王玲玉,閆春梅,賈 夢(mèng),黃 璟,王安琪,汪軒羽,王新濤,李秀荷,王慧芳,戴福宏,李 寧,周中凱,*,高鐵成,*
(1.天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,天津 300457;2.江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 無(wú)錫 214122;3.新疆三禮糧油有限公司,新疆 圖木舒克 843900;4.廣州焙樂(lè)道食品有限公司,廣東 廣州 511400)
油莎豆(Cyperus esculentus)又稱(chēng)虎皮果、地下板栗、地下核桃等,目前主要種植于我國(guó)的北部和中部地區(qū),是一種優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、經(jīng)濟(jì)效益和生態(tài)效益兼?zhèn)涞淖魑颷1-2]。油莎豆中除含有豐富的脂肪(22.14%~44.92%)和淀粉(23.21%~48.12%)外,還含有大量的膳食纖維(8.26%~15.47%),且高于其他普通塊莖植物,通常用于制備食用油、淀粉和豆奶飲料等[3]。先前研究表明,油莎豆豆乳在加工過(guò)程中產(chǎn)生的固體廢料中膳食纖維含量高達(dá)59.71%,主要由不溶性膳食纖維組成,且與其他膳食纖維相比具有更強(qiáng)的持水、持油能力,可作為一種潛在的功能性食品[4]。因此,對(duì)油莎豆膳食纖維的開(kāi)發(fā)和利用具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
膳食纖維是一種不能被胃和小腸消化吸收的碳水化合物,通常需到達(dá)大腸被結(jié)腸微生物部分或完全降解[5]。研究報(bào)道,腸道微生物可利用膳食纖維產(chǎn)生短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids,SCFAs)(乙酸、丙酸和丁酸),促進(jìn)腸道微生物群中特定和有益細(xì)菌群的生長(zhǎng),并通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)素和黏附位點(diǎn)來(lái)防止病原體的潛在定植,降低結(jié)腸相關(guān)疾病以及一些代謝綜合征的風(fēng)險(xiǎn),如肥胖、糖尿病、慢性腎病和全身炎癥[5-7]。Yao Wanzi等[8]探究了米糠和麥麩中膳食纖維對(duì)腸道微生物的作用,結(jié)果表明膳食纖維可調(diào)節(jié)腸道菌群的生長(zhǎng)(Lactobacillus、Bifidobacterium、Enterobacter),并促進(jìn)SCFAs的產(chǎn)生維持宿主健康。夏潔[9]發(fā)現(xiàn)刺梨中不溶性膳食纖維顯著促進(jìn)乙酸的產(chǎn)生,并降低厚壁菌門(mén)與擬桿菌門(mén)的比例。此外,武明月等[10]探究大豆膳食纖維對(duì)小鼠腸道菌群的影響,結(jié)果表明大豆膳食纖維可增加阿克曼氏菌屬和糞桿菌屬豐度,并顯著增加了小鼠結(jié)腸內(nèi)SCFAs含量。同時(shí),Wang Yong等[11]的研究也發(fā)現(xiàn)富含膳食纖維的谷物如燕麥及苦蕎的攝入可增加腸道微生物L(fēng)actobacillus和Romboutsia的豐度,并伴隨著SCFAs尤其是丁酸在結(jié)腸中的高水平合成。
目前,油莎豆作為一種新型油料作物,大多研究主要集中于油脂及淀粉,其膳食纖維在人體內(nèi)的有益作用鮮見(jiàn)報(bào)道,本研究采用體外結(jié)腸發(fā)酵技術(shù),通過(guò)16S rRNA高通量測(cè)序,并以大豆膳食纖維為對(duì)照,探究油莎豆中膳食纖維對(duì)人體腸道菌群的作用及對(duì)短鏈脂肪酸產(chǎn)生的影響,為油莎豆的綜合利用提供了理論依據(jù)。
大豆膳食纖維為國(guó)內(nèi)生產(chǎn)的商業(yè)化產(chǎn)品;油莎豆粕新疆三禮糧油有限公司;耐高溫α-淀粉酶、水解蛋白酶和葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶,乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸標(biāo)準(zhǔn)品 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;蛋白胨、酵母膏、L-半胱氨酸鹽、膽鹽、VK1、吐溫-80、氯高鐵血紅素 北京奧博星生物有限公司;其他普通化學(xué)試劑購(gòu)于天津江天化工試劑有限公司。
DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;GZX-9146MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱上海博訊實(shí)業(yè)有限公司;TS-110XS水浴搖床 上??瞥綄?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;YQX-II厭氧培養(yǎng)箱 上海溪乾儀器設(shè)備有限公司;GI54TW立式自動(dòng)壓力蒸汽滅菌器上海馳通儀器有限公司;GC-2014氣相色譜儀 美國(guó)安捷倫公司。
1.3.1 油莎豆膳食纖維的提取
參照郭蕓[12]的方法并略作修改。準(zhǔn)確稱(chēng)取5 g油莎豆粉,用石油醚洗滌2 次,將烘干后的樣品與磷酸鹽緩沖溶液(pH 6)混合均勻,加入耐高溫α-淀粉酶在95 ℃攪拌1 h,冷卻至60 ℃后調(diào)節(jié)pH值為4.5,然后加入水解蛋白酶60 ℃水浴1 h,調(diào)節(jié)pH值至4.2,最后加入葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶,水浴1 h后滅酶30 min。將樣品離心20 min,沉淀分別用75%乙醇和丙酮洗滌2 次,真空抽濾,將烘干后樣品磨成粉過(guò)100 目篩,即油莎豆膳食纖維。
1.3.2 體外模擬腸道微生物發(fā)酵過(guò)程
采用新鮮人體糞便作為腸道微生物來(lái)源,對(duì)膳食纖維進(jìn)行體外發(fā)酵研究[13]。收集5 名健康志愿者(3 名男性和2 名女性)的糞便,要求志愿者在近3 個(gè)月未服用抗生素,且無(wú)腸道疾病。取等量的糞便樣品混合均勻,用0.1 mol/L pH 7.2的無(wú)菌磷酸鹽緩沖液稀釋至25%,均質(zhì)后,用4 層無(wú)菌紗布過(guò)濾,將濾液與培養(yǎng)基按照1∶4的比例進(jìn)行混合,作為發(fā)酵液。膳食纖維的添加量為1%和2%,其中油莎豆膳食纖維記為Y1、Y2,大豆膳食纖維記為D1、D2。以不添加膳食纖維樣品的糞便液為空白對(duì)照,分別取發(fā)酵點(diǎn)0 h和24 h的樣品,對(duì)應(yīng)標(biāo)記為CK0和CK24。樣品在37 ℃進(jìn)行厭氧發(fā)酵,并在0、12 h和24 h取樣測(cè)定發(fā)酵液中SCFAs和腸道微生物的變化。
基礎(chǔ)培養(yǎng)基由蛋白胨(2 g/L)、酵母提取物(2 g/L)、NaCl(0.1 g/L)、K2HPO4(0.04 g/L)、KH2PO4(0.04 g/L)、MgSO4·7H2O(0.01 g/L)、NaHCO3(2 g/L)、C a C l2·6 H2O(0.0 1 g/L)、L-半胱氨酸鹽酸鹽(0.5 g/L)、膽汁鹽(0.5 g/L)、VK1(10 μL/L)、吐溫80(2 mL/L)和血紅素(50 mg/L)組成。
1.3.3 SCFAs含量的測(cè)定
參照Wang Anqi等[14]的方法。取500 μL上清液于2 mL離心管中,加入10% H2SO4渦旋30 s調(diào)節(jié)pH值至2~3,然后加入800 μL乙醚,渦旋30 s后,離心20 min(4 ℃、10 000 r/min),上清液用0.22 μm濾膜過(guò)濾后測(cè)定SCFAs含量。其中進(jìn)樣量為1 μL,分流比20∶1;載氣為氮?dú)?,流量? mL/min;升溫程序如下:在140 ℃保持3 min,然后以6 ℃/min的速率增加到190 ℃維持15 min。使用乙酸、丙酸、丁酸、戊酸和己酸的標(biāo)準(zhǔn)混合物確定SCFAs的含量。
1.3.4 微生物16S rRNA基因測(cè)序
在Illumina NovaSeq測(cè)序平臺(tái)上構(gòu)建高通量測(cè)序文庫(kù)并進(jìn)行配對(duì)端測(cè)序。從糞便樣品中提取DNA后,通過(guò)PCR擴(kuò)增,熒光定量和NovaSeq PE250測(cè)序,在97%的序列相似度水平上,對(duì)所有序列進(jìn)行操作分類(lèi)單元(operational taxonomic units,OTUs)聚類(lèi),并進(jìn)行物種注釋及豐度分析;通過(guò)α多樣性、β多樣性分析以及主坐標(biāo)分析(principal co-ordinates analysis,PCoA),對(duì)樣本微生物群落組成差異性進(jìn)行分析。
采用Origin對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行整理,采用SPSS 22.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析,結(jié)果用±s表示,P<0.05,差異顯著。
腸道微生物可作用于未消化的碳水化合物產(chǎn)生SCFAs,其中膳食纖維發(fā)酵產(chǎn)生的SCFAs被認(rèn)為是結(jié)腸的主要營(yíng)養(yǎng)和能量來(lái)源,可為結(jié)腸細(xì)胞提供能量,降低結(jié)腸中pH值、抑制病原體、維持腸道屏障的完整性[5]。由圖1可得,乙酸、丙酸和丁酸是腸道微生物產(chǎn)生的主要SCFAs。與空白相比,膳食纖維的加入可顯著增加總SCFAs的含量,其中大豆膳食纖維產(chǎn)生的SCFAs顯著高于油莎豆。研究表明,大豆膳食纖維產(chǎn)生的乙酸、丙酸和丁酸含量比燕麥麩皮、玉米麩皮或麥麩纖維多1.5~8.0 倍[10]。膳食纖維一般分為可溶性纖維和不溶性纖維,相比于大豆膳食纖維,油莎豆不溶性膳食纖維含量較高,發(fā)酵程度較慢,不易被微生物降解,這可能是油莎豆產(chǎn)酸能力較弱的原因[15]。由圖1可知,經(jīng)腸道微生物發(fā)酵后,與空白組(CK24)相比,膳食纖維組在發(fā)酵24 h后,其乙酸質(zhì)量濃度增加了0.16~0.34 mg/mL,乙酸是人體腸道中含量較高的SCFAs,約占60%左右,不僅為肝臟和周?chē)M織提供能量,而且在糖異生和脂肪生成中發(fā)揮重要作用[16]。丙酸是膳食纖維發(fā)酵后變化較大的SCFAs,發(fā)酵24 h后,其質(zhì)量濃度增加了0.12~0.56 mg/mL,丙酸能降低肝臟和血漿中脂肪酸的含量,抑制膽固醇的合成,在減少食物誘導(dǎo)的腸道激素方面發(fā)揮重要作用[17]。此外,膳食纖維可顯著促進(jìn)腸道微生物中丁酸的含量,發(fā)酵24 h后,其質(zhì)量濃度增加了0.09~0.41 mg/mL,丁酸可以作為結(jié)腸上皮細(xì)胞的能量來(lái)源,提供大約60%~70%的總能量需求,這有助于預(yù)防結(jié)腸癌,減少細(xì)菌移位和炎癥,并改善屏障功能[18-20]。研究表明大豆膳食纖維和麥麩膳食纖維可顯著增加乙酸、丙酸和丁酸含量,這與本研究結(jié)果一致[10,21]。同時(shí),由圖1可知,相比于大豆膳食纖維,油莎豆膳食纖維在發(fā)酵后期其產(chǎn)酸速率顯著低于大豆,研究表明化學(xué)結(jié)構(gòu)和物理形態(tài)是影響發(fā)酵速度、SCFAs產(chǎn)生和微生物生長(zhǎng)的關(guān)鍵因素,包括糖苷鍵組成、分子質(zhì)量、分子排列水平和粒徑等[22]。
圖1 發(fā)酵過(guò)程中SCFAs的變化Fig.1 Production of SCFAs during fermentation
2.2.1 OTU數(shù)及α多樣性分析
人類(lèi)腸道微生物在長(zhǎng)期競(jìng)爭(zhēng)和進(jìn)化過(guò)程中與宿主相互依賴(lài),并在健康、營(yíng)養(yǎng)、代謝特性和免疫穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[23]。采用16S rRNA高通量測(cè)序技術(shù),研究膳食纖維對(duì)腸道微生物的影響,不同樣品的注釋情況如圖2所示。圖2A由各樣品中總OTU數(shù)所繪制,重疊部分代表不同樣品中共有的OTU數(shù),共521 個(gè),且相比于空白組,添加膳食纖維的發(fā)酵液中的OTU數(shù)發(fā)生顯著變化,各樣品中獨(dú)有的OTU分別為76、58、31和136。其中添加量為2%的油莎豆膳食纖維中特有的OTU最多,表明高濃度的油莎豆膳食纖維可顯著改變腸道菌群的組成。
圖2 腸道菌群Venn圖(A)和α多樣性指數(shù)(B)Fig.2 Venn diagram (A) and α-diversity indexes (B) of gut microbiota
α多樣性通常代表腸道微生物的多樣性,結(jié)果如圖2B所示,ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)代表菌落豐富度,Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)代表菌落多樣性[18]。發(fā)酵24 h后,相比于空白組,添加量為1%的油莎豆膳食纖維組中ACE、Chao1、Shannon和Simpson指數(shù)無(wú)顯著變化,而添加量為2%時(shí),其α多樣性指數(shù)均顯著降低,大豆膳食纖維的發(fā)酵也體現(xiàn)出同樣特征,呈現(xiàn)出腸道微生物多樣性與膳食纖維干預(yù)劑量的依賴(lài)性,這可能表明在發(fā)酵過(guò)程中因?yàn)樨S富膳食纖維的存在,導(dǎo)致代謝行為的旺盛,從而抑制了某些微生物的生長(zhǎng)。
2.2.2β多樣性分析
β多樣性是對(duì)不同樣本中微生物群落構(gòu)成相似度進(jìn)行比較分析。本研究基于Weighted Unifrac距離和Unweighted Unifrac距離進(jìn)行PCoA,并選取貢獻(xiàn)率最大的主坐標(biāo)組合進(jìn)行分析,具有高度相似的群落結(jié)構(gòu)的樣本聚集在一起,而群落差異很大的樣本則會(huì)顯著分離。由圖3可得,發(fā)酵24 h后,發(fā)酵液中的腸道菌群發(fā)生顯著變化,其中空白組與樣品組彼此分離,表明膳食纖維的加入可改善腸道菌群結(jié)構(gòu)。此外,添加1%的樣品組與空白組距離較近,而與2%樣品組的距離較遠(yuǎn),表明高濃度的膳食纖維能明顯地改變腸道菌群結(jié)構(gòu),這與α多樣性結(jié)果一致。此外,油莎豆和大豆膳食纖維2 組樣品彼此分離且距離較遠(yuǎn),表明這2 種膳食纖維對(duì)腸道菌群發(fā)揮著不同的作用,這可能與各自結(jié)構(gòu)有關(guān),其中大豆膳食纖維含有較高的可溶性組分,具有快速的發(fā)酵動(dòng)力學(xué)特征;而油莎豆膳食纖維是以不溶性膳食纖維為主成分,腸道菌群對(duì)其利用速率較低,從而導(dǎo)致2 種膳食纖維對(duì)腸道菌群的多樣性產(chǎn)生不同影響。
圖3 腸道微生物PCoAFig.3 PCoA plots of gut microbiota
通過(guò)對(duì)門(mén)水平微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,結(jié)果表明厚壁菌門(mén)(Firmicutes)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidota)、變形菌門(mén)(Proteobacteria)和放線菌門(mén)(Actinobacteria)是樣品中的優(yōu)勢(shì)菌群,和先前所報(bào)道的人體腸道微生物菌群組成[18]一致。由圖4可知,除添加量為2%的大豆膳食纖維外,膳食纖維的添加均可增加厚壁菌門(mén)和放線菌門(mén)的相對(duì)豐度,同時(shí)降低擬桿菌門(mén)的豐度,這與王勇[19]及Dewulf[24]等的研究結(jié)果一致。此外,油莎豆樣品組中厚壁菌門(mén)的相對(duì)豐度高于大豆組,許多可以利用碳水化合物的微生物,包括益生菌乳酸菌,都屬于厚壁菌門(mén),其豐度的增加通常與發(fā)酵底物有關(guān),且研究表明高纖維飲食可促進(jìn)小鼠體內(nèi)厚壁菌門(mén)的增加[25]。擬桿菌中含有多種碳水化合物活性酶,以產(chǎn)乙酸和丙酸為主,可專(zhuān)門(mén)降解和利用多糖[17]。在本研究中添加量為2%的大豆膳食纖維顯著促進(jìn)了擬桿菌門(mén)的生長(zhǎng),且厚壁菌門(mén)/擬桿菌門(mén)的比值顯著降低。先前研究通常用厚壁菌門(mén)/擬桿菌門(mén)的比值用來(lái)衡量腸道微生物菌群是否出現(xiàn)生態(tài)失調(diào),其比值降低可減少能量的吸收,降低肥胖風(fēng)險(xiǎn),然而也有研究表明兩者的比值并不是確定肥胖的確切指標(biāo)[26]。此外,添加量為2%的油莎豆膳食纖維增加了變形菌門(mén)的相對(duì)豐度,同時(shí)由屬水平結(jié)構(gòu)可得主要為大腸桿菌,先前研究表明,大腸桿菌對(duì)人體的健康存在雙重效應(yīng),在某些情況下,大腸桿菌的缺失可造成疾病的發(fā)生[27-28]。同時(shí),由圖4可知,油莎豆膳食纖維可顯著增加放線菌門(mén)的相對(duì)豐度,而大豆膳食纖維無(wú)顯著變化。放線菌是一類(lèi)可以產(chǎn)生抗菌素和酶的微生物,其主要優(yōu)勢(shì)菌是雙歧桿菌,在調(diào)節(jié)腸道健康方面發(fā)揮重要作用。Dominianni等[29]的研究證明大豆、蔬菜、水果中的膳食纖維均能夠增加放線菌的豐度,對(duì)胃腸道乃至整個(gè)機(jī)體的健康有重要意義。
圖4 門(mén)水平(A)和屬水平(B)微生物組成Fig.4 Composition of microbial community at phylum (A) and genus (B) levels
選取屬水平豐度前30的微生物進(jìn)行分析,如圖4、5所示。結(jié)果表明,膳食纖維的添加對(duì)腸道菌群的組成產(chǎn)生一定影響。大豆纖維膳食顯著增加了普雷沃菌屬(Prevotella)的相對(duì)豐度,而油莎豆膳食纖維降低了該菌的相對(duì)豐度。普雷沃菌屬是腸道發(fā)酵中的重要微生物,可分解木聚糖和其他的植物纖維產(chǎn)生SCFAs,研究表明靈芝中膳食纖維可促使Prevotella豐度的降低,降低了血清胰島素抵抗水平[26,30]。由圖4可知,膳食纖維的添加降低了擬桿菌屬(Bacteroides)的相對(duì)豐度,尤其是油莎豆膳食纖維分別降低了7%和14%。擬桿菌屬是一種革蘭氏陰性菌,長(zhǎng)期寄居在人體腸道中,是引起腸道疾病的常見(jiàn)微生物,其富集會(huì)引發(fā)炎癥反應(yīng)和糖尿病[31]。此外,油莎豆膳食纖維可顯著增加罕見(jiàn)小球菌屬(Subdoligranulum)的相對(duì)豐度,Subdoligranulum是近年來(lái)在人體糞便中新發(fā)現(xiàn)的球菌屬,廣泛存在于健康人體內(nèi),可降低機(jī)體炎癥水平、增強(qiáng)腸胃動(dòng)力,并控制血糖水平[32]。由圖5可知,與空白組CK24對(duì)比,油莎豆膳食纖維組可顯著增加雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)的相對(duì)豐度,且添加量越高其豐度越高。此外,乳桿菌(Lactobacillus)在低濃度下的膳食纖維發(fā)酵液中顯著增加,且油莎豆膳食纖維中的豐度高于大豆。雙歧桿菌和乳酸菌是腸道內(nèi)重要的益生菌,已被證明能降低腸道脂多糖的合成,增強(qiáng)腸道屏障功能,降低炎癥和肥胖發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[5]。先前多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn),谷物、豆渣、紅棗、香蕉等食物中的膳食纖維均能夠促進(jìn)雙歧桿菌和乳桿菌的增殖[19,33]。丁酸的產(chǎn)生通常與瘤胃球菌屬(Ruminococcus)和糞桿菌屬(Faecalibacterium)呈顯著正相關(guān)[5]。在本研究中,高濃度的膳食纖維可顯著增加這2 種菌屬的相對(duì)豐度,且油莎豆中其相對(duì)豐度顯著高于大豆,表明油莎豆膳食纖維具有更強(qiáng)的促進(jìn)有益菌生長(zhǎng)的能力。
圖5 腸道菌群豐度熱圖分析(屬水平)Fig.5 Heatmap of the relative abundance of intestinal microbiota (at genus level)
綜上所述,通過(guò)對(duì)腸道微生物的分析,結(jié)果表明膳食纖維在低濃度時(shí)對(duì)腸道菌群的影響較小,而在高濃度時(shí)可顯著改變腸道菌群的多樣性和豐富度,同時(shí)2 種膳食纖維對(duì)腸道菌群的作用各不相同;在微生物門(mén)水平上,油莎豆膳食纖維的添加促進(jìn)了厚壁菌、放線菌和變形菌的生長(zhǎng),而抑制了擬桿菌門(mén)的豐度;屬水平結(jié)果顯示,相比于大豆膳食纖維,油莎豆膳食纖維的添加可顯著增加罕見(jiàn)小球菌屬、雙歧桿菌屬、乳桿菌、瘤胃球菌屬和糞桿菌屬的相對(duì)豐度,但普雷沃菌屬和擬桿菌屬被顯著抑制。
利用體外結(jié)腸發(fā)酵技術(shù),以大豆膳食纖維為對(duì)照,探究油莎豆中膳食纖維對(duì)腸道微生物的影響。結(jié)果表明:油莎豆膳食纖維可顯著促進(jìn)SCFAs的產(chǎn)生,但產(chǎn)酸量弱于大豆膳食纖維,且隨著添加量的增加,其產(chǎn)酸能力增強(qiáng);添加量為1%的膳食纖維對(duì)腸道菌群的多樣性和豐富度無(wú)顯著影響,而在高濃度時(shí)可顯著改變腸道菌群結(jié)構(gòu),且2 種膳食纖維對(duì)菌群結(jié)構(gòu)的影響具有顯著差異;在高濃度時(shí),添加油莎豆膳食纖維可顯著增加厚壁菌門(mén)、變形菌門(mén)和放線菌門(mén)的相對(duì)豐度,而降低了擬桿菌門(mén)的豐度,且與大豆膳食纖維對(duì)門(mén)水平腸道菌群作用相反;此外,與大豆膳食纖維相比,油莎豆膳食纖維促進(jìn)雙歧桿菌屬、乳桿菌、瘤胃球菌屬、糞桿菌屬和罕見(jiàn)小球菌屬生長(zhǎng)繁殖的能力更強(qiáng),同時(shí)顯著降低了普雷沃菌屬和擬桿菌屬的相對(duì)豐度。以上結(jié)果表明,膳食纖維可促進(jìn)SCFAs的產(chǎn)生,并調(diào)節(jié)腸道微生物菌群結(jié)構(gòu),但不同來(lái)源的膳食纖維對(duì)腸道菌群的作用有所差異,本研究為油莎豆膳食纖維在功能性食品的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。