李光輝，周碟，王茜

（鄭州大學第一附屬醫(yī)院口腔醫(yī)學中心，河南 鄭州 450000）

牙齒、頜面部畸形常會造成咀嚼困難、咬合創(chuàng)傷等問題，而且引起牙頜與顱面關系不協(xié)調(diào)等美觀問題，給患者帶來自卑等不良心理問題[1]。正畸治療是臨床上牙齒畸形的主要治療手段，通過佩戴矯形器，在適當持續(xù)的壓力作用下，使牙位移動從而達到治療效果，在此過程中牙周膜在持續(xù)應力刺激下不斷形成新的骨性結構，促進牙槽骨改建，從而達到矯正目的[2-3]。但是牙移動速度較慢，往往需要2 年以上恢復時間，長時間的矯正增加了牙周炎、牙根吸收等并發(fā)癥，因此需要積極尋找可以在不損傷牙周膜、牙髓等的前提下加速牙體移動速度，縮短矯正周期的有效藥物[4]。傳統(tǒng)中藥川續(xù)斷具有活血化瘀、強筋健骨、滋補肝腎等功效，川續(xù)斷皂苷Ⅵ是川續(xù)斷的主要活性成分，其可促進大鼠正畸牙周組織破骨細胞分化，加快牙周改建[5]。關于川續(xù)斷皂苷Ⅵ在大鼠正畸牙移動及牙周組織骨改建的研究有限，且其發(fā)揮作用的具體機制尚不清楚。Notch 1信號通路作為一種進化保守的細胞間相互作用機制，在細胞增殖、分化和凋亡中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，機械牽張應力通過促進Piezo1 蛋白表達，以Ca2+為第二信使，激活Notch 1 信號通路，可促進人牙周膜干細胞成骨分化[6]?；谝陨涎芯浚狙芯刻接懘ɡm(xù)斷皂苷Ⅵ是否能通過調(diào)節(jié)Notch 1 信號通路發(fā)揮促大鼠正畸牙移動和骨改建，旨在為縮短臨床矯正頜面畸形周期提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級SD 大鼠50 只，8 周齡，體質(zhì)量200～220 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2016-0006。飼養(yǎng)期間大鼠自由飲食飲水，環(huán)境溫度20～25℃，空氣濕度50%～60%。該實驗經(jīng)鄭州大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會審核批準，倫理號：2022-KY-0285。

1.2 試劑和儀器

川續(xù)斷皂苷Ⅵ購自上海遠慕生物科技有限公司（批號：10614）；Notch 1 信號通路抑制劑DAPT 購自美國MedChemExpress 公司（批號：HY-13027）；HE 染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司（批號：G1120）；TRAP染色試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司（批號：HR0561）；引物序列均由廣州銳博生物科技有限公司提供；Nfatc、CTSK、MMP-9、Notch 1 和Jagged 1 蛋白抗體購自美國Abcam 公司（批號分別為：ab236639、ab209484、ab133612、ab52627、ab109536）；正畸鎳鈦螺旋拉簧購自北京有研醫(yī)療器械有限公司。

1.3 模型制備[7]與分組給藥

隨機取40 只大鼠分為模型組、川續(xù)斷皂苷Ⅵ組、抑制劑組和抑制劑+川續(xù)斷皂苷Ⅵ組，腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉，固定于鼠板上，在大鼠左右側(cè)上中切牙和上頜第一磨牙之間用0.2 mm 的結扎絲將正畸鎳鈦螺旋拉簧固定，使其對第一磨牙產(chǎn)生50 g 的持續(xù)牽引力，并在上中切牙和上頜第一磨牙根頸部磨出一深約0.5 mm 的小凹槽，并用流體樹脂固定結絲線以防脫落，每天檢查一次加力裝置，如有脫落應及時重新結扎，另外10 只作為對照組，只在上中切牙和上頜第一磨牙之間放置結扎絲，但不加持續(xù)牽引力。

造模后當天，川續(xù)斷皂苷Ⅵ組大鼠在雙側(cè)上頜第一磨牙近中牙齦黏膜下局部注射川續(xù)斷皂苷Ⅵ10 mg/kg（3.6 g川續(xù)斷皂苷Ⅵ溶于200 mL生理鹽水制成質(zhì)量濃度為18 mg/mL 的川續(xù)斷皂苷Ⅵ溶液），1次/2 d，共注射7次；抑制劑組大鼠在同樣位置局部注射DAPT 溶液0.6 mL/kg（1 g DAPT 粉末溶于50 mL DMSO制成質(zhì)量濃度為20 mg/mL的溶液），1次/2 d，共注射7次；抑制劑+川續(xù)斷皂苷Ⅵ組大鼠在同樣位置局部注射DAPT溶液0.6 mL/kg，1 h后再注射川續(xù)斷皂苷Ⅵ10 mg/kg，1 次/2 d，共注射7 次；對照組和模型組大鼠在同樣位置局部注射等量生理鹽水。

1.4 第一磨牙移動距離測量

建模14 d后各組大鼠心臟灌注4%（φ）多聚甲醛處死，分離左側(cè)整個上頜組織，由同一名實驗人員使用游標卡尺測量第一磨牙和第二磨牙領面接觸點的距離，每個標本測量5次，取平均值作為最終結果。

1.5 牙周組織標本制備

取右側(cè)上頜第一磨牙及牙周頜骨組織，4%多聚甲醛中固定，10% EDTA 溶液脫鈣3 個月（每3 天更換1次脫鈣液），梯度乙醇脫水、石蠟包埋，切成厚度為4 μm的切片備用。

1.6 HE染色觀察牙周組織病理學改變

取“1.5”中的石蠟切片，按照試劑盒說明書進行HE 染色，顯微鏡下每張切片取5 個互不重疊的視野，觀察牙周組織病理學改變。

1.7 TRAP染色觀察破骨細胞數(shù)

取“1.5”中的石蠟切片，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，TRAP 染液避光孵育1 h，雙蒸水沖洗，蘇木素核染，流水反藍，脫水，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察破骨細胞數(shù)。

1.8 RT-PCR法檢測牙周組織中Nfatc、CTSK、MMP-9、Notch 1、Jagged 1 mRNA水平

取各組大鼠部分左側(cè)第一磨牙牙周頜骨組織，Trizol 試劑進行組織裂解，提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，進行熒光定量PCR 反應，反應條件為：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，進行40個循環(huán)。2-△△Ct法計算目的基因相對于內(nèi)參的表達量。引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.9 蛋白印跡法檢測牙周組織中Nfatc、CTSK、MMP-9、Notch 1、Jagged 1蛋白水平

取各組大鼠部分左側(cè)第一磨牙牙周頜骨組織，RIPA 裂解液裂解，離心收集上清液，BCA 法測定蛋白濃度。取30 μg 蛋白樣品，120 v 恒壓電泳2 h 使蛋白分離，將蛋白濕轉(zhuǎn)到PVDF 膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，GAPDH、Nfatc、CTSK、MMP-9、Notch 1、Jagged 1 蛋白抗體（1∶1 000）4℃孵育過夜，二抗（1∶5 000）室溫孵育1 h，洗膜，ECL發(fā)光液顯影，Image J分析條帶灰度值，目的蛋白表達水平=目的蛋白條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值。

1.10 統(tǒng)計學分析

采用SPSS21.0 統(tǒng)計學軟件分析數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布的定量資料均以表示，多樣本間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 第一磨牙移動距離測量結果

與對照組比較，模型組大鼠第一磨牙移動距離增長（P＜0.05）；與模型組比較，川續(xù)斷皂苷Ⅵ組大鼠第一磨牙移動距離增長（P＜0.05）；與川續(xù)斷皂苷Ⅵ組比較，抑制劑+川續(xù)斷皂苷Ⅵ組大鼠第一磨牙移動距離縮短（P＜0.05）；與抑制劑組比較，抑制劑+川續(xù)斷皂苷Ⅵ組大鼠第一磨牙移動距離增長（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠第一磨牙移動距離Table 2 Comparison of the distance of first molar movement of rats in each group(±s,n=10)

表2 各組大鼠第一磨牙移動距離Table 2 Comparison of the distance of first molar movement of rats in each group(±s,n=10)

與對照組比較：*P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05；與川續(xù)斷皂苷Ⅵ組比較：ΔP＜0.05；與抑制劑組比較：▲P＜0.05。

組別對照組模型組川續(xù)斷皂苷Ⅵ組抑制劑組抑制劑+川續(xù)斷皂苷Ⅵ組第一磨牙移動距離/mm 0±0 0.55±0.03*0.78±0.06#0.45±0.04#0.62±0.06Δ▲

2.2 HE染色結果

對照組牙周膜纖維排列整齊，寬度無變化；模型組和抑制劑組大鼠牙周膜纖維排列紊亂，寬度增加，骨吸收陷窩少，抑制劑組表現(xiàn)的更明顯；川續(xù)斷皂苷Ⅵ組和抑制劑+川續(xù)斷皂苷Ⅵ組牙周膜纖維排列較規(guī)則，增寬不明顯，骨吸收陷窩增多，川續(xù)斷皂苷Ⅵ組大鼠以上各變化更顯著。見圖1。

2.3 TRAP染色結果

與對照組比較，模型組破骨細胞數(shù)增多（P＜0.05）；與模型組比較，川續(xù)斷皂苷Ⅵ組破骨細胞數(shù)增多（P＜0.05）；與川續(xù)斷皂苷Ⅵ組比較，抑制劑+川續(xù)斷皂苷Ⅵ組破骨細胞數(shù)減少（P＜0.05）；與抑制劑組比較，抑制劑+川續(xù)斷皂苷Ⅵ組破骨細胞數(shù)增多（P＜0.05）。見表3，圖2。

圖2 牙周組織TRAP染色（200×）Figure 2 TRAP staining of periodontal tissue (200×)

表3 各組大鼠牙周組織破骨細胞數(shù)比較Table 3 Comparison of the number of osteoclasts in periodontal tissue of rats in each group(±s,n=10)

表3 各組大鼠牙周組織破骨細胞數(shù)比較Table 3 Comparison of the number of osteoclasts in periodontal tissue of rats in each group(±s,n=10)

與對照組比較：*P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05；與川續(xù)斷皂苷Ⅵ組比較：ΔP＜0.05；與抑制劑組比較：▲P＜0.05。

組別對照組模型組川續(xù)斷皂苷Ⅵ組抑制劑組抑制劑+川續(xù)斷皂苷Ⅵ組破骨細胞數(shù)/個2.20±0.79 4.50±0.71*8.80±0.79#3.50±1.35#6.90±0.74Δ▲

2.4 RT-PCR檢測結果

與對照組比較，模型組Nfatc、CTSK、MMP-9、Notch 1 和Jagged1 mRNA 表達水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，川續(xù)斷皂苷Ⅵ組Nfatc、CTSK、MMP-9、Notch 1和Jagged 1 mRNA 表達水平升高（P＜0.05）；與川續(xù)斷皂苷Ⅵ組比較，抑制劑+川續(xù)斷皂苷Ⅵ組Nfatc、CTSK、MMP-9、Notch 1 和Jagged 1 mRNA表達水平降低（P＜0.05）；與抑制劑組比較，抑制劑+川續(xù)斷皂苷Ⅵ組Nfatc、CTSK、MMP-9、Notch 1 和Jagged 1 mRNA表達水平升高（P＜0.05）。見表4。

表4 各組大鼠牙周組織中Nfatc、CTSK、MMP-9、Notch 1和Jagged 1 mRNA表達水平比較Table 4 Comparison of mRNA expression levels of Nfatc，CTSK，MMP-9，Notch 1 and Jagged 1 in periodontal tissues of rats in each group(±s,n=10)

表4 各組大鼠牙周組織中Nfatc、CTSK、MMP-9、Notch 1和Jagged 1 mRNA表達水平比較Table 4 Comparison of mRNA expression levels of Nfatc，CTSK，MMP-9，Notch 1 and Jagged 1 in periodontal tissues of rats in each group(±s,n=10)

與對照組比較：*P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05；與川續(xù)斷皂苷Ⅵ組比較：ΔP＜0.05；與抑制劑組比較：▲P＜0.05。

組別對照組模型組川續(xù)斷皂苷Ⅵ組抑制劑組抑制劑+川續(xù)斷皂苷Ⅵ組Nfatc mRNA 0.38±0.03 2.95±0.35*7.89±0.54#1.22±0.33#5.34±0.66Δ▲CTSK mRNA 0.52±0.06 2.77±0.37*6.69±0.48#1.53±0.35#4.75±0.71Δ▲MMP-9 mRNA 0.57±0.04 3.04±0.54*6.52±0.60#1.84±0.65#5.37±0.58Δ▲Notch 1 mRNA 0.83±0.06 3.64±0.72*7.86±0.78#1.79±0.58#5.59±0.63Δ▲Jagged 1 mRNA 0.77±0.07 3.53±0.55*7.70±0.65#1.36±0.63#5.54±0.77Δ▲

2.5 蛋白印跡法檢測結果

與對照組比較，模型組Nfatc、CTSK、MMP-9、Notch1 和Jagged1 蛋白表達水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，川續(xù)斷皂苷Ⅵ組Nfatc、CTSK、MMP-9、Notch1 和Jagged 1 蛋白表達水平升高（P＜0.05）；與川續(xù)斷皂苷Ⅵ組比較，抑制劑+川續(xù)斷皂苷Ⅵ組Nfatc、CTSK、MMP-9、Notch 1 和Jagged 1 蛋白表達水平降低（P＜0.05）；與抑制劑組比較，抑制劑+川續(xù)斷皂苷Ⅵ組Nfatc、CTSK、MMP-9、Notch 1和Jagged 1蛋白表達水平升高（P＜0.05）。見表5，圖3。

圖3 牙周組織中Nfatc、CTSK、MMP-9、Notch 1 和Jagged 1蛋白表達電泳圖Figure 3 Electrophoretic expression of Nfatc, CTSK, MMP-9,Notch 1 and Jagged 1 proteins in periodontal tissues

表5 各組大鼠牙周組織中Nfatc、CTSK、MMP-9、Notch1和Jagged1 蛋白表達水平比較Table 5 Comparison of protein expression levels of Nfatc，CTSK，MMP-9，Notch 1 and Jagged 1 in periodontal tissues of rats in each group(±s,n=10)

表5 各組大鼠牙周組織中Nfatc、CTSK、MMP-9、Notch1和Jagged1 蛋白表達水平比較Table 5 Comparison of protein expression levels of Nfatc，CTSK，MMP-9，Notch 1 and Jagged 1 in periodontal tissues of rats in each group(±s,n=10)

與對照組比較：*P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05；與川續(xù)斷皂苷Ⅵ組比較：ΔP＜0.05；與抑制劑組比較：▲P＜0.05。

組別對照組模型組川續(xù)斷皂苷Ⅵ組抑制劑組抑制劑+川續(xù)斷皂苷Ⅵ組Nfatc 0.05±0.01 0.46±0.05*1.03±0.06#0.38±0.04#0.75±0.06Δ▲CTSK 0.07±0.02 0.19±0.04*1.02±0.06#0.11±0.03#0.94±0.05Δ▲MMP-9 0.07±0.01 0.21±0.04*0.98±0.04#0.15±0.03#0.67±0.04Δ▲Notch 1 0.08±0.02 0.55±0.03*0.97±0.05#0.25±0.06#0.78±0.04Δ▲Jagged 1 0.12±0.05 0.56±0.06*1.01±0.07#0.31±0.05#0.93±0.06Δ▲

3 討論

牙槽骨吸收和新骨形成的骨改建過程是正畸牙移動的基礎，牙周膜干細胞在該過程中扮演重要角色，它連接牙槽骨和牙骨質(zhì)，是一層機械敏感的纖維軟組織，可將機械應力從牙齒傳導至牙槽骨，從而為參與壓力側(cè)牙槽骨吸收和張力側(cè)新骨沉積的細胞提供必要的微環(huán)境[8]。牙周組織改建是一個十分復雜的過程，涉及多種效應細胞和細胞因子，張力側(cè)牙槽骨內(nèi)側(cè)面受到牙周膜纖維的牽引誘導，大量成骨細胞產(chǎn)生，沿牙槽骨產(chǎn)生和沉積新生骨組織，而在壓力側(cè)受到牽引力的作用，牙周膜細胞成分向破骨細胞分化，大量破骨細胞聚集，使牙槽骨吸收，破骨細胞形成、吸收鄰近牙槽骨是牙移動的先決條件[9]。低能量微波照射可促進正畸牙移動大鼠牙周膜細胞向破骨細胞分化，加快正畸牙移動過程，促進牙周組織改建[10]。異丙腎上腺素在大鼠正畸牙移動過程中可增加壓力側(cè)破骨細胞數(shù)量，加快正畸牙移動速度[11]。早期研究表明，灌服川續(xù)斷水煎液可促進大鼠正畸牙移動過程中破骨細胞的增殖和分化，促進牙槽骨吸收和修復重建，但是川續(xù)斷成分復雜，具體是何種成分發(fā)揮作用尚不清楚[12]。研究發(fā)現(xiàn)，川續(xù)斷皂苷Ⅵ具有促進成骨細胞分化潛能，李燕燕等[13]報道其可促進人頜骨骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化。因此，本研究選用川續(xù)斷皂苷Ⅵ研究其對大鼠正畸牙移動的影響。

人牙周膜干細胞是一種具有良好成骨分化活性的間充質(zhì)干細胞，而Notch 1信號通路與間充質(zhì)干細胞早期分化具有密切聯(lián)系。Zhong 等[14]研究發(fā)現(xiàn)，在牙周膜干細胞成骨分化過程中，Notch 1 表達上調(diào)。因此，本研究通過Notch 1抑制劑DAPT和川續(xù)斷皂苷Ⅵ聯(lián)用探討川續(xù)斷皂苷Ⅵ對大鼠正畸牙移動的影響以及是否通過Notch 1 信號通路發(fā)揮作用。結果顯示：川續(xù)斷皂苷Ⅵ組大鼠第一磨牙移動距離較模型組增長，抑制劑組較模型組縮短；與川續(xù)斷皂苷Ⅵ組比較，抑制劑+川續(xù)斷皂苷Ⅵ組大鼠第一磨牙移動距離縮短；與抑制劑組比較，抑制劑+川續(xù)斷皂苷Ⅵ大鼠第一磨牙移動距離增長，由此可見川續(xù)斷皂苷Ⅵ可加快大鼠正畸牙移動速率，而抑制Notch 1信號通路后第一磨牙移動距離縮短，在使用抑制劑的基礎上聯(lián)用川續(xù)斷皂苷Ⅵ可拮抗抑制劑對第一磨牙移動速率的阻礙作用。HE 染色和TRAP 染色結果顯示：模型組和抑制劑組大鼠壓力側(cè)破骨細胞數(shù)量增加，并出現(xiàn)骨吸收陷窩，但是少于川續(xù)斷皂苷Ⅵ組和抑制劑+川續(xù)斷皂苷Ⅵ組，而抑制劑+川續(xù)斷皂苷Ⅵ組破骨細胞數(shù)量多于抑制劑組，以上結果說明：川續(xù)斷皂苷Ⅵ可促進大鼠正畸牙壓力側(cè)破骨細胞生成，且可抵抗Notch 1信號通路抑制劑對破骨細胞生成的抑制作用。

Nfatc、CTSK 和MMP-9 是參與破骨細胞分化成熟、促進骨基質(zhì)吸收降解的重要調(diào)控因子，直接反映破骨細胞的功能狀態(tài)[15]。研究發(fā)現(xiàn)，抑制Notch1 信號通路后，骨髓腔巨噬細胞破骨細胞分化的能力減弱，抑制骨吸收[16]。葛根素抑制Notch信號通路可抑制RAW264.7細胞破骨分化能力[17]。本研究結果顯示：模型組Nfatc、CTSK、MMP-9、Notch 1 和Jagged 1蛋白表達水平較對照組升高；川續(xù)斷皂苷Ⅵ組Nfatc、CTSK、MMP-9、Notch 1 和Jagged 1 蛋白表達水平較模型組升高；抑制劑+川續(xù)斷皂苷Ⅵ組Nfatc、CTSK、MMP-9、Notch 1 和Jagged 1 蛋白表達水平較川續(xù)斷皂苷Ⅵ組降低；抑制劑+川續(xù)斷皂苷Ⅵ組Nfatc、CTSK、MMP-9、Notch 1 和Jagged 1 蛋白表達水平較抑制劑組升高，此結果說明：川續(xù)斷皂苷Ⅵ可促進破骨細胞生成和成熟，而抑制Notch1 信號通路后發(fā)揮相反作用，但是川續(xù)斷皂苷Ⅵ可逆轉(zhuǎn)Notch 1信號通路對破骨細胞生成和成熟的抑制作用。此外，川續(xù)斷皂苷Ⅵ可激活Notch 1信號通路關鍵蛋白表達。

綜上所述，川續(xù)斷皂苷Ⅵ可加快大鼠正畸牙移動速率，促進破骨細胞的生成和成熟，其可能是通過激活Notch 1 信號通路發(fā)揮作用。本研究結果為臨床縮短牙齒、頜面畸形矯正周期提供了實驗依據(jù)。