張晨欣，周 昱

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤科，黑龍江佳木斯 154002)

三陰性乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC)是雌激素受體、孕激素受體及人表皮生長(zhǎng)因子受 體-2(human epidermal growth factor receptor 2，HER-2)表達(dá)均呈陰性的乳腺癌，具有發(fā)病年齡早、組織學(xué)級(jí)別高、復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移發(fā)生率高的特點(diǎn)，并且TNBC 無(wú)法從內(nèi)分泌治療和抗HER-2 靶向治療中獲益，因此治療難度大、預(yù)后差[1-2]。c-Jun 氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)是絲裂原活化蛋白激酶家族的成員，以磷酸化形式發(fā)生激活后調(diào)控細(xì)胞增殖、存活、分化，在多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[3-5]。已有研究[6]報(bào)道促進(jìn)JNK 磷酸化(p-JNK)對(duì)TNBC 細(xì)胞具有抑制增殖和促進(jìn)凋亡作用，但JNK發(fā)揮調(diào)控作用的分子機(jī)制尚不明確。

鐵死亡是一種鐵依賴性的程序性細(xì)胞死亡方式，具體指細(xì)胞內(nèi)鐵過(guò)載造成脂質(zhì)氧化物代謝失調(diào)、活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)大量產(chǎn)生而引起的細(xì)胞死亡[7-9]。JNK 是鐵死亡的上游調(diào)控因素，有研究報(bào)道JNK磷酸化后激活鐵死亡并抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖[10]；也有研究報(bào)道鐵死亡激活后，TNBC細(xì)胞的增殖減弱、凋亡增強(qiáng)[11]。但JNK 在TNBC 細(xì)胞鐵死亡中的調(diào)控作用及生物學(xué)意義尚未見(jiàn)報(bào)道。基于此，本研究將通過(guò)臨床TNBC 樣本檢測(cè)及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分析JNK 通路介導(dǎo)的鐵死亡在TNBC細(xì)胞增殖及凋亡中的作用。

1 材料與方法

1.1 組織樣本與細(xì)胞系

選擇2020 年1 月—2022 年5 月于佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤科手術(shù)切除的105 例TNBC 癌組織和癌旁正常組織，納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)術(shù)后病理診斷為TNBC；②均留取TNBC 癌組織和距離病灶邊緣5 cm以上的癌旁正常組織；③臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前接受過(guò)放化療、內(nèi)分泌治療、靶向治療等；②既往有其他惡性腫瘤病史。

TNBC 細(xì)胞系MDA-MB-231 以及乳腺癌(非TNBC)細(xì)胞系MCF-7、SK-BR-3購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞資源中心。

1.2 主要試劑與儀器

二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)、JNK 激動(dòng)劑ANISO、鐵死亡抑制劑Ferrostatin-1 均購(gòu)自美國(guó)MCE 公司；CCK-8 法細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒、TdT 介導(dǎo)的dUTP 原位切口末端標(biāo)記(TdT-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)法細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自上海碧云天生物科技公司；谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH)檢測(cè)試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)檢測(cè)試劑盒、丙二醛(malondialdehyde，MDA)檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物研究所；總RNA 提取試劑盒、cDNA 第一鏈合成試劑盒、熒光定量PCR(quantitative real time PCR，qPCR)檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自北京天根生化科技公司；小鼠抗人JNK、p-JNK 特異性抗體購(gòu)自CST 公司，小鼠抗人TFR1、GPX4特異性抗體購(gòu)自Abcam公司。細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，倒置顯微鏡購(gòu)自日本尼康公司，凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自上海天能公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 Western blot 檢測(cè)癌組織中p-JNK、TFR1 和GPX4 蛋白的表達(dá)取TNBC 組織和癌旁組織各約30 mg，使用裂解液在冰上對(duì)組織進(jìn)行裂解、提取蛋白，測(cè)定蛋白濃度后將含有30 μg 蛋白的樣本用于電泳。在聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離蛋白，電轉(zhuǎn)硝酸纖維素膜后用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，4 ℃孵育JNK 一抗(1∶500 稀釋)、p-JNK 一抗(1∶500 稀釋)、TFR1 一抗(1∶800稀釋)、GPX4一抗(1∶1 000稀釋)或β-actin 一抗(1∶3 000 稀釋)過(guò)夜，次日用1∶2 000 稀釋的二抗室溫孵育1 h，最后在凝膠成像系統(tǒng)中曝光得到的條帶，以β-actin 為內(nèi)參，計(jì)算p-JNK、TFR1、GPX4 蛋白的相對(duì)表達(dá)水平，并對(duì)3 種蛋白表達(dá)的相關(guān)性進(jìn)行分析。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)和分組MDA-MB-231、MCF-7、SK-BR-3細(xì)胞分別在含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基中貼壁培養(yǎng)，每2 d用0.25%胰蛋白酶消化傳代1次。傳代后的MDA-MB-231細(xì)胞進(jìn)行分組給藥：對(duì)照組用含有體積分?jǐn)?shù)為0.1% DMSO的培養(yǎng)基處理，JNK激動(dòng)劑組參照文獻(xiàn)[10]用含有5 μmol/L ANISO 的培養(yǎng)基處理，鐵死亡抑制劑組參照文獻(xiàn)[12]用含有2 μmol/L Ferrostatin-1的培養(yǎng)基處理，激動(dòng)劑+抑制劑組用含有5 μmol/L ANISO+2 μmol/L Ferrostatin-1 的培養(yǎng)基處理。每組均重復(fù)4 次，連續(xù)培養(yǎng)24 h。MCF-7 和SKBR-3 細(xì)胞用于和MDA-MB-231 對(duì)比，不進(jìn)行JNN 激動(dòng)劑或鐵死亡激動(dòng)劑的處理。為了比較乳腺癌MCF-7、SK-BR-3細(xì)胞(非TNBC細(xì)胞株)與TNBC 細(xì)胞株MDA-MB-231 細(xì)胞中p-JNK、TFR1、GPX4 蛋白表達(dá)的差異，收集上述3 種細(xì)胞進(jìn)行裂解后按1.3.1步驟對(duì)p-JNK、TFR1和GPX4蛋白的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.3 MDA-MB-231 細(xì)胞增殖的檢測(cè)將MDAMB-231細(xì)胞以每孔1×104個(gè)接種在96孔培養(yǎng)板中分組處理24 h后每孔加入10 μL CCK-8試劑，孵育1 h后將培養(yǎng)板放入酶標(biāo)儀，設(shè)置波長(zhǎng)為450 nm 檢測(cè)吸光度，按照[D(450)對(duì)照組-D(450)實(shí)驗(yàn)組]/D(450)對(duì)照組×100%計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。

1.3.4 MDA-MB-231 細(xì)胞凋亡的檢測(cè)將5×104個(gè)MDA-MB-231 細(xì)胞接種在48 孔培養(yǎng)板中處理24 h 后棄去培養(yǎng)基，PBS 沖洗2 遍后用4%多聚甲醛固定1 h，而后采用TUNEL試劑盒進(jìn)行染色，用含DAPI的抗熒光淬滅封片液固定，在熒光顯微鏡下觀察4 個(gè)高倍視野(400 倍)中TUNEL 陽(yáng)性染色細(xì)胞和DAPI 陽(yáng)性染色細(xì)胞并計(jì)數(shù)，按下式計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

細(xì)胞凋亡率=TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/DAPI陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)×100%

1.3.5 MDA-MB-231 細(xì)胞中GSH、SOD、MDA 的檢測(cè)MDA-MB-231 細(xì)胞接種在12 孔培養(yǎng)板中，分組給藥24 h后收集細(xì)胞。使用裂解液在冰上對(duì)細(xì)胞進(jìn)行裂解，得到裂解液后GSH 采用比色法進(jìn)行檢測(cè)、SOD采用羥胺法進(jìn)行檢測(cè)、MDA采用硫代巴比妥酸法進(jìn)行檢測(cè)，均按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.3.6 MDA-MB-231 細(xì)胞中TFR1 和GPX4 表達(dá)的檢測(cè)將1×106個(gè)MDA-MB-231細(xì)胞接種在12孔培養(yǎng)板中，分組給藥24 h后收集細(xì)胞。一部分細(xì)胞用試劑盒提取細(xì)胞中的總RNA，采用cDNA 第一鏈合成試劑盒將提取得到的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用qPCR檢測(cè)試劑盒對(duì)cDNA 中的TFR1、GPX4 進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)。qPCR 的體系為：cDNA 1 μL、試劑盒中反應(yīng)混合液10 μL、上下游引物各0.6 μL，去離子水補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃、15 s，特異性退火(TFR1基因60 ℃、GPX4基因58 ℃)25 s，72 ℃、30 s，共進(jìn)行40 個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后得到循環(huán)曲線及循環(huán)閾值(CT)，以β-actin 為內(nèi)參、按照公式2-ΔΔCT計(jì)算TFR1、GPX4的mRNA相對(duì)表達(dá)水平。另一部分MDA-MB-231細(xì)胞使用裂解液在冰上對(duì)細(xì)胞進(jìn)行裂解檢測(cè)蛋白表達(dá)，后續(xù)操作過(guò)程同1.3.1。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以表示，兩組間比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，四組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD 法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TNBC組織中p-JNK、TFR1和GPX4蛋白的表達(dá)

與癌旁組織比較，TNBC 組織中p-JNK、TFR1 蛋白的表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，GPX4 蛋白的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，見(jiàn)圖1A 和B。經(jīng)Pearson 檢驗(yàn)，TNBC組織中p-JNK蛋白與TFR1蛋白的表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.515，P<0.01，圖1C)，p-JNK蛋白與GPX4蛋白的表達(dá)水平具有負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.442，P<0.01，圖1D)。

圖1 TNBC組織中p-JNK、TFR1和GPX4蛋白的表達(dá)

2.2 TNBC 細(xì)胞株中p-JNK、TFR1 和GPX4 蛋白的表達(dá)

結(jié)果見(jiàn)圖2，與乳腺癌MCF-7、SK-BR-3細(xì)胞(非TNBC 細(xì)胞系)比較，TNBC 細(xì)胞系MDA-MB-231 細(xì)胞中p-JNK 和TFR1 蛋白的表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，GPX4 蛋白的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。故后續(xù)試驗(yàn)均在MDA-MB-231細(xì)胞中進(jìn)行。

2.3 JNK 激動(dòng)劑及鐵死亡抑制劑對(duì)TNBC 細(xì)胞增殖、凋亡及氧化應(yīng)激水平的影響

結(jié)果見(jiàn)表1，與對(duì)照組比較，TNBC細(xì)胞的增殖抑制率和凋亡率在JNK 激動(dòng)劑組均升高(P<0.05)；鐵死亡抑制劑組無(wú)顯著變化(P>0.05)；激動(dòng)劑+抑制劑組居中，該組細(xì)胞的增殖抑制率和凋亡率低于JNK激動(dòng)劑組、高于鐵死亡抑制劑和對(duì)照組(均為P<0.05)。與對(duì)照組比較，JNK 激動(dòng)劑組TNBC 細(xì)胞中GSH 和SOD 活性均顯著降低(P<0.05)，MDA含量升高(P<0.05)；鐵死亡抑制劑組TNBC 細(xì)胞的GSH、SOD 活性及MDA 含量與對(duì)照組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；激動(dòng)劑+抑制劑組GSH和SOD活性均高于JNK激動(dòng)劑組而低于鐵死亡抑制劑組(P<0.05)，MDA 含量低于JNK 激動(dòng)劑組而高于鐵死亡抑制劑組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 JNK激動(dòng)劑及鐵死亡抑制劑對(duì)TNBC細(xì)胞增殖、凋亡及氧化應(yīng)激水平的影響(n=4，x±s)

2.4 JNK 激動(dòng)劑及鐵死亡抑制劑對(duì)TNBC 細(xì)胞中TFR1和GPX4表達(dá)的影響

結(jié)果見(jiàn)圖3和圖4，與對(duì)照組比較，JNK激動(dòng)劑組TNBC細(xì)胞中TRF1 mRNA和蛋白的相對(duì)表達(dá)水平均顯著升高而GPX4 mRNA 和蛋白的相對(duì)表達(dá)水平均顯著降低(均為P<0.05)；鐵死亡抑制劑組細(xì)胞中TFR1 和GPX4 的mRNA 及蛋白相對(duì)表達(dá)水平與對(duì)照組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；激動(dòng)劑+抑制劑組細(xì)胞中的TRF1 mRNA 和蛋白相對(duì)表達(dá)水平均低于JNK 激動(dòng)劑組而高于鐵死亡抑制劑組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)，GPX4的mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)水平均高于JNK激動(dòng)劑組而低于鐵死亡抑制劑組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。

圖3 JNK 激動(dòng)劑及鐵死亡抑制劑對(duì)TNBC 細(xì)胞中TFR1 和GPX4 mRNA表達(dá)水平的影響

圖4 JNK激動(dòng)劑及鐵死亡抑制劑對(duì)TNBC細(xì)胞中TFR1和GPX4蛋白表達(dá)水平的影響

3 討論

TNBC 具有侵襲性強(qiáng)、容易發(fā)生轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的特點(diǎn)，而且缺乏特異性治療靶點(diǎn)，治療效果欠佳，預(yù)后較差[13-15]。目前，TNBC分子機(jī)制不明確是制約其臨床診療的主要因素。因此，研究TNBC 發(fā)病的分子機(jī)制，發(fā)現(xiàn)新治療靶點(diǎn)具有迫切的臨床需求。

絲裂原活化蛋白激酶家族中的JNK 在細(xì)胞調(diào)控中起重要作用，磷酸化為p-JNK 后對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、死亡均發(fā)揮調(diào)控作用。目前關(guān)于JNK通路在惡性腫瘤中的研究認(rèn)為p-JNK起到抑癌作用，在多種惡性腫瘤組織中JNK 磷酸化不足、p-JNK 表達(dá)缺失，促進(jìn)JNK磷酸化對(duì)癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移均具有抑制作用[16-19]。本研究對(duì)TNBC 組織與癌旁組織中JNK 磷酸化水平的分析顯示，與對(duì)應(yīng)的癌旁組織比較，TNBC 組織中p-JNK 的表達(dá)水平降低，提示JNK 磷酸化不足與TNBC 的發(fā)病有關(guān)；進(jìn)一步在TNBC 細(xì)胞系MDAMB-231 中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，JNK 激動(dòng)劑ANISO 處理后細(xì)胞的增殖抑制率及凋亡率均明顯增加，表明激活TNBC細(xì)胞系中JNK起到抑制增殖、促進(jìn)凋亡的作用，進(jìn)而提示JNK通路在TNBC的發(fā)病中起抑癌作用。

JNK 通路在細(xì)胞中參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、細(xì)胞自噬、細(xì)胞鐵死亡等生物學(xué)環(huán)節(jié)的調(diào)控[20-23]。近些年乳腺癌相關(guān)的基礎(chǔ)研究認(rèn)為鐵死亡異?？赡苁荰NBC 發(fā)病的重要環(huán)節(jié)，誘導(dǎo)TNBC 癌細(xì)胞發(fā)生鐵死亡可以有效抑制乳腺癌的進(jìn)程[6，24-25]。TFR1和GPX4是鐵死亡標(biāo)志基因，既往研究發(fā)現(xiàn)TFR1 介導(dǎo)了三價(jià)鐵進(jìn)入細(xì)胞并促進(jìn)脂質(zhì)過(guò)氧化物生成、導(dǎo)致鐵死亡的發(fā)生[26-27]，GPX4能夠?qū)⒂卸拘缘闹|(zhì)過(guò)氧化物還原為無(wú)毒性的脂醇并抑制鐵死亡[28-30]。本研究對(duì)以上兩種鐵死亡標(biāo)志基因的檢測(cè)結(jié)果顯示，TNBC 中TFR1 的表達(dá)降低且與p-JNK 呈正相關(guān)、GPX4 的表達(dá)增加且p-JNK 呈負(fù)相關(guān)，提示TNBC 病灶中鐵死亡受到抑制且可能受到上游JNK 通路的調(diào)控。本文進(jìn)一步通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)，JNK 激動(dòng)劑ANISO 處理TNBC 細(xì)胞后TFR1 的表達(dá)增加、GPX4 的表達(dá)降低。這一結(jié)果表明激活JNK 使TNBC細(xì)胞的鐵死亡加劇，進(jìn)而提示TNBC中JNK通路對(duì)鐵死亡具有促進(jìn)作用。

為了深入認(rèn)識(shí)JNK 調(diào)控鐵死亡在TNBC 細(xì)胞增殖和凋亡中的作用，本研究在JNK 激動(dòng)劑處理TNBC 細(xì)胞的同時(shí)聯(lián)合使用了鐵死亡抑制劑，結(jié)果表明JNK激動(dòng)劑+鐵死亡抑制劑聯(lián)用較單用JNK 激動(dòng)劑抑制增殖、促進(jìn)凋亡的作用明顯減弱，表明JNK 通路對(duì)TNBC 細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)控作用部分依賴于激活細(xì)胞鐵死亡。鐵死亡的另一特征是ROS大量生成所導(dǎo)致的MDA 含量增多、GSH 和SOD 活性降低，本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)JNK激動(dòng)劑后出現(xiàn)了相應(yīng)的MDA、GSH和SOD 變化，聯(lián)合使用鐵死亡抑制劑則明顯削弱JNK 激動(dòng)劑對(duì)MDA、GSH和SOD的影響，由此進(jìn)一步驗(yàn)證了JNK通路對(duì)TNBC鐵死亡的調(diào)控作用。

綜上所述，JNK 通路通過(guò)激活鐵死亡的方式抑制TNBC 細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，JNK 通路調(diào)控鐵死亡可能成為研究TNBC發(fā)病機(jī)制及治療手段的新靶點(diǎn)。