2.1 3組患者一般資料比較 糖尿病足組年齡46～71歲;糖尿病非病足組年齡38～67歲;對照組年齡35～63歲。3組患者年齡、踝肱指數(shù)、病程、Hb、WBC、FG、HbA1c、白蛋白(ALB)、TNF-β、hs-CRP、1L-6、1L-4比較差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。其中糖尿病非病足組年齡、病程、WBL、FG、HbA1c、TNF-β、hs-CRP、1L-6、1L-4顯著低于糖尿病足組(均P<0.05),對照組年齡、病程、WBC、FG、HbA1c、TNF-β、hs-CRP、1L-6、1L-4顯著低于糖尿病非病足組(P<0.05)。踝肱指數(shù)、Hb、白蛋白在糖尿病病足組、糖尿病非病足組、對照組依次顯著偏高(P<0.05)。見表1。

表1 3組患者一般資料比較

2.2 HOX13與臨床特征相關性分析 相關性分析結果表明,HOX13表達與年齡、病程、Hb、FG、HbA1c、、TNF-β、hs-CRP、1L-6、1L-4呈負相關(P<0.05);與踝肱指數(shù)、ALB呈正相關(P<0.05)。見表2。

表2 臨床特征與HOX13的相關性分析

2.3 免疫組化檢測HOX13在糖尿病足組、糖尿病非病足組、對照組組織中表達 HOX13呈棕色顆粒表達于細胞核,相較于糖尿病非病足組與對照組,HOX13在糖尿病足組中的顏色深度明顯變淺,染色面積明顯下降,可見HOX13的表達量明顯影響糖尿病患者足的破損情況,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見圖1。

圖1 免疫組化檢測HOX13在不同組別中表達(200×)

2.4 組織中HOX13蛋白表達 收集3組新鮮組織,提取總蛋白后,通過western blot檢測HOX13蛋白的表達水平,與對照組相比,糖尿病非病足組與糖尿病足組的HOX13蛋白表達水平明顯降低,其中表達更低的為糖尿病足組(P<0.05),見圖2。

圖2 Western blot檢測各組HOX13蛋白表達

2.5 體外細胞模型

2.5.1HOX13基因轉染效率鑒定 過表達組、敲除組、空白組HOX13基因mRNA表達量分別為(2.36±0.80)、(0.44±0.12)、(1.65±0.51),組間比較差異均有統(tǒng)計學意義(F=13.207,P<0.001)。過表達組HOX13基因mRNA表達量顯著偏高,敲除組HOX13基因mRNA表達量顯著偏低。提示細胞模型構建成功。

2.5.2 過表達組、敲除組、空白組間細胞炎性因子比較 ELISA法檢測各組炎癥因子,較于空白組,過表達組TNF-β、hs-CRP、1L-6、1L-4顯著偏低(P<0.05);敲除組TNF-β、hs-CRP、1L-6、1L-4顯著升高(P<0.05)。western blot檢測各組TNF-β、hs-CRP、1L-6、1L-4蛋白表達,與空白組比較,敲除組顯著升高,過表達組顯著降低(均P<0.05)。見表3、圖3。

圖3 Western blot檢測3組間細胞內(nèi)炎癥因子

表3 3組間細胞內(nèi)炎癥因子比較

2.5.3 3組細胞凋亡相關蛋白表達 Western blot檢測各組細胞目的蛋白表達,較于空白組,敲除組Caspase-3、Caspase-9、Bax蛋白表達顯著偏高,Bcl-2蛋白表達顯著偏低(均P<0.05);較于空白組,過表達組Caspase-3、Caspase-9、Bax蛋白表達顯著偏低,Bcl-2蛋白表達顯著偏高(均P<0.05)。見圖4。

圖4 Western blot檢測各組細胞凋亡蛋白表達

2.5.4 3組細胞凋亡率比較 相較于空白組與過表達組,HOX13敲除組的糖尿病足組Q4象限正常細胞占比明顯下降,表明HOX13低表達明顯促進細胞凋亡,(F=6.791,P<0.001),見圖5。

圖5 各組細胞凋亡情況比較

2.6 3組間細胞增殖影響 CCK-8實驗結果表明,過表達組細胞增殖狀態(tài)較空白組顯著增高(F=6.842,P<0.001),敲除組較空白組顯著降低(F=8.537,P<0.001)。見圖6。

圖6 CCK-8實驗檢測細胞增殖情況

2.7 EDU標記實驗檢測細胞增殖情況 與空白組比較,敲除組EDU標記的細胞數(shù)目明顯降低(P<0.05);過表達組EDU標記的細胞數(shù)目明顯升高(P<0.05)。由此說明HOX13低表達的糖尿病足細胞增殖能力明顯降低。見圖7。

圖7 EDU標記實驗檢測細胞增殖情況(200 μm,200×)

3 討論

糖尿病足是以足部保護性感覺喪失為特征的神經(jīng)病變,常伴有外周動脈疾病的血流受限,嚴重者可能會感染并導致截肢[13]。糖尿病足具體調(diào)控機制尚未完全明確,已有研究表明細胞過度凋亡是其重要的病理特征。多項研究證實HOX13可參與細胞增殖及凋亡的調(diào)控[14-15],而細胞凋亡對維持細胞的正常形態(tài)與功能,維持機體穩(wěn)定具有重要作用,細胞凋亡的調(diào)控機制發(fā)生紊亂可誘導產(chǎn)生多種疾病[16]。

糖尿病足的發(fā)生發(fā)展受多種因素共同作用[17],本研究結果表明糖尿病足組患者較其他組患者年齡偏大,病程較長。與費揚帆等[18-19]研究結果一致。另外本研究還發(fā)現(xiàn)WBC、FG、HbA1c水平也較其他組高,分析機制可能為就理論上血糖控制不佳,患病時間較久,機體免疫抵抗能力降低,進而導致糖尿病足等相關并發(fā)癥發(fā)生率升高,而白細胞計數(shù)可以對感染情況進行評估。糖尿病足組HbA1c顯著偏高,分析可能血糖長期控制水平與糖尿病足發(fā)生顯著相關,外周動脈粥樣硬化可由長期高血糖引起,肢體潰瘍壞死風險隨之增加。這與既往研究[20-21]結果類似。同時因糖尿病患者的機體長期在高血糖條件下,其具有血管內(nèi)皮功能障礙加重,脂質過氧化,黏附因子水平升高,血液凝固型增高等一系列病理生理變化,下肢缺血性病變隨之加快,糖尿病足發(fā)生率升高。而糖尿病足組FG顯著偏高可導致血液黏度增加,隨之血管內(nèi)皮細胞損傷增加,病灶內(nèi)血栓形成,這與李惠琴等[22]相關研究相一致?？梢娔挲g、WBC、FG、HbA1c、病程等升高,可加大發(fā)生糖尿病足的風險。本研究還發(fā)現(xiàn)糖尿病足組患者踝肱指數(shù)、Hb、ALB較其他組顯著偏低。分析原因可能低ALB及低HB可加重血脂紊亂及感染。提示踝肱指數(shù)、低ALB、低HB偏低可加大發(fā)生糖尿病足的風險。

有研究[23]發(fā)現(xiàn)成人成纖維細胞可在體內(nèi)和多層體內(nèi)維持胚胎HOX模式的特征,這表明它們是跟蹤轉錄記憶機制的有價值的系統(tǒng)。而HOX13可實現(xiàn)對多項關鍵基因的表達調(diào)控疾病的發(fā)生發(fā)展[24]。有研究[25]發(fā)現(xiàn)在解剖遠端部位出生后的人類皮膚中,HOXA13蛋白在表皮中不表達,而在真皮中表達。但是否與糖尿病足發(fā)生和創(chuàng)面的潰瘍加重及愈合等相關還不清楚。本研究發(fā)現(xiàn),相較于糖尿病非病足組與對照組,糖尿病足患者的HOX13表達顯著降低,且HOX13表達與年齡、病程、白細胞計數(shù)等呈負相關,踝肱指數(shù)、白蛋白與HOX13呈正相關。這提示HOX13可能與DF的發(fā)生相關,其可能對DF的治療和預后監(jiān)測具有指導作用。有研究[26-27]發(fā)現(xiàn)隨著累積血糖負荷的加重,足部潰瘍的發(fā)病率也在增加,而糖基化終末產(chǎn)物的啟動因子可能促進了炎癥的發(fā)生,同時也通過細胞增殖促進了血管壁基質增生,另外還對血管內(nèi)皮細胞凋亡具有重要影響。本研究發(fā)現(xiàn)病足患者TNF-β、hs-CRP、1L-6、1L-4顯著偏高,且與HOX13呈負相關,說明HOX13可能加重了糖尿病足的發(fā)生進而促進炎癥反應,且細胞實驗也發(fā)現(xiàn)HOX13敲除時TNF-β、hs-CRP、1L-6、1L-4顯著偏高,HOX13過表達時,TNF-β、hs-CRP、1L-6、1L-4顯著降低。進一步提示HOX13可能可能會加重炎癥反應,進而加重糖尿病足的潰瘍。

在成人成纖維細胞中的特異性HOX基因的表達可作為穩(wěn)態(tài)和再生期間皮膚的位置記憶源[28]。有研究[30]發(fā)現(xiàn)HOXA13對成纖維細胞WNT5A的調(diào)控是調(diào)控位點特異性表皮分化的機制之一,HOXA13可能決定了誘導成年人成纖維細胞WNT5A表達是否繼續(xù)提供遠端特異性功能,而HOXA13的表達可能與傷口難愈與細胞增殖減慢及細胞凋亡增加有關。且已有多項研究[31]表明HOX13可誘導細胞凋亡,HOX13調(diào)控細胞的增殖與凋亡通過多種通路。本研究也發(fā)現(xiàn)較于空白組,HOX13敲除時明顯增加細胞凋亡,過表達時顯著抑制凋亡,經(jīng)典凋亡因子Caspase-3、Caspase-9、Bax蛋白在HOX13敲除組表達顯著偏高,Bcl-2蛋白表達顯著偏低,當HOX13過表達時以上凋亡因子出現(xiàn)顯著相反的結果。提示HOX13可能控制了糖尿病足細胞的凋亡,這與以往研究結果具有一致性。本研究提示HOX13敲低的糖尿病足成纖維細胞增殖能力明顯降低,這與CCK-8實驗結果一致?？梢奌OX13在細胞的增殖和凋亡中發(fā)揮重要作用,這與其他研究[32]發(fā)現(xiàn)的HOX基因可誘導人脂肪肉瘤、白血病細胞等多種細胞增殖和凋亡的結果一致。但本研究樣本量較少,導致結果具有一定偏奇性,另外基礎研究方法較為簡單,實驗具有一定局限性,將在后續(xù)研究中優(yōu)化這些問題,為糖尿病的研究提供更多可靠信息。

4 結論

HOX13在糖尿病足中呈低表達,HOX13高表達可促進糖尿病足成纖維細胞的增殖,抑制凋亡,并抑制炎癥因子的表達。HOX13表達變化量與糖尿病足發(fā)生發(fā)展密切相關,HOX13有希望成為糖尿病足治療和預后監(jiān)測的新靶點因子,可為糖尿病足發(fā)病機制提供新思路。