代欣欣，呂懿超，殷小鈺，竇慶哲，孔保華，陳 倩,*，秦立剛*

（1.東北農業(yè)大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.昆明理工大學食品科學與工程學院，云南 昆明 650500；3.東北農業(yè)大學動物科學技術學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

肉制品的風味會直接影響消費者的接受程度，醛、酮、醇和酯類等揮發(fā)性化合物主要源于加工及貯藏過程中碳水化合物的分解和代謝、蛋白和脂質的水解以及脂質的氧化作用[1-3]。其中，肌肉蛋白作為肉及肉制品的主要成分之一，不僅是衡量其營養(yǎng)價值的重要指標，且對肉制品的風味形成有重要的影響。肌原纖維蛋白（myofibrillar proteins，MPs）作為肌肉蛋白的重要組成成分，約占肌肉蛋白總量的55%～65%[4]，在肉制品加工特性及品質特性等方面起著至關重要的作用。

肌肉蛋白在肉及肉制品的加工及貯藏過程中會不可避免的受到氧化攻擊[5-6]。氧化會導致肌肉蛋白的氨基酸側鏈發(fā)生化學修飾以及肽骨架結構的改變，進而對蛋白質結構及性質產生影響[7]。適當?shù)难趸幚砜梢蕴岣叩鞍踪|的乳化性、凝膠性等加工特性，進而改善肉制品的食用品質，還可以促進人體內蛋白酶對蛋白質的水解，有助于消化吸收[8-9]。然而過度的氧化會造成肉制品顏色、質構及風味劣變，以及營養(yǎng)損失[10]。由此可見，蛋白質氧化對肉制品品質具有雙面性的影響。

蛋白氧化對風味形成的影響可表現(xiàn)為以下2 個方面：一是對風味物質產生的影響。蛋白氧化既可產生羰基化合物進而形成Strecker醛，又可影響蛋白質的降解程度，進而影響小肽和游離氨基酸等風味物質及前體物質的生成[11-12]；二是對風味物質結合的影響。蛋白氧化會導致蛋白質結構的變化，進而影響其與風味化合物的結合能力。周非白[13]研究發(fā)現(xiàn)，氧化后MPs結構的改變影響了其結合特征風味物質的能力。汪娟[14]研究了氧化對大豆分離蛋白與風味化合物結合的影響，低氧化程度下有利于大豆分離蛋白與風味化合物的疏水相互作用，而高氧化程度下，大豆分離蛋白對己醛和壬醛的結合能力下降。基于此，本研究建立羥自由基氧化體系（0.1 mmol/L FeCl3，0.1 mmol/L抗壞血酸，H2O2濃度分別選擇0、0.25、0.5、1.0、2.5、5.0、10 mmol/L和25 mmol/L），研究不同氧化程度對MPs與4 種典型醛類化合物（3-甲基丁醛、戊醛、己醛和庚醛）相互作用的影響及機制。采用氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用技術對MPs與醛類的結合能力進行測定，并采用紫外光譜、熒光光譜、熒光猝滅分析、熱力學分析、同步熒光光譜和圓二色譜對氧化的MPs與醛類的作用機制進行分析，以期為肉制品的風味調控提供理論基礎和技術指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

市購新鮮豬背最長肌取自按GB/T 17236—2019《畜禽屠宰操作規(guī)程 生豬》屠宰的哈爾濱白豬（平均月齡6 個月），用盛有碎冰的保溫盒將原料肉運回實驗室后，立即使用。

3-甲基丁醛、戊醛、己醛和庚醛 美國Sigma公司。氯化鐵、抗壞血酸、過氧化氫等化學試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

ME204E電子分析天平 梅特勒-托利多（上海）有限公司；FK-A（JJ-2）組織搗碎機 常州普天儀器制造有限公司；L720R-3高速冷凍離心機 湖南湘儀實驗儀器開發(fā)有限公司；PB-10 pH計 賽多利斯公司；TU-1800紫外-可見光分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；F-7100熒光分光光度計 日本日立公司；Chirascan圓二色光譜儀 英國應用光物理公司；GCMS-QP 2020 NX GC-MS聯(lián)用儀 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 MPs的提取

參照Chen Qian等[15]的方法，將豬背最長肌剔除外部脂肪和結締組織，切碎稱質量，加入4 倍體積的提取液（10 mmol/L Na2HPO4、10 mmol/L NaH2PO4、0.1 mol/L NaCl、2 mmol/L MgCl2和1 mmol/L乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸，pH 7.0），用組織搗碎機攪碎，離心（3 500 r/min，15 min），重復上述操作2 次，取沉淀加入4 倍體積0.1 mol/L NaCl洗液，攪碎，離心（3 500 r/min，15 min），重復上述操作1 次，取沉淀再加入4 倍體積洗液，攪碎，4 層紗布過濾，用1.0 mol/L HCl調整濾液pH值至6.0，離心（3 500 r/min，15 min），整個提取過程于4 ℃條件下進行，得到的MPs于2～4 ℃保存。采用雙縮脲法用牛血清蛋白制作標準曲線對蛋白濃度進行測定，用于后續(xù)研究。

1.3.2 MPs的氧化處理

參照Li Chunqiang等[16]的方法稍作修改，采用羥基自由基氧化體系，主要由FeCl3、抗壞血酸和H2O2通過鐵的氧化還原反應而產生自由基。體系中FeCl3和抗壞血酸的濃度為固定值，即0.1 mmol/L FeCl3和0.1 mmol/L抗壞血酸，H2O2濃度分別選擇0、0.25、0.5、1.0、2.5、5、10 mmol/L和25 mmol/L。用含有上述氧化體系的20 mmol/L磷酸鹽緩沖液（20 mmol/L Na2HPO4、20 mmol/L NaH2PO4、0.6 mol/L NaCl，pH 6.0）將提取的MPs質量濃度調整為20 mg/mL。然后將樣品放置在4 ℃氧化6 h，以得到不同氧化程度的MPs。最后，通過添加2,6-二叔丁基對甲酚（1 mmol/L）終止氧化反應。未經任何處理的蛋白為對照組。

1.3.3 結合能力測定

頂空風味化合物的含量測定參照Wang Haitang等[17]的方法稍作修改。用固相微萃取法結合GC-MS測定。將8 mL經氧化處理的MPs（6 mg/mL）置于20 mL的頂空萃取瓶中，加入4 種醛類，調節(jié)其終質量濃度為5 mg/L，用PTEE硅膠隔墊密封。空白組用20 mmol/L磷酸鹽緩沖液替代MPs，其余保持一致。萃取瓶置于30 ℃平衡12 h后，用固相微萃取頭在30 ℃條件下萃取30 min，富集揮發(fā)性化合物，然后將萃取頭在進樣口220 ℃解吸附5 min，用GC-MS對萃取物進行分離鑒定。

GC條件：InertCapWaX惰性毛細管氣相色譜柱（0.25 mm×60 m，0.25 μm）；載氣為氦氣，流速1 mL/min；起始溫度38 ℃，保持6 min，6 ℃/min 升溫至105 ℃，隨后以15 ℃/min升溫至220 ℃，保持5 min。

MS條件：電子電離源，正離子模式；離子源溫度200 ℃；電子能量為70 eV；質量掃描范圍m/z35～350。蛋白樣品頂空風味化合物含量以百分比表示（設定空白組中頂空的風味化合物含量為100%）。按式（1）、（2）計算：

1.3.4 相互作用機制研究

1.3.4.1 蛋白樣品制備

選取MPs與4 種醛類結合能力最強所用的H2O2濃度，對MPs進行氧化處理。取0.5 mL經氧化處理的MPs（6 mg/mL）分別與不同體積（0、50、100、150、200 μL和250 μL）的醛類化合物儲備液（100 mg/L）混合，使醛類化合物的終質量濃度分別為0、1、2、3、4 mg/L和5 mg/L；然后，用磷酸鹽緩沖液補充至體系體積為5 mL，渦旋混勻，置于相應的溫度反應后進行紫外光譜、熒光光譜和圓二色譜分析。

1.3.4.2 紫外光譜分析

參照申輝[18]的方法稍作修改，將1.3.4.1節(jié)配制的樣品分別置于（20±1）℃反應30 min。磷酸鹽緩沖液作為基線，掃描范圍190～400 nm，每個樣品掃描3 次。

1.3.4.3 熒光光譜、熒光猝滅及熱力學分析

參照Shen Hui等[19]的方法稍作修改，將1.3.4.1節(jié)配制的樣品分別置于293、303 K和310 K反應40 min后進行熒光光譜分析。發(fā)射熒光光譜條件：激發(fā)和發(fā)射波長的狹縫寬度均為5 nm，激發(fā)波長為280 nm，掃描范圍為240～450 nm。同步熒光光譜條件與發(fā)射熒光光譜類似，在激發(fā)波長和發(fā)射波長間隔Δλ＝15 nm和Δλ＝60 nm時分別進行掃描。

采用Stern-Volmer方程進行熒光猝滅分析，如式（3）所示：

式中：F0為未添加猝滅劑時蛋白的熒光強度；F為添加猝滅劑時蛋白的熒光強度；Kq為猝滅速率常數(shù)/（L/（mol?s））；Ksv為猝滅常數(shù)/（L/mol）；[Q]為猝滅劑濃度/（mol/L）；τ0為未添加猝滅劑時生物大分子的熒光壽命（平均值約為10-8s）。

采用Stern-Volmer改進方程及Van’t Hoff方程進行熱力學分析，如式（4）～（6）所示：

式中：F0為未添加猝滅劑時蛋白的熒光強度；F為添加猝滅劑時蛋白的熒光強度；Ka為結合常數(shù)；n為結合位點數(shù)；[Q]為猝滅劑濃度/（mol/L）。

式中：K為相應溫度下的結合常數(shù)Ka；ΔH為焓變；ΔS為熵變；ΔG為吉布斯自由能變；R為氣態(tài)常數(shù)（8.314 J/（mol?K））；T為熱力學溫度。

1.3.4.4 圓二色譜分析

參照Zhang Chao等[20]的方法，將1.3.4.1節(jié)配制的樣品分別置于（20±1）℃反應40 min。在Chirascan光譜儀上獲得圓二色譜，用磷酸鹽緩沖液作背景，每個樣品掃描3 次，扣除背景后求平均值。圓二色譜在室溫下進行掃描，氮氣（N2）充當保護氣，掃描范圍200～260 nm，掃描速率120 nm/min，掃描間隔1 nm。氨基酸殘基的平均摩爾分子質量為110 g/mol。使用Chirascan光譜儀提供的CDNN程序計算蛋白質的二級結構相對含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結果與分析

2.1 結合能力分析

如圖1所示，不含蛋白的空白組中風味化合物的頂空含量為100%，當頂空含量小于100%時，則表示蛋白對風味化合物有相互作用。風味化合物的頂空含量越小，表明蛋白對其的結合能力越強[21]。對照組中3-甲基丁醛、戊醛、己醛和庚醛的頂空含量均小于100%，表明MPs對它們均有結合能力，并且MPs對醛類的結合能力隨碳鏈長度的增加而增大，庚醛＞己醛＞戊醛＝3-甲基丁醛。在4 種醛類中，庚醛與MPs的結合能力最強（P＜0.05），這可能是碳鏈較長的化合物具有較小的空氣/水分配系數(shù)（化合物更難在氣相中分散，更容易在水相中結合蛋白質），3-甲基丁醛和戊醛與MPs的結合能力沒有顯著性差異，這是由于3-甲基丁醛（1.08×10-2）的空氣/水分配系數(shù)相對低于戊醛（1.31×10-2），更容易在水相中結合蛋白質，而3-甲基丁醛又表現(xiàn)出空間位阻效應，會阻止其與蛋白質結合，這些原因相互作用下使得3-甲基丁醛和戊醛與MPs的結合能力沒有顯著性差異[17]。另外，隨著氧化程度的增加，除了3-甲基丁醛，3 種醛類的頂空含量均呈現(xiàn)先降低后增加的趨勢，表明戊醛、己醛和庚醛與MPs的結合能力先增加后降低，并在1.0 mmol/L H2O2氧化處理時MPs與4 種醛的結合能力達到最大（P＜0.05）。低氧化程度下（H2O2≤1.0 mmol/L），MPs對4 種醛的結合能力隨著氧化程度的增加而增強，可能是由于低強度的氧化使得MPs結構展開，暴露出內部的疏水性氨基酸，增強了MPs與4 種醛的疏水相互作用[18]。然而，高氧化程度下（H2O2≥1.0 mmol/L），隨著氧化程度的加深MPs與4 種醛的結合能力降低，可能是由于過度的氧化使蛋白質發(fā)生聚集[13]，阻礙了MPs與4 種醛的結合[14]。

圖1 不同氧化程度處理對MPs與4 種醛類化合物結合能力的影響Fig.1 Effects of different oxidation levels on the binding capacity of MPs with four selected aldehydes

2.2 紫外光譜分析

由2.1節(jié)中結合能力分析結果可知，H2O2濃度為1.0 mmol/L時MPs結合4 種醛類的能力最強，因此后續(xù)相互作用機制研究均采用1.0 mmol/L H2O2氧化處理MPs。紫外光譜是一種用來研究蛋白質結構變化的有效方法，其譜圖變化可以用來衡量生物分子之間是否發(fā)生了相互作用[22-23]。由圖2可知，MPs在波長208 nm和280 nm附近有2 個特征吸收峰。208 nm的峰源于蛋白質內部的肽鍵，280 nm的峰源于蛋白質內部的芳香族氨基酸（色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）和苯丙氨酸）殘基[24-25]。經預實驗可知，4 種醛類在200～400 nm范圍均沒有明顯的吸收峰。隨著醛類質量濃度增加，MPs在波長208 nm附近的吸收峰發(fā)生了波動，說明4 種醛類均改變了MPs的構象，即4 種醛類與MPs發(fā)生了相互作用。然而，MPs在波長280 nm附近的吸收峰沒有明顯改變，表明4 種醛類與MPs未形成穩(wěn)態(tài)復合物，即其與MPs發(fā)生了動態(tài)猝滅[26]。

圖2 經1.0 mmol/L H2O2氧化處理的MPs與不同濃度3-甲基丁醛（A）、戊醛（B）、己醛（C）和庚醛（D）作用后的紫外吸收光譜Fig.2 UV absorption spectra of MPs treated with 1.0 mmol/L H2O2 and various concentrations of 3-methyl butanal (A), pentanal (B),hexanal (C) or heptanal (D)

2.3 熒光光譜分析

熒光光譜法被廣泛應用于研究蛋白與小分子的相互作用，可以反映蛋白質的三級結構變化情況[27-28]。如圖3所示，MPs的發(fā)射熒光強度在波長340 nm附近達到最大值，且隨著4 種醛類質量濃度的增加，MPs的發(fā)射熒光強度呈現(xiàn)降低的趨勢。經過預實驗得知，4 種醛類均無熒光強度，這一結果表明4 種醛類猝滅了MPs的熒光，MPs與4 種醛類之間發(fā)生了相互作用[29]。這與周非白[13]的結論相同，隨著3-甲硫基丙醛添加量的增大，MPs的熒光強度逐漸減弱。

圖3 經1.0 mmol/L H2O2氧化處理的MPs與不同質量濃度的3-甲基丁醛（A）、戊醛（B）、己醛（C）和庚醛（D）相互作用的熒光光譜Fig.3 Fluorescence spectra of MPs treated with 1.0 mmol/L H2O2 and various concentrations of 3-methyl butanal (A), pentanal (B),hexanal (C) or heptanal (D)

2.4 熒光猝滅分析

熒光猝滅包括靜態(tài)猝滅和動態(tài)猝滅，或2 種猝滅組合。靜態(tài)猝滅是指猝滅劑與蛋白熒光團形成無熒光基態(tài)的復合物，而動態(tài)猝滅則源于激發(fā)態(tài)猝滅劑與蛋白熒光團之間的碰撞[30]。由2.3節(jié)熒光光譜分析可知，4 種醛類猝滅了MPs的固有熒光，因此利用Stern-Volmer方程進一步探索猝滅的機制。如圖4所示，4 條曲線都呈現(xiàn)良好的線性關系，3-甲基丁醛、戊醛、己醛和庚醛的擬合優(yōu)度分別為0.993 2、0.970 7、0.981 7和0.985 1。如表1所示，Stern-Volmer方程的斜率為猝滅常數(shù)Ksv，經計算3-甲基丁醛、戊醛、己醛和庚醛的Ksv分別為1.15×103、1.37×103、1.64×103L/mol和2.75×103L/mol。通過Ksv進一步計算可得到猝滅速率常數(shù)Kq，3-甲基丁醛、戊醛、己醛和庚醛分別為1.15×1011、1.37×1011、1.64×1011L/（mol?s）和2.75×1011L/（mol?s），均遠大于生物大分子的最大動態(tài)擴散猝滅常數(shù)2×1010L/（mol?s），表明這4 種醛類引發(fā)的MPs熒光猝滅是靜態(tài)猝滅[17,31]。結合2.2節(jié)紫外光譜結果可知，4 種醛類與MPs發(fā)生了動態(tài)猝滅，加之熒光猝滅分析，說明4 種醛類與MPs的相互作用是靜態(tài)猝滅和動態(tài)猝滅相結合的作用機制。

表1 經1.0 mmol/L H2O2氧化處理的MPs與4 種醛類化合物的Stern-Volmer方程中猝滅常數(shù)Ksv和猝滅速率常數(shù)KqTable 1 Quenching constant (Ksv) and quenching rate constant (Kq) in Stern-Volmer plots for MPs treated with 1.0 mmol/L H2O2 by four aldehydes

圖4 經1.0 mmol/L H2O2氧化處理的MPs與4 種醛類化合物發(fā)生猝滅的Stern-Volmer方程Fig.4 Stern-Volmer plots for quenching of MPs treated with 1.0 mmol/L H2O2 by various concentrations of four aldehydes

2.5 熱力學分析

4 種醛類與MPs的相互作用機制相同，且庚醛與MPs的結合能力最強，因此后續(xù)以庚醛為代表，對其與MPs相互作用機制進行進一步探究。在發(fā)生靜態(tài)猝滅的情況下，當小分子獨立地與蛋白質上一組等效位點結合時，其結合常數(shù)（Ka）和結合位點數(shù)（n）可通過Stern-Volmer改進方程獲得[32]，本實驗改進方程如圖5所示。由表2可知，在3 個溫度條件下的n值約為1，Ka保持在104L/mol的量級范圍內，這說明MPs與庚醛的親和力適中[33-34]。

表2 經1.0 mmol/L H2O2氧化處理的MPs與庚醛猝滅的改進Stern-Volmer方程中結合常數(shù)Ka和結合位點數(shù)nTable 2 Binding constant (Ka) and binding site number (n) in modified Stern-Volmer plots for MPs treated with 1.0 mmol/L H2O2 by heptanal

圖5 經1.0 mmol/L H2O2氧化處理的MPs在不同溫度下與庚醛發(fā)生猝滅的Stern-Volmer改進方程Fig.5 Modified Stern-Volmer plots for quenching of MPs treated with 1.0 mmol/L H2O2 by heptanal at different temperatures

小分子配體通過4 種結合模式與生物大分子結合，分別是范德華力、疏水相互作用、氫鍵和靜電相互作用，這4 種結合模式可通過熱力學分析中的焓變ΔH和熵變ΔS值進行區(qū)分[35]：1）當ΔH＞0和ΔS＞0時為疏水相互作用；2）當ΔH＜0和ΔS＜0時為范德華力和氫鍵；3）當ΔH＜0和ΔS＞0時為靜電相互作用[30]。對于較小的溫度變化，ΔH可被視為常數(shù)，并可根據(jù)lnK與1/T的曲線斜率計算。由表3可知，ΔG＜0表明MPs和庚醛之間的相互作用是自發(fā)的。此外，ΔH＞0和ΔS＞0還表明MPs與庚醛之間的相互作用靠疏水相互作用驅動。

表3 經1.0 mmol/L H2O2氧化處理的MPs與庚醛相互作用的相關熱力學參數(shù)Table 3 Thermodynamic parameters for interaction of MPs treated with 1.0 mmol/L H2O2 and heptanal

2.6 同步熒光光譜分析

蛋白質固有熒光的變化可以反映熒光團周圍微環(huán)境的變化，而Tyr和Trp殘基對其所處微環(huán)境極為敏感，Δλ＝15 nm和Δλ＝60 nm分別代表Tyr和Trp殘基的光譜特征[36-37]。在同步熒光光譜中，峰的紅移表示熒光團所處的微環(huán)境極性增強，疏水性減弱；藍移表示微環(huán)境疏水性增強，極性減弱[38]。由圖6可知，隨著庚醛質量濃度的增加，Tyr和Trp殘基的最大吸收峰均發(fā)生紅移，表明MPs的Tyr和Trp殘基暴露在更親水的環(huán)境中。也就是說，Tyr和Trp殘基周圍的微環(huán)境極性增加，疏水性減弱。MPs中與庚醛結合的位置可能在Tyr和Trp殘基附近。基于以上分析，推測庚醛與MPs的結合會影響MPs的構象。

圖6 經1.0 mmol/L H2O2氧化處理的MPs與不同質量濃度庚醛作用后的同步熒光光譜Fig.6 Synchronous fluorescence spectra for interaction of MPs treated with 1.0 mmol/L H2O2 and various concentrations of heptanal

2.7 圓二色譜分析

采用圓二色譜進一步分析4 種醛類對MPs構象的影響，經1.0 mmol/L H2O2氧化處理的MPs與4 種醛類作用后的圓二色譜如圖7所示。MPs的圓二光譜在208 nm和222 nm處有2 個負峰，這是α-螺旋結構中肽鍵的n-π*躍遷所致[39-40]。

圖7 經1.0 mmol/L H2O2氧化處理的MPs與不同質量濃度3-甲基丁醛（A）、戊醛（B）、己醛（C）和庚醛（D）作用后的圓二色譜Fig.7 CD spectra of MPs treated with 1.0 mmol/L H2O2 before and after interaction with various concentrations of 3-methyl butanal (A),pentanal (B), hexanal (C) or heptanal (D)

添加4 種醛類后MPs的圓二色譜呈現(xiàn)相同的變化趨勢，以庚醛為例計算MPs中二級結構的變化情況。如表4所示，隨著庚醛質量濃度的增加，α-螺旋相對含量從19.24%下降至16.88%（P＜0.05），β-折疊相對含量從24.59%增加至26.47%（P＜0.05），這說明MPs的結構由有序狀態(tài)向無序狀態(tài)轉變[17,27]。α-螺旋相對含量的減少說明庚醛能與MPs中的氨基酸殘基相互作用，破壞氫鍵（包括分子內氫鍵）；此外，α-螺旋相對含量的減少可能使MPs內部的疏水性基團暴露[41-42]，這一結果與同步熒光光譜結果（紅移）相一致?？傮w而言，MPs與庚醛的相互作用改變了MPs的二級結構。

表4 經1.0 mmol/L H2O2氧化處理的MPs與不同質量濃度庚醛作用后二級結構的變化Table 4 Secondary structural changes of MPs treated with 1.0 mmol/L H2O2 before and after interaction with various concentrations of heptanal

3 結 論

本研究建立了羥自由基氧化體系，探究不同氧化程度的MPs與3-甲基丁醛、戊醛、己醛和庚醛的相互作用。結果表明，庚醛與MPs的結合能力最強，且H2O2濃度為1.0 mmol/L時MPs與4 種醛類結合能力最強，說明適度氧化可以促進MPs與醛類化合物的相互作用，熱力學分析進一步揭示了疏水相互作用是維持兩者結合的主要驅動力。紫外光譜及熒光光譜分析表明，醛類通過靜態(tài)和動態(tài)猝滅相結合的機制猝滅MPs的熒光；同步熒光光譜特征峰的紅移和α-螺旋相對含量的降低進一步證實了MPs中的氨基酸殘基與醛類發(fā)生了相互作用。本研究從分子水平揭示了MPs與醛的相互作用機制，為肉制品的風味調控提供了理論基礎及技術支持。