高 冉，哈麗亞·塔力達吾別克，劉曉東，田 薇

(新疆醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院，新疆 烏魯木齊 830011)

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)是血液系統(tǒng)高發(fā)的惡性腫瘤之一，其特征是骨髓和外周血中尚未成熟的干細胞增殖失控、凋亡受阻，造血功能異常，且具有高度異質(zhì)性[1]。近年來，雖然AML 治療和抑制方法的研究取得了顯著進展[2]，提高了患者生存率。但是診斷、治療和預(yù)后的檢測效果仍然不夠理想[3]。AML 是環(huán)境、遺傳以及多種因素共同作用的結(jié)果，從分子層面探究AML的復(fù)雜發(fā)病機制，能夠為AML診斷標準提供新的方向。

在人類轉(zhuǎn)錄本中，80%～90%的RNA 均不編碼蛋白質(zhì)，被稱為非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)，其中長度超過200個核苷酸的ncRNA被稱為長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，LncRNA)[4]。LncRNA 可以在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后、翻譯或翻譯后多重水平調(diào)控基因的表達。研究表明，LncRNA 參與生物體生長發(fā)育、免疫、代謝等多種生命活動過程[5]。也參與癌癥的發(fā)生與發(fā)展[6]，其在腫瘤中的作用主要是對癌基因和抑癌基因的調(diào)控。比如Fu 等[7]發(fā)現(xiàn)LncRNA EPEL 可通過與RUNX2 相互作用來調(diào)節(jié)癌細胞行為并影響胃癌的預(yù)后。實際上已有研究[8]表明LncRNA有望成為AML病情演化及診斷的潛在生物標志物。

本課題組前期采用微陣列分析對AML 患者和健康對照組人群外周血淋巴細胞基因表達的差異進行鑒定[9]，篩選出了431 個差異表達的LncRNA，其中173個表達上調(diào)，258 個表達下調(diào)。LncRNA CUST_49525和CUST_47163 被認為在AML 患者體內(nèi)表達異常。因此，本研究通過實時熒光定量PCR(quantitative realtime PCR，qPCR)檢測AML 患者和健康對照組人群外周血LncRNA CUST_49525 和CUST_47163 的表達水平，采用受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve，ROC)評估其預(yù)測能力，并結(jié)合微核率研究其診斷價值，進而為AML診斷輔助指標提供研究線索。

1 材料與方法

1.1 研究對象

課題組選取AML 患者35 例，均來自山東省臨沂市，其中男性17 例，女性18 例，平均年齡(44.14±18.46)歲。AML 組患者均通過骨髓涂片形態(tài)學和細胞化學研究確診為AML。健康對照組共47例，均來自上海市某廠后勤和行政管理人員，均知情同意，其中男性30 例，女性17 例，平均年齡(47.11±9.14)歲。健康對照組人群符合以下標準：無癌癥診斷史；無伴全身免疫系統(tǒng)疾病和感染性疾??；排除孕婦和哺乳期女性。從每名受試者采集2 mL 空腹外周靜脈血用于qPCR檢測。

1.2 實驗試劑與儀器

淋巴細胞分離液購自天津灝洋華科生物科技有限公司，TRIzol 購自美國Life Technologies 公司，miRNeasy 迷你試劑盒、QuantiNovaTMSYBR?Green PCR 試劑盒均購自德國Qiagen 公司，PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser 購自日本TaKaRa 公司；氯仿購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 實時熒光定量PCR 檢測LncRNA 的表達用淋巴細胞分離液分離出外周血中的淋巴細胞，利用miRNeasy 試劑盒進行RNA 提取，并測定純度和濃度，然后進行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，設(shè)定反轉(zhuǎn)錄程序為37 ℃、15 min；85 ℃、5 s；4 ℃保存。以上述cDNA 為模板，GAPDH 為內(nèi)參，按照qPCR 試劑盒操作指南配制反應(yīng)體系，設(shè)置PCR 程序為：95 ℃、1 min；95 ℃、30 s；55 ℃、30 s；72 ℃、1 min，共40 個循環(huán)。用目的基因的表達水平相對于GAPDH 的水平進行定量。實驗過程中，所有樣本均采用3 個復(fù)孔，采用2-ΔΔCT法計算LncRNA的相對表達水平。依據(jù)基因芯片提供的信息，獲得目標LncRNA 全長基因序列，其中引物的設(shè)計及合成由上海生工生物工程股份有限公司完成，引物序列見表1。

表1 引物序列

1.3.2 胞質(zhì)分裂阻滯微核試驗從外周血樣本中抽取0.5 mL全血置于含有肝素的抗凝培養(yǎng)瓶中，采用胞質(zhì)分裂阻滯法處理，充分混合后，37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，44 h 后加入終濃度為6 μg/mL的細胞松弛素B，繼續(xù)培養(yǎng)28 h后收集細胞，低滲處理，用甲醇和乙酸以3∶1比例(V∶V)混合液固定，將處理好的細胞置于載玻片上風干過夜，用Giemsa染色后，在顯微鏡下觀察1 000 個雙核細胞中含有微核的淋巴細胞個數(shù)，計算微核千分率(‰)。

1.4 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)整理及分析采用SPSS 26.0 軟件，數(shù)據(jù)圖繪制采用GraphPad Prism 8.0 軟件。兩組之間比較采用非參數(shù)Mann-WhitneyU檢驗，ROC 曲線分析差異表達的LncRNA CUST_49525和CUST_47163及淋巴細胞微核千分率在AML 診斷中的價值，ROC 曲線下面積(area under curve，AUC)用于評價診斷價值指標，取約登指數(shù)最大的取值為Cut-off值，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 AML 患者與健康對照人群外周血中LncRNA 的表達及微核分布

結(jié)果見表2 和圖1。與對照組相比，LncRNA CUST_49525和CUST_47163在AML患者組人群外周血中的相對表達水平均明顯下調(diào)(均為P<0.01)，而AML患者組雙核淋巴細胞微核率顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

圖1 外周血中LncRNA CUST_49525和CUST_47163的相對表達水平和微核率分布

表2 兩組人群LncRNA CUST_49525、CUST_47163 表達和微核率差異

2.2 LncRNA CUST_49525 和CUST_47163 及微核率在AML中的診斷價值分析

在單一變量的診斷價值評估中，淋巴細胞微核率的表現(xiàn)效果是最佳的。將LncRNA CUST_49525 和CUST_47163 及微核率作為自變量，以AML 的診斷結(jié)果為因變量，構(gòu)建二元Logistic回歸，每個研究對象得出相應(yīng)的預(yù)測概率，以預(yù)測概率繪制ROC曲線，用于AML 的聯(lián)合診斷(見表3，圖2)，所得AUC 為0.970，95%CI 為0.931～1.000。與對角線下面積(0.500)相比，CUST_49525、CUST_47163、微核率和聯(lián)合診斷各組AUC 均增大，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。三項聯(lián)合診斷效果優(yōu)于單一指標診斷，單一指標診斷中微核率優(yōu)于其他指標(P<0.01)。

圖2 LncRNA CUST_49525 和CUST_47163 及微核率診斷AML 的ROC曲線

表3 LncRNA CUST_49525和CUST_47163及微核率在AML診斷中的價值分析

3 討論

近年來，AML是成人白血病的最常見形式，其死亡率居高不下，嚴重威脅患者的生命健康。然而，當前我國在AML診斷、療效和預(yù)后的判斷中最常用的是流式細胞術(shù)檢測和骨髓穿刺涂片，除此之外，細胞組織化學染色也可用于形態(tài)學診斷[10]。在實際應(yīng)用中，骨髓穿刺取材具有一定局限性，患者組織的病理改變具有不均一性，患者實際病情進展無法通過常規(guī)診斷指標及時反映出來[11]。而LncRNA 表達檢測便捷快速，患者接受度高，同時具備靈敏高效的特點。因此，開展LncRNA 在AML 發(fā)生與發(fā)展中的差異表達以及微核率在AML診斷中的價值研究，在臨床中具有重要意義和應(yīng)用價值。LncRNA 曾一度被認為是“基因噪音”，隨著基因高通量測序技術(shù)的不斷發(fā)展，大量研究滲透到表觀遺傳學領(lǐng)域。眾多證據(jù)表明[12-13]，LncRNA 在血液系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生與發(fā)展中具有重要作用，其介導的多種細胞過程在疾病的發(fā)展中起到調(diào)控功能[14]。

LncRNA作為重要的分子標志物[15]，其獨特的表達信號與疾病的臨床特征、突變及預(yù)后有關(guān)。研究表明[16]，LncRNA能夠通過調(diào)控下游基因轉(zhuǎn)錄和表達參與機體正常造血，另一方面，LncRNA 也能使基因表觀遺傳沉默，或者使染色質(zhì)重構(gòu)，導致癌基因激活或抑癌基因失活[17]，造成惡性造血。Yang 等[18]的研究結(jié)果揭示了LncRNA 的促癌作用，他們提到的LINC00239促進了癌細胞增殖、集落形成和遷移能力，并且LINC00239 的存在一定程度上減少了阿霉素誘導的細胞凋亡，也就增加了AML 細胞對阿霉素的化學抗性。因此，LncRNA 在AML 的診斷和預(yù)后中有望成為一個新的分子標志物。Wang 等[19]報道，LINC00899 可用于AML的診斷和預(yù)后，成為一種新型血清生物分子標志物，他們對比了AML 患者組與對照組骨髓和血清中LINC00899 的表達水平，結(jié)果顯示LINC00899 在患者組表達上調(diào)，同時與FAB分型和細胞遺傳學有關(guān)。根據(jù)ROC曲線結(jié)果，LINC00899具備區(qū)分AML患者與正常人的能力。周晉宇等[20]也提出，LncRNA XLOC_109948在AML患者骨髓和血清中均呈現(xiàn)高表達，可判斷AML 診斷、療效及預(yù)后效果。然而關(guān)于LncRNA CUST_49525和CUST_47163在AML診斷中的價值研究目前在國內(nèi)尚未見相關(guān)報道。

微核實驗?zāi)軌蚍从矨ML 患者淋巴細胞的遺傳損傷[21]，近年來因其便捷快速，微核實驗應(yīng)用越來越廣泛。本次研究采用胞質(zhì)分裂阻滯法對比了AML患者與對照人群的血漿淋巴細胞微核率，結(jié)果顯示AML患者微核率顯著高于對照組。這說明AML患者的外周血淋巴細胞出現(xiàn)有絲分裂異常，從而引起染色體畸變，這種突變在AML 患者體內(nèi)的發(fā)生率顯著高于健康人群。因此，微核率可作為AML診斷的重要參考指標。本研究結(jié)果顯示，LncRNA CUST_49525 和CUST_47163 在AML患者血清中的表達較健康對照組明顯下調(diào)。這表明，LncRNA CUST_49525和CUST_47163在AML中可能發(fā)揮著影響細胞增殖、遷移和侵襲的生理學功能，具有初步診斷AML 的作用。通過繪制AML 診斷價值的ROC 曲線，比較LncRNA CUST_49525 和CUST_47163 以及微核率在AML 診斷中的截斷值，考察其作為臨床診斷指標的價值。ROC曲線分析結(jié)果提示，在診斷時檢測LncRNA CUST_49525和CUST_47163的表達水平可提供有價值的結(jié)果信息。通過進一步分析發(fā)現(xiàn)，綜合LncRNA CUST_49525和CUST_47163及微核率，做出聯(lián)合診斷，其診斷價值高于單一指標，上述研究結(jié)果表明，AML診斷、治療及預(yù)后過程中，使用微核率作為傳統(tǒng)診斷指標的同時，將LncRNA CUST_49525和CUST_47163的相對表達納入臨床診斷的輔助指標，作出聯(lián)合診斷，有助于AML 診斷分析的細化，并有助于臨床決策。

目前對AML 中LncRNA 的調(diào)控機制和生物功能的研究，仍處于起步階段，需要更多的臨床試驗和證據(jù)對其進行探討。由于本研究采用的是橫斷面比較，并且納入的臨床病例較少，LncRNA CUST_49525 和CUST_47163 對患者生存率及預(yù)后的評估還需要進一步研究，其分子機制也需要體內(nèi)和體外實驗的結(jié)果來驗證。