江澤沅，柳羽哲，高 欣，曾 琦，閔偉紅*

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，小麥和玉米深加工國家工程實驗室，吉林 長春 130118）

蛋氨酸（Met）具有多種生理功能，在醫(yī)藥、飼料、食品等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[1]。在醫(yī)藥方面，Met具有保護(hù)肝臟、心肌、解毒、抗抑郁和降血壓等生理活性，在臨床治療上應(yīng)用廣泛[2]；在飼料方面，Met是禽畜類必需氨基酸之一，具有提供營養(yǎng)、提高動物免疫力和抗氧化力等功能[3]；在食品方面，Met被用作食品調(diào)味劑和營養(yǎng)強(qiáng)化劑。目前，工業(yè)上主要通過化學(xué)法和蛋白水解法獲得Met，微生物合成法由于過量積累的Met對微生物生長有害，未被大規(guī)模應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)[4]。

天冬氨酸族氨基酸代謝途徑是特異性生產(chǎn)M e t的氨基酸代謝途徑，天冬氨酸是谷氨酸棒狀桿菌（Corynebacterium glutamicum）中合成Met的前體物質(zhì)，在天冬氨酸激酶催化下生成天冬氨酰-4-磷酸，經(jīng)過天冬氨酸半醛脫氫酶催化合成天冬氨酸半醛[5]。高絲氨酸脫氫酶（homoserine dehydrogenase，HSD）參與天冬氨酸族氨基酸代謝途徑的第3步反應(yīng)，通過NADPH將L-天冬氨酸-β-半醛還原為L-高絲氨酸（L-homoserine，L-HSE），調(diào)控碳流向高絲氨酸生成的方向進(jìn)行，最終控制Met的合成[6]。因此，減弱或解除天冬氨酸族氨基酸代謝途徑中HSD的抑制作用能夠達(dá)到通過微生物合成法高產(chǎn)Met的目的。

H S D 是一種氧化還原酶，在谷氨酸棒狀桿菌中由hom基因編碼，催化中心在生物中具有不同折疊方式，其晶體結(jié)構(gòu)主要分為二聚體結(jié)構(gòu)和四聚體結(jié)構(gòu)。在嗜熱棲熱菌（Thermus thermophilus）[7]、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）[8]、極端嗜熱古菌（Hyperthermophilic archaeal）[9]、超嗜熱古菌（Sulfolobus tokodaii）[10]和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[11]中HSD為二聚體結(jié)構(gòu)；在枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）[12]、多核桿菌（Polynucleobacter）[13]和淋病奈瑟菌（Neisseria gonorrhoeae）[14]中HSD為四聚體結(jié)構(gòu)。

Ogata等[15]通過結(jié)構(gòu)分析，在超嗜熱古菌中發(fā)現(xiàn)半胱氨酸（Cys）位于高絲氨酸結(jié)合位點內(nèi)，并且Cys和煙酰胺環(huán)之間形成了共價鍵，進(jìn)而抑制HSD活力。Kubota等[16]通過Sulfurisphaera tokodaii重組HSD被熱處理后顯著激活，得出熱誘導(dǎo)活化是由于HSD催化區(qū)域的特定構(gòu)象發(fā)生變化。此外，Li Ning等[17]在谷氨酸棒狀桿菌中，通過強(qiáng)啟動子增強(qiáng)L-HSD和L-高絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶表達(dá)，進(jìn)一步通過發(fā)酵使O-乙酰-L-高絲氨酸提高產(chǎn)量。然而，對HSD基因突變生產(chǎn)Met的研究較少。申術(shù)霞等[18]成功獲得酶活力顯著提高的雙突變體L200F/D215K，為構(gòu)建高產(chǎn)Met工程菌提供了參考依據(jù)。因此，本研究在實驗室成功構(gòu)建pET-28a-HSD基礎(chǔ)上，對HSD進(jìn)行基因突變，以獲得高活力HSD，并進(jìn)一步對高酶活力菌株進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)表征。旨在通過對HSD分子空間結(jié)構(gòu)改造，為以后研究HSD催化機(jī)制和構(gòu)建高產(chǎn)Met工程菌株提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

谷氨酸棒狀桿菌ATCC13032、大腸桿菌BL21（DE3）和大腸桿菌DH5α均由本實驗室保存；pET-28a-HSD質(zhì)粒由實驗室構(gòu)建。

Taq聚合酶、定點突變試劑盒、核酸電泳Marker日本TaKaRa公司；非預(yù)染蛋白電泳Marker、基因組DNA抽提試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒、DNA膠回收試劑盒生工生物工程（上海）股份有限公司；高保真DNA聚合酶2×Phanta Max Master Mix Vazyme（中國）公司；異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（isopropyl-β-Dthiogalactopyranoside，IPTG）、卡那霉素 長春市翊博生物科技公司；LB（Luria-Bertani）培養(yǎng)基參照文獻(xiàn)[19]配制，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）試劑參照文獻(xiàn)[20]配制。

1.2 儀器與設(shè)備

TGL-20000CR低溫離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；空氣浴振蕩器 東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；鋁質(zhì)梯度聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀德國Eppendorf AG公司；隔水式恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實驗設(shè)備有限公司；可見分光光度計 沙鷹科學(xué)儀器（上海）有限公司；蛋白印記轉(zhuǎn)膜儀 美國Bio-Rad公司；SE260蛋白電泳儀 美國GE公司；UVP GelStudio Plus凝膠成像儀 德國耶拿公司。

1.3 方法

1.3.1 HSD突變體構(gòu)建

以6dzs晶體結(jié)構(gòu)為模板，利用同源建模方法獲得了HSD的三維結(jié)構(gòu)，使用軟件Autodock4對催化底物L(fēng)-HSE和NADP＋進(jìn)行分子對接，得到HSD與催化底物的復(fù)合結(jié)構(gòu)。采用Discovery Studio軟件[21]確定了突變的氨基酸位點，利用Primer 5.0軟件設(shè)計突變位點引物，以pET-28a-HSD質(zhì)粒為模板進(jìn)行飽和定點突變。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性90 s，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸10 min（擴(kuò)增20 個循環(huán)）；72 ℃延伸15 min。突變PCR完成后，使用1%瓊脂糖凝膠對PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳驗證，保證質(zhì)粒突變成功。隨后，將質(zhì)粒用DpnI酶在37 ℃金屬浴中消化2 h，消化體系為緩沖液18 μL、突變PCR產(chǎn)物2 μL、DpnI酶0.3 μL[22]。

將大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞在冰上冰浴30 min，加入10 μL消化后PCR突變產(chǎn)物，充分混勻后冰浴15 min，在42 ℃金屬浴熱擊90 s后再次冰浴10 min，加入900 μL LB液體培養(yǎng)基，放入37 ℃、190 r/min搖床中培養(yǎng)1～2 h。將復(fù)蘇的菌液5 000 r/min離心5 min，棄掉上清液，將剩余100 μL菌液吹打混勻后，均勻地涂布于含卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基中，在37 ℃培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)[23]。挑取平板上單菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，經(jīng)過菌液PCR驗證后，將成功轉(zhuǎn)化的菌液提取質(zhì)粒進(jìn)行測序。

1.3.2 突變體的表達(dá)和純化

將大腸桿菌DH5α成功突變pET-28a-HSD質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌株BL21中，挑取單菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，對菌液進(jìn)行PCR驗證，確保質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21中。按2%接種量接種到100 mL含卡那霉素的LB發(fā)酵培養(yǎng)基中，放在37 ℃搖床中培養(yǎng)2 h，當(dāng)菌液OD600nm值在0.6～0.8之間時加入100 μL誘導(dǎo)劑IPTG使其終濃度為1 mmol/L，放入搖床進(jìn)行26 ℃、180 r/min誘導(dǎo)14～16 h。誘導(dǎo)后的菌液4 ℃、8 000 r/min離心10 min，棄掉上清液，用預(yù)冷磷酸鹽緩沖溶液重懸菌體進(jìn)行超聲波破碎，4 ℃、8 000 r/min離心10 min，收集的上清液即為粗酶液。最后，將粗酶液進(jìn)行鎳柱純化處理得到純化液[24]。

1.3.3 HSD活力測定

將HSD的1 個酶活力單位定義為每10 min生成1 μmol NADPH所需要的酶量，其酶活力根據(jù)NADPH在340 nm波長處吸光度的變化進(jìn)行測定。反應(yīng)體系總體積為5 mL：100 mmol/L Tris-HCl（7.5）、10 mmol/L MgCl2、80 mmol/L KCl、1.2 mmol/L NADP＋、20 mmol/LL-HSE、100 μL酶液[25-26]。將反應(yīng)體系置于37 ℃水浴10 min后檢測NADPH在340 nm波長處吸光度變化量。通過考馬斯亮藍(lán)法測定酶液中蛋白含量，每組實驗做3 個平行[27]。

1.3.4 HSD最適pH值和最適反應(yīng)溫度測定

以L-HSE為底物，分別在不同pH值（6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5）和不同溫度（25、30、35、40、45、50 ℃）條件下進(jìn)行最適反應(yīng)pH值和最適反應(yīng)溫度測定。將最高酶活力定義為100%，每組實驗做3 個平行。

1.3.5 HSD熱穩(wěn)定性測定

將野生型（wild type，WT）和突變體分別置于最適溫度下水浴保溫，每隔1 h測定HSD活力，一共檢測9 h，進(jìn)而計算得出HSD活力半衰期。將0 h的酶活力定義為100%，每組實驗做3 個平行。

1.3.6 金屬離子、有機(jī)溶劑和底物抑制劑對HSD活力影響的測定

以L-HSE為底物，測定不同濃度（20、60、100、200 mmol/L）下K＋、Mg2＋和Ca2＋對HSD活力影響；測定不同體積分?jǐn)?shù)（1%、5%、10%、20%）甲醇、乙醇、乙腈和二甲基亞砜對HSD活力影響；測定不同濃度（1、5、10、20 mmol/L）的蘇氨酸（Thr）、Met、Thr＋Met對HSD活力影響。將不添加金屬離子、有機(jī)溶劑以及酶抑制劑的酶活力定義為100%，每組實驗做3 個平行。

1.3.7 酶動力學(xué)分析

在酶活力反應(yīng)體系中，以不同濃度（1、5、10、20、30、40、50、70、90、100、200 mmol/L）L-HSE為底物，測定HSD活力，每組實驗做3 個平行。根據(jù)Hill方程[25]V=Vmax[S]n/（K＋[S]n）在GraphPad Prism軟件中進(jìn)行非線性擬合。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 HSD突變位點選擇

采用同源建模獲得HSD三維結(jié)構(gòu)，通過AutoDock對底物進(jìn)行分子對接[26]，成功構(gòu)建HSD復(fù)合結(jié)構(gòu)（圖1）。通過Discovery Studio軟件確定底物周圍4 ?范圍內(nèi)氨基酸殘基，由于保守位點影響底物結(jié)合，同時，根據(jù)突變原則不能選擇CG含量過高位點，因此，選擇Asp61和Gly25兩個位點進(jìn)行突變，篩選出酶活力較WT提高的突變體。

圖1 突變位點選擇Fig.1 Selection of mutation sites

2.2 HSD基因飽和定點突變

將全質(zhì)粒擴(kuò)增突變PCR產(chǎn)物用瓊脂糖核酸電泳進(jìn)行驗證，pET-28a質(zhì)粒大小約為5 369 bp，HSD基因大小約為1 335 bp，因此，突變PCR產(chǎn)物大小約為6 700 bp。如圖2所示，在4 000～7 000 bp范圍內(nèi)靠近7 000 bp處出現(xiàn)一條明亮的條帶，表明突變成功。將突變PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21感受態(tài)中，經(jīng)過測序驗證突變成功，初篩獲得酶活力提高的兩個突變體A61L和G25G。測序結(jié)果表明，Asp61位點由Asp突變成賴氨酸（Lys），Gly25位點密碼子由GGA突變成G。

圖2 Gly25（A）和Asp61（B）飽和定點突變PCR核酸電泳Fig.2 Electrophoresis of PCR amplified products from Gly25 (A) and Asp61 (B) with site-directed saturation mutation

2.3 HSD蛋白表達(dá)和純化

將誘導(dǎo)表達(dá)的WT、A61L和G25G依次經(jīng)過前處理和鎳柱純化得到HSD純化液，SDS-PAGE結(jié)果（圖3）顯示，純化液在46 kDa附近有明顯單一條帶，表明HSD蛋白表達(dá)成功；Western Blot驗證結(jié)果表明，HSD純化液含有HSD蛋白。

圖3 SDS-PAGE及Western Blot驗證結(jié)果Fig.3 SDS-PAGE and Western blot of purified HSD

2.4 HSD酶動力學(xué)分析

測定數(shù)據(jù)用軟件GraphPad Prism 8進(jìn)行非線性擬合，如圖4所示。WT和突變體的酶動力學(xué)曲線符合Hill方程V=VmaxSn/（Kn＋Sn），表明HSD為典型的別構(gòu)酶。由表1可知，A61L和G25G突變體Vmax分別是WT的1.21 倍和1.35 倍。相比于WT，A61L和G25GKm值降低，表明突變體催化效率相較于WT提高，與底物親和力增強(qiáng)。WT、A61L和G25G的n值均大于1，說明WT和突變體呈正協(xié)同性，并且A61L和G25G的n值相對于WT顯著變小，說明別構(gòu)效應(yīng)減弱。

表1 WT和突變體的酶動力學(xué)參數(shù)Table 1 Enzyme kinetic parameters of WT and mutants

圖4 WT和突變體的酶動力學(xué)曲線Fig.4 Enzyme kinetic curves of WT and mutants

2.5 HSD酶學(xué)性質(zhì)

2.5.1 最適反應(yīng)pH值和最適反應(yīng)溫度分析

由圖5可知，與WT相比，突變體A61L和G25G最適溫度沒有顯著變化。在高溫環(huán)境下，A61L和G25G相對酶活力高于低溫，且顯著高于WT，表明突變體A61L和G25G更加耐高溫。此外，與WT相比，突變體A61L最適pH值沒有顯著變化，為8.0，突變體G25G最適pH值提高至8.5。在堿性環(huán)境下，突變體A61L和G25G相對酶活力高于WT，表明突變體更適應(yīng)堿性環(huán)境。

圖5 溫度（A）和pH值（B）對酶活力的影響Fig.5 Effect of temperature (A) and pH (B) on enzyme activity of WT and mutants

2.5.2 突變體熱穩(wěn)定性分析

由圖6可知，WT和突變體在40 ℃最適溫度下水浴保溫，隨著保溫時間延長，WT和突變體相對酶活力持續(xù)下降，且下降趨勢相似。與WT酶活力半衰期相比，突變體A61L酶活力半衰期增加至5.5 h，G25G酶活力半衰期減少至4.0 h。此外，突變體G25G在反應(yīng)初期（0～2 h）和反應(yīng)后期（7～9 h）相對酶活力均高于WT；然而，突變體A61L相對酶活力在整個反應(yīng)時間內(nèi)均高于WT。

圖6 WT和突變體的熱穩(wěn)定性Fig.6 Thermostability of WT and mutants

2.5.3 金屬離子對WT和突變體酶活力的影響

由表2可知，終濃度為20～200 mmol/L的K＋對WT、A61L和G25G有激活作用，隨著濃度增大相對酶活力增高，在終濃度為100 mmol/L時WT、A61L和G25G相對酶活力達(dá)到最高，隨后，增大濃度相對酶活力開始減弱；終濃度為20 mmol/L的Mg2＋對WT、A61L和G25G有激活作用，并且在該濃度下WT和突變體相對酶活力最高，隨著濃度增加相對酶活力降低；WT和A61L在Ca2＋終濃度為20 mmol/L和60 mmol/L時被激活，G25G在Ca2＋終濃度20、60 mmol/L和100 mmol/L時被激活，且隨著濃度增大相對酶活力減弱。以上結(jié)果表明，低濃度的K＋、Mg2＋和Ca2＋是WT和突變體的促進(jìn)劑，且隨著離子濃度增加抑制HSD活力。

表2 金屬離子對WT、A61L和G25G相對酶活力的影響Table 2 Effects of metal ions on relative enzyme activities of WT, A61L and G25G %

2.5.4 有機(jī)溶劑對WT和突變體酶活力的影響

由表3可知，不同體積分?jǐn)?shù)有機(jī)溶劑對WT、A61L和G25G均有抑制作用，但5%乙醇對WT有激活作用，在該體積分?jǐn)?shù)下WT相對酶活力達(dá)到最大，為115.11%；1%乙腈對A61L有激活作用，在該體積分?jǐn)?shù)下A61L相對酶活力為107.65%；1%、5%、10%乙醇以及1%甲醇對G25G有激活作用，在5%乙醇時相對酶活力達(dá)到最大，為125.64%。隨著有機(jī)溶劑體積分?jǐn)?shù)增大，WT、A61L和G25G相對酶活力下降。

表3 有機(jī)溶劑對WT、A61L和G25G相對酶活力的影響Table 3 Effects of organic solvents on relative enzyme activities of WT, A61L and G25G %

2.5.5 底物抑制劑對WT和突變體酶活力的影響

由表4可知，WT受Thr反饋抑制和Met阻遏抑制。隨著Thr和Met濃度增加，抑制作用顯著加強(qiáng)，當(dāng)Thr和Met抑制劑濃度增加至25 mmol/L時，對WT抑制率分別為83.67%和88.10%。當(dāng)兩種抑制劑組合濃度為25 mmol/L時，WT抑制率達(dá)到最高，為93.62%。在Thr、Met和Thr＋Met抑制劑濃度為1～25 mmol/L時，突變體A61L和G25G抑制率均低于WT，結(jié)果表明，突變有效地降低了Thr反饋抑制和Met阻遏抑制，且在Thr＋Met濃度為25 mmol/L下，突變體A61L和G25G抑制率達(dá)到最高。Thr對WT和突變體抑制作用弱于Met抑制劑，但Thr＋Met抑制作用顯著增強(qiáng)。

3 討 論

由于生物遺傳密碼子存在簡并現(xiàn)象，在某一堿基改變后，其原來的某種氨基酸位置譯成同一種氨基酸，此現(xiàn)象稱同義突變[28]。同義突變不會改變產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，但會對蛋白質(zhì)水平產(chǎn)生顯著影響[29-30]。同義突變主要是根據(jù)密碼子偏好性進(jìn)行最優(yōu)密碼子選擇。密碼子偏好性是翻譯效率的重要決定因素，其通過調(diào)節(jié)RNA加工、蛋白質(zhì)翻譯和蛋白質(zhì)折疊等多種過程加快翻譯速率，進(jìn)而提高酶的活性。鄭志強(qiáng)[31]利用密碼子偏好性對極端嗜熱細(xì)菌嗜熱棲熱菌的漆酶編碼基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化，得到了酶活力提高86 倍的漆酶；董聰?shù)萚32]通過對FAD依賴的葡萄糖脫氫酶進(jìn)行密碼子優(yōu)化，成功構(gòu)建高酶活力且穩(wěn)定表達(dá)的重組菌株，表明利用密碼子偏好性對酶編碼基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化能夠提高酶的活性。因此，本研究中突變體G25G在25位點密碼子為GGC，WT在25位點密碼子為GGA，根據(jù)大腸桿菌密碼子偏好性分析，GGC密碼子偏好性高于GGA密碼子偏好性，表明GGC密碼子對應(yīng)的tRNA比GGA密碼子對應(yīng)的tRNA具有數(shù)量優(yōu)勢，促進(jìn)翻譯過程中tRNA聚集，進(jìn)而加速翻譯延伸過程，最終提高HSD活性。

HSD晶體結(jié)構(gòu)空間變化和氫鍵改變均會導(dǎo)致酶活力升高或降低，WT 61位點為保守位點，A61L突變后，在位點側(cè)鏈形成一個類似細(xì)長的棒狀結(jié)構(gòu)，解除電荷相互作用，空間位阻降低，更容易與底物相結(jié)合，促進(jìn)酶-底物中間過渡態(tài)的形成和轉(zhuǎn)化。相較于WT，突變體A61LKm值由7.011 mmol/L降低到6.276 mmol/L，這也表明與底物作用力增強(qiáng)，提高其酶活力和底物親和力。

4 結(jié) 論

本研究對谷氨酸棒狀桿菌HSD關(guān)鍵位點Gly25和Asp61進(jìn)行飽和定點突變以達(dá)到增強(qiáng)底物親和力和提高酶活力、得到優(yōu)良單突變體的目的。通過互補引物進(jìn)行全質(zhì)粒擴(kuò)增，獲得2 個單突變體A61L和G25G。根據(jù)動力學(xué)分析，A61L和G25G突變體Vmax較WT分別提高到1.21 倍和1.35 倍，突變體與底物親和力增強(qiáng)。酶學(xué)性質(zhì)結(jié)果表明，突變體G25G最適pH值比WT提高，耐酸堿程度增加；2 個突變體最適溫度與WT一致，但耐熱性較WT提高；突變體A61L酶活力半衰期較WT延長，并表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性；低濃度K＋、Mg2＋和Ca2＋對突變體有激活作用；部分低體積分?jǐn)?shù)乙醇、甲醇、乙腈和二甲基亞砜對突變體有抑制作用。本研究為優(yōu)化谷氨酸棒狀桿菌HSD代謝途徑和促進(jìn)天冬氨酸族氨基酸生物合成產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供參考依據(jù)。