劉欣欣，王 瑤，史紅玲，姚倫廣，王 賢，唐存多,,3,*

（1.南陽(yáng)師范學(xué)院生命科學(xué)與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，河南 南陽(yáng) 473061；2.賒店老酒股份有限公司博士后創(chuàng)新實(shí)踐基地，河南 南陽(yáng) 473300；3.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，河南 鄭州 450002）

2,5-二甲基吡嗪（2,5-dimethylpyrazine, 2,5-DMP）是一種雜環(huán)含氮化合物，廣泛存在于各種食品中，是食品中重要的香氣化合物[1]。由于2,5-DMP具有增香作用，它作為食品工業(yè)中的食品添加劑受到了廣泛關(guān)注。天然的2,5-DMP常存在于熱處理后原料種子[2]、烤牛肉[3]、白醋[4]、酒[5-6]、醬油[7]、咖啡豆[8-9]、烤花生[10-11]、烏龍茶[12]以及發(fā)酵大豆[13]中，具有炒花生香氣和巧克力、奶油風(fēng)味，是食品工業(yè)中不可缺少的調(diào)味添加劑。同時(shí)，2,5-DMP還被應(yīng)用于制藥工業(yè)，是生產(chǎn)降糖類藥物和抗脂類藥物的重要底物，如5-甲基吡嗪-2-羧酸是合成抗脂分解藥物中間體的合成原料[14]，常用于合成抗高血壓類藥物阿莫西林、降血糖血脂類藥物格列吡嗪以及抗結(jié)核藥物5-甲基吡嗪-2-羧酸甲酯等[15-16]。

L-蘇氨酸是一種必需氨基酸，可用于食品增香劑、醫(yī)藥、飼料添加等方面[17]。目前，安全綠色且廣泛使用的生產(chǎn)方法是微生物發(fā)酵法[18]。近年來(lái)，L-蘇氨酸的生產(chǎn)過(guò)熱，導(dǎo)致出現(xiàn)了產(chǎn)能嚴(yán)重過(guò)剩的窘境[19]。因此，L-蘇氨酸的轉(zhuǎn)產(chǎn)增值迫在眉睫，其途徑主要有以下幾種：一是以L-蘇氨酸為底物，經(jīng)過(guò)多酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)進(jìn)行脫氨和還原生成L-氨基丁酸，同時(shí)還原反應(yīng)所消耗的NADH通過(guò)甲酸脫氫酶再生[20]。二是以L-蘇氨酸為底物，利用L-蘇氨酸脫氫酶（L-threonine dehydrogenase，L-TDH）使L-蘇氨酸脫氫生成L-2-氨基乙酰乙酸，經(jīng)過(guò)一系列自發(fā)反應(yīng)生成2,5-DMP。三是L-蘇氨酸在蘇氨酸醛縮酶的作用下直接生成甘氨酸。本研究擬挖掘鑒定出高活性的L-TDH，試圖以L-蘇氨酸為底物采用全細(xì)胞催化法生產(chǎn)2,5-DMP，實(shí)現(xiàn)L-蘇氨酸的轉(zhuǎn)產(chǎn)增值，力爭(zhēng)解決蘇氨酸產(chǎn)能過(guò)剩問(wèn)題[12,14]。在大腸桿菌（Escherichia coli）中，2,5-DMP可以由L-蘇氨酸天然合成，全細(xì)胞催化途徑中的催化過(guò)程為L(zhǎng)-蘇氨酸在L-TDH的作用下轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-2-氨基乙酰乙酸[21]，L-TDH是催化過(guò)程中的關(guān)鍵酶[22]。

已有文獻(xiàn)報(bào)道，來(lái)源于E.coli的L-TDH借助pET28a載體在E.coli中實(shí)現(xiàn)了可溶性表達(dá)，其比活力約為132 mU/mg。曹艷麗等[19]經(jīng)枯草芽孢桿菌外源表達(dá)了來(lái)源不同的L-TDH，結(jié)果表明，來(lái)源于E.coliK-12的L-TDH在枯草芽孢桿菌中更有利于L-蘇氨酸合成2,5-DMP，但其L-TDH活力僅為0.024 IU，比活力為0.15 IU/mg。本研究擬以E.coli為出發(fā)菌株，從中調(diào)取L-TDH基因，再借助pACYCDuet-1質(zhì)粒強(qiáng)化其在E.coliBL21（DE3）的表達(dá)，并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行分析，旨在為提高蘇氨酸轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-2-氨基乙酰乙酸效率提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試劑

限制性內(nèi)切酶BamH I和Hind III New England Biolabs（北京）公司；L-蘇氨酸 美國(guó)Sigma-Aldrich公司；2,5-DMP、2,4-二硝基氟苯 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；NAD＋日本Chem-Station公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-beta-D-thiogalactoside，IPTG）Master of Bioactive Molecules（北京）公司；Prime STAR HS (Premix)、DL 2000 DNA Marker、rTaqDNA聚合酶、PrimeScript? II 1st Strand cDNA Synthesis Kit、DNA連接試劑盒Ver.2.1 寶生物工程（大連）有限公司；甲醇、甲酸（均為色譜純） 天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.2 菌株與質(zhì)粒

本研究所涉及到的菌株和質(zhì)粒如表1所示，重組質(zhì)粒的構(gòu)建如圖1所示。

圖1 重組質(zhì)粒pACYCDuet-1-Ectdh的構(gòu)建Fig.1 Construction of the recombinant plasmid pACYCDuet-1-Ectdh

表1 本研究用到的菌株和質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

1.2 儀器與設(shè)備

核酸電泳儀、Hypersil C18柱 美國(guó)Thermo Fisher公司；UNIVERSAL Hood凝膠成像系統(tǒng)、PowerPacTMHC/Mini-PROTEAN?蛋白電泳系統(tǒng) 美國(guó)Bio-Rad公司；VCX 130型超聲破碎儀 美國(guó)Sonics and Materials公司；UV1000紫外-可見分光光度計(jì) 梅特勒-托利多科技（中國(guó)）有限公司；EC 2006型高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）系統(tǒng) 大連依利特分析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 重組菌株的構(gòu)建及序列分析

從EMBL’s European Bioinformatics Institute（https://www.ebi.ac.uk/）數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索到一個(gè)E.coli來(lái)源的L-TDHEcTDH（ACI75701.1）。根據(jù)此序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增E c t d h的特異性引物E c t d h-F：CGCGGATCCGATGAAAGCGTTATCCAAACTG（ 含B a mH I 酶 切 位 點(diǎn)） 和E c t d h- R ：CCCAAGCTTTTAATCCCAGCTCAGAATAAC（含Hind III酶切位點(diǎn)），委托蘇州泓訊生物技術(shù)有限公司進(jìn)行合成。以E.coliBL21（DE3）基因組DNA為模板，利用Ectdh-F和Ectdh-R引物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增Ectdh的編碼基因，再利用限制性核酸內(nèi)切酶BamH I和Hind III對(duì)目的基因及載體pACYCDuet-1分別進(jìn)行雙酶切，然后連接轉(zhuǎn)化進(jìn)入E.coliBL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)氯霉素抗性篩選和測(cè)序鑒定獲得E.coliBL21（DE3）/ pACYCDuet-1-Ectdh重組菌。將上述重組菌連續(xù)在無(wú)抗LB培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，然后接種至含氯霉素抗性的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)，觀察生長(zhǎng)情況，通過(guò)氯霉素抗性篩選考察重組菌攜帶質(zhì)粒的遺傳穩(wěn)定性[23]。基于測(cè)序結(jié)果，通過(guò)Jalview對(duì)該酶進(jìn)行多序列比對(duì)。

1.3.2 重組E.coli誘導(dǎo)

重組E.coli的誘導(dǎo)表達(dá)采用低溫、低濃度誘導(dǎo)劑的方法。分別將E.coliBL21（DE3）/pACYCDuet-1、E.coliBL21（DE3）/pACYCDuet-1-Ectdh單菌落接種至5 mL含100 μg/mL氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)14 h，以2%接種量將過(guò)夜培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)接至100 mL新鮮LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)約2 h至菌體細(xì)胞密度（OD600nm）為1.0，加入1 mol/L IPTG至終濃度為0.1 mmol/L，16 ℃、200 r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)20 h。將100 mL菌液于8 000 r/min、4 ℃離心5～10 min，收集菌體，將菌體用20 mmol/L Tris-HCl重懸后進(jìn)行超聲破碎，破碎后收集上清液，上清液通過(guò)鎳瓊脂糖柱上進(jìn)行純化，利用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）進(jìn)行分析[24]。

1.3.3 酶活力測(cè)定

誘導(dǎo)表達(dá)后的重組菌進(jìn)行超聲破碎，離心取純化后的上清液，參照文獻(xiàn)[19]并進(jìn)行略微改動(dòng)測(cè)定重組酶活力。以L-蘇氨酸為底物測(cè)定EcTDH活力，總的1 mL反應(yīng)體系包含0.76 mL Tris-HCl（76 mmol/L，pH 7.8）、0.08 mLL-蘇氨酸（8 mmol/L）、0.06 mL NAD＋溶液（3 mmol/L）混勻，放入35 ℃金屬浴中預(yù)熱5 min，加入0.1 mL酶液，測(cè)定1 min內(nèi)OD340nm的變化值。酶活力定義為1 min內(nèi)生成1 μmol NADH所需的酶量為1 IU[25]。

1.3.4 重組酶的溫度特性

參照1.3.3節(jié)方法，分別在20～60 ℃（以5 ℃為間隔）下測(cè)定重組酶活力以獲得重組酶的最適反應(yīng)溫度。將重組酶分別在35～55 ℃保溫0～120 min（以10 min為間隔），在最適反應(yīng)溫度下測(cè)定各自的殘留酶活力，以冰浴保存各時(shí)間段的殘留酶活力為100%，考察重組酶的溫度穩(wěn)定性。

1.3.5 重組酶的pH值特性

參照1.3.3節(jié)方法，控制在最適反應(yīng)溫度下，分別在pH 6.5～10.5（以0.5為間隔）下測(cè)定重組酶活力以獲得重組酶的最適反應(yīng)pH值。將重組酶分別在pH 6.5～10.5（以0.5為間隔）的緩沖液中放置在最適反應(yīng)溫度下保溫1.5 h，測(cè)定各自的殘留酶活力，以未經(jīng)處理的酶液為100%，考察重組酶的pH值穩(wěn)定性。

1.3.6 重組酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)

根據(jù)已報(bào)道的方法稍加修改，測(cè)定重組TDH的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，確定TDH底物的特異性[26-27]，反應(yīng)系統(tǒng)中NAD＋濃度為0.5 mmol/L。最佳反應(yīng)條件下，在4～14 mmol/L不同L-蘇氨酸濃度下測(cè)定重組酶的催化活性。每次測(cè)定重復(fù)3 次。同樣地，固定L-蘇氨酸濃度為10 mmol/L，將NAD＋濃度設(shè)置為0.5～1.75 mmol/L，測(cè)定重組酶的催化活性，每次測(cè)定3 次，考察對(duì)NAD＋的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。所有計(jì)算均由Origin 9.0執(zhí)行，利用Origin 9.0軟件進(jìn)行非線性擬合，得出重組酶對(duì)底物的Km、Kcat和Vmax。

1.3.7 重組E.coli全細(xì)胞轉(zhuǎn)化L-蘇氨酸合成2,5-DMP

在250 mL三角瓶中構(gòu)建50 mL的反應(yīng)體系，體系包括：50 mL Tris-HCl-NaCl緩沖液、85 mmol/LL-蘇氨酸、0.75 mmol/L NAD＋、50 mg凍干的重組E.coli和適量玻璃珠，并于30 ℃、220 r/min振蕩反應(yīng)，在0～36 h內(nèi)每12 h取1 mL轉(zhuǎn)化液于60 ℃金屬浴鍋中加熱10 min終止反應(yīng)，于12 000 r/min離心1 min，取上清液用0.22 μm濾膜進(jìn)行過(guò)濾，最后用HPLC法檢測(cè)2,5-DMP含量，并繪制反應(yīng)進(jìn)程曲線。

1.3.8 底物和產(chǎn)物的檢測(cè)

對(duì)底物L(fēng)-蘇氨酸、產(chǎn)物2,5-DMP進(jìn)行普通C18柱的HPLC分析，HPLC色譜柱為Thermo Hypersil C18柱，檢測(cè)波長(zhǎng)為275 nm，柱溫25 ℃，流動(dòng)相A（體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸）與流動(dòng)相B（甲醇），按照表2進(jìn)行梯度洗脫，流速為0.2 mL/min，運(yùn)行時(shí)間10 min。底物L(fēng)-蘇氨酸HPLC檢測(cè)方法通過(guò)柱前衍生測(cè)定[28-29]。

表2 HPLC梯度洗脫Table 2 HPLC gradient elution program

1.3.9 產(chǎn)物2,5-DMP的定量分析

將2,5-DMP標(biāo)準(zhǔn)品用超純水分別配成1.82、2.27、3.03、4.55、9.10 mmol/L的溶液，經(jīng)0.22 μm微孔濾器過(guò)濾后，取10 μL進(jìn)行HPLC分析，獲得各個(gè)濃度2,5-DMP的峰面積，進(jìn)行線性擬合獲得回歸方程及相關(guān)系數(shù)。HPLC色譜柱為Thermo Hypersil C18柱，檢測(cè)波長(zhǎng)275 nm，柱溫25 ℃，流動(dòng)相為體積分?jǐn)?shù)0.1%的甲酸和色譜級(jí)甲醇，流速0.2 mL/min，進(jìn)行梯度洗脫。待檢樣品產(chǎn)物按照同樣的色譜條件進(jìn)行HPLC分析，根據(jù)測(cè)得的峰面積可以由回歸方程計(jì)算出相應(yīng)的樣品濃度。

1.3.10 常用網(wǎng)站及軟件

EMBL’s European Bioinformatics Institute（https://www.ebi.ac.uk/）數(shù)據(jù)庫(kù)和Basic Local Alignment Search Tool（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）：蛋白質(zhì)、基因序列的搜索；DNAMAN軟件：用于目的基因序列及限制性酶切位點(diǎn)分析和測(cè)序結(jié)果拼接；Origin 9.0軟件：用于數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析；Jalview軟件：用于酶的多序列比對(duì)；NCBI Autodock：用于分子對(duì)接。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

圖片均用PDF-Xchange Viewer軟件進(jìn)行清晰度調(diào)節(jié)，用Adobe Photoshop CS 8.0軟件進(jìn)行色階、對(duì)比度調(diào)節(jié)及標(biāo)注等處理。簡(jiǎn)單的數(shù)據(jù)處理及分析均借助Origin 9.0進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組E. coli的構(gòu)建

以E.coli的全基因組DNA為模板，Ectdh-F和Ectdh-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，如圖2A所示，在約1 100 bp出現(xiàn)了明顯的特異性條帶，PCR產(chǎn)物片段與預(yù)期理論長(zhǎng)度基本一致，與已報(bào)道的來(lái)源于E.coliK-12的TDH序列相似度約為77%[19]。將PCR產(chǎn)物用PCR產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行純化，用限制性核酸內(nèi)切酶BamH I和Hind III進(jìn)行雙酶切，將酶切產(chǎn)物連接至經(jīng)相同的限制性酶進(jìn)行同樣雙酶切的pACYCDuet-1載體，轉(zhuǎn)化至E.coliBL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，再經(jīng)氯霉素抗性篩選和雙酶切驗(yàn)證，挑取重組子，用通用引物ACYCDuetUP1 Primer和DuetDOWN1 Primer進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果如圖2B所示，片段長(zhǎng)度約1 100 bp，大小與其預(yù)期條帶大小相符。將經(jīng)PCR檢測(cè)和雙酶切驗(yàn)證的重組子送至蘇州泓迅生物科技股份有限公司進(jìn)行測(cè)序鑒定，獲得Ectdh基因序列，并推測(cè)出其氨基酸序列。結(jié)果表明，EcTDH的序列及在載體上的插入位置與預(yù)期的結(jié)果相符，表明重組菌E.coliBL21（DE3）/pACYCDuet-1-Ectdh已成功構(gòu)建。

圖2 Ectdh重組子的PCR擴(kuò)增（A）及pACYCDuet-1-Ectdh的通用引物驗(yàn)證（B）Fig.2 Agarose gel electropherograms of PCR amplified Ecctdh (A) and universal primer validation for pACYCDuet-1-Ectdh (B)

2.2 EcTDH的序列分析

將上述推測(cè)出的EcTDH氨基酸序列在ProtParam（https://web.expasy.org/protparam/）上進(jìn)行理論理化性質(zhì)的預(yù)測(cè)，結(jié)果表明，EcTDH的理論等電點(diǎn)為5.81，理論分子質(zhì)量為37 173.94 Da，不穩(wěn)定指數(shù)II為24.46，是一個(gè)較穩(wěn)定的蛋白，其在E.coli和酵母體內(nèi)的半衰期分別能達(dá)到10 h和20 h以上。利用TMHMM-2.0服務(wù)器預(yù)測(cè)蛋白跨膜結(jié)構(gòu)的結(jié)果顯示，EcTDH的所有氨基酸殘基均為膜外殘基，表明EcTDH理論上相當(dāng)容易實(shí)現(xiàn)胞外分泌型表達(dá)。將EcTDH的氨基酸序列和已經(jīng)報(bào)道來(lái)源不同的TDH氨基酸序列進(jìn)行分析（激烈熱球菌（Pyrococcus furiosus）、堀越熱球菌（Pyrococcus horikoshii）、柯達(dá)熱球菌（Thermococcus kodakaraensis）），用Jalview軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，結(jié)果如圖3所示，已報(bào)道的文獻(xiàn)表明來(lái)自P.horikoshii的L-TDH氨基酸殘基半胱氨酸Cys97、Cys100、Cys103、Cys111位在L-TDH中是保守的[30-31]，其對(duì)應(yīng)來(lái)自E.coli的L-TDH Cys93、Cys96、Cys99、Cys107。建立L-TDH的三維結(jié)構(gòu)模型如圖4所示，L-TDH對(duì)于底物L(fēng)-蘇氨酸的催化中心是在107位的半胱氨酸。

圖3 EcTDH與其他3 個(gè)代表性TDH的多序列比對(duì)Fig.3 Multisequence alignment of EcTDH with three other representative TDHs

圖4 EcTDH三維結(jié)構(gòu)圖Fig.4 Three-dimensional structure analysis of EcTDH

2.3 重組E. coli的誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定

分別將E.coliBL21（DE3）/pACYCDuet-1、E.coliBL21（DE3）/pACYCDuet-1-Ectdh菌株按照1.3.2節(jié)方法進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，將經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體進(jìn)行離心，收集菌體重懸后進(jìn)行超聲破碎，8 000 r/min、4 ℃離心15 min后收集裂解上清液。將收集裂解的上清液進(jìn)行SDS-PAGE及酶活力分析。如圖5所示，E.coliBL21（DE3）/pACYCDuet-1-Ectdh裂解上清液經(jīng)純化后在約37 kDa處有明顯的特異性條帶，與EcTDH的理論分子質(zhì)量37 173.94 Da基本一致，表明已成功實(shí)現(xiàn)了EcTDH在E.coli的可溶性表達(dá)。

圖5 重組E. coli表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Fig.5 SDS-PAGE analysis of recombinant Escherichia coli expression products

各重組子酶活力測(cè)定結(jié)果顯示，E.coliBL21（DE3）/pACYCDuet-1的酶活力為0.24 IU/mL，而E.coliBL21（DE3）/pACYCDuet-1-Ectdh的細(xì)胞裂解液中檢測(cè)到EcTDH活力可達(dá)到19.13 IU/mL，與本底細(xì)胞相比，其酶活力是E.coli本底細(xì)胞表達(dá)的79 倍，純化后的比活力可達(dá)12.77 IU/mg，表明EcTDH表現(xiàn)出較高的酶活力。比較已有文獻(xiàn)報(bào)道的不同來(lái)源的L-TDH活力結(jié)果如表3所示。可以看出，來(lái)源于E.coli的L-TDH經(jīng)載體pACYCDuet-1和pET28a表達(dá)后比活力產(chǎn)生較大差別，主要是由于酶活力定義不同，以及酶活力測(cè)定時(shí)底物和輔酶終濃度的差異導(dǎo)致，它們會(huì)對(duì)表觀酶活造成較大的影響。文獻(xiàn)報(bào)道[32]測(cè)定酶活力體系中底物L(fēng)-蘇氨酸和輔酶NAD＋終濃度分別為100 mmol/L和200 mmol/L，而在本研究中終濃度分別為8 mmol/L和3 mmol/L。他們將每分鐘消耗1mol NAD＋所需的酶量定義為1 U，而本研究將每分鐘產(chǎn)生1 μmol NADH所需的酶量定義為1 IU。

表3 不同來(lái)源L-TDH活力與比活力的對(duì)比Table 3 Specific activity of L-TDH from different sources

2.4 重組L-TDH的溫度特性

由圖6可知，在溫度為20～45 ℃范圍內(nèi)，酶促反應(yīng)速率隨溫度的升高而不斷提高，超過(guò)45 ℃后，反應(yīng)速率逐漸下降，表明EcTDH的最適反應(yīng)溫度為45 ℃，在40～45 ℃之間時(shí)具有較高酶活力。這與之前文獻(xiàn)報(bào)道的最適溫度一致[22]。

圖6 重組L-TDH的最適反應(yīng)溫度Fig.6 Optimal reaction temperature for recombinant L-TDH

如圖7所示，在35 ℃和40 ℃保溫120 min后的殘留酶活力仍然高于90%，這表明它在35～40 ℃范圍內(nèi)有較好的穩(wěn)定性。與之前文獻(xiàn)報(bào)道的在35～40 ℃條件下測(cè)定的殘留酶活力相比，本研究殘留酶活提高了12.5%；在45、50、55 ℃殘留酶活力達(dá)到50%所對(duì)應(yīng)的時(shí)間分別為78、40 min和20 min。

圖7 重組L-TDH溫度穩(wěn)定性Fig.7 Temperature stability of recombinant L-TDH

2.5 重組L-TDH的pH值特性

緩沖液過(guò)酸過(guò)堿都會(huì)導(dǎo)致酶的空間結(jié)構(gòu)的改變，從而使酶的活性降低，由圖8可知，重組酶的最適反應(yīng)pH值在8.5～9.5之間，相對(duì)酶活力可達(dá)80%以上，EcTDH最適反應(yīng)pH值為9.0。

圖8 重組L-TDH的最適pH值Fig.8 Optimal reaction pH for recombinant L-TDH

如圖9所示，重組L-TDH在pH 7.5～8.5的緩沖液中保持1.5 h后殘留酶活力均能保持90%以上，表明它在pH 7.5～8.5范圍內(nèi)有較好的穩(wěn)定性，其pH值適應(yīng)性相對(duì)較廣，在pH 8.5～10.0范圍內(nèi)殘留酶活力在65%以上，而已報(bào)道的L-TDH在pH值為10時(shí)，其殘留酶活力僅達(dá)到60%，表明在pH值穩(wěn)定性方面，該研究中L-TDH穩(wěn)定性更好。

圖9 重組L-TDH的pH值穩(wěn)定性Fig.9 pH stability of recombinant L-TDH

2.6 重組TDH的動(dòng)力學(xué)參數(shù)

表4結(jié)果顯示，EcTDH對(duì)L-蘇氨酸的Kcat為1.13 s-1，Km為7.76 mmol/L，Vmax為1.827 μmol/（min·mg），Kcat/Km值為0.15 L/（mmol·s）。EcTDH對(duì)輔酶NAD＋的Kcat為1.52 s-1，Km為1.61 mmol/L，Vmax為2.46 μmol/（min·mg），Kcat/Km值為0.94 L/（mmol·s）。對(duì)比文獻(xiàn)來(lái)源于Cupriavidus necator的野生型L-TDH和各位點(diǎn)突變型L-TDH的Km和Kcat值（表4），L-TDH因其空間結(jié)構(gòu)的不同，進(jìn)而影響反應(yīng)過(guò)程中活性位點(diǎn)殘基的運(yùn)動(dòng)使得動(dòng)力學(xué)參數(shù)產(chǎn)生差異。

表4 不同L-TDH動(dòng)力學(xué)參數(shù)的比較Table 4 Comparison of kinetic parameters of L-TDH from different sources

2.7 2,5-DMP及底物標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC分析

按照1.3.9節(jié)方法，將分析純的2,5-DMP在Thermo Hypersil C18柱上進(jìn)行HPLC分析，在該分析條件下，2,5-DMP的保留時(shí)間約為6.55 min，將2,5-DMP不同濃度對(duì)相應(yīng)的峰面積進(jìn)行線性擬合，獲得2,5-DMP的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出2,5-DMP濃度對(duì)應(yīng)的回歸方程為y=2 062.4x＋354.29（x為2,5-二甲基吡嗪濃度（mmol/L）；y為峰面積，相關(guān)系數(shù)為0.997 8），結(jié)果表明在該HPLC分析條件及濃度范圍下，2,5-DMP濃度與峰面積呈良好線性相關(guān)。因此，利用此法可以對(duì)2,5-DMP進(jìn)行精確定量分析。同樣條件下對(duì)底物L(fēng)-蘇氨酸進(jìn)行HPLC分析，底物的保留時(shí)間約為3.06 min。在相同的分析條件下，L-蘇氨酸的保留時(shí)間與2,5-DMP保留時(shí)間差約3.5 min，結(jié)果表明在該色譜條件下能夠?qū)崿F(xiàn)L-蘇氨酸與2,5-DMP的良好分離，該色譜方法能夠用于催化產(chǎn)物的分析鑒定。

2.8 重組E. coli全細(xì)胞催化L-蘇氨酸合成2,5-DMP

按照1.3.7節(jié)方法對(duì)L-蘇氨酸進(jìn)行全細(xì)胞催化的生物轉(zhuǎn)化。E.coliBL21（DE3）/pACYCDuet-1和E.coliBL21（DE3）/pACYCDuet-1-Ectdh的催化產(chǎn)物經(jīng)過(guò)離心取樣后按照1.3.8節(jié)方法進(jìn)行HPLC分析，保留時(shí)間約為6.55 min和3.06 min處有明顯的特征峰，它們與相同分析條件下2,5-DMP和L-蘇氨酸標(biāo)品的保留時(shí)間一致，表明在該催化條件下，部分L-蘇氨酸已被轉(zhuǎn)化成2,5-DMP。在不同時(shí)間取樣分析、計(jì)算各時(shí)間節(jié)點(diǎn)的產(chǎn)物得率，它們的催化反應(yīng)進(jìn)程曲線如圖10所示。反應(yīng)進(jìn)行到36 h，反應(yīng)基本達(dá)到平衡狀態(tài)，2,5-DMP得率基本不再隨時(shí)間的變化而變化，E.coliBL21（DE3）/pACYCDuet-1-Ectdh的產(chǎn)物得率約為12%，顯著高于E.coliBL21（DE3）/pACYCDuet-1的轉(zhuǎn)化水平。結(jié)果表明，強(qiáng)化L-TDH的表達(dá)可顯著提高2,5-DMP合成效率，但僅依靠強(qiáng)化TDH的表達(dá)難以實(shí)現(xiàn)L-蘇氨酸的高效轉(zhuǎn)化。

圖10 L-TDH對(duì)催化反應(yīng)進(jìn)程的影響Fig.10 Effect of L-TDH on the catalytic reaction process

3 討 論

L-TDH是以L-蘇氨酸為底物合成高值化合物2,5-DMP的關(guān)鍵酶，本研究對(duì)挖掘出來(lái)源于E.coli的L-TDH進(jìn)行了高效表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)分析。本研究從E.coli中克隆出L-TDH的基因片段，再借助pACYCDuet-1表達(dá)質(zhì)粒在E.coliBL21（DE3）中實(shí)現(xiàn)了高水平的可溶性表達(dá)，酶活力測(cè)定結(jié)果表明，E.coliBL21（DE3）/pACYCDuet-1-Ectdh發(fā)酵液中L-TDH活力可達(dá)19.13 IU/mL，純化后重組L-TDH的比活力為12.77 IU/mg。與已報(bào)道文獻(xiàn)相比[19]，本研究表達(dá)水平和比活力均較高，比活力的差異可能歸因于蛋白序列本身的差異，兩者的序列相似度為77%；而表達(dá)水平的差異可能主要?dú)w因于宿主的差別，所用的E.coli表達(dá)系統(tǒng)比枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)具有更大表達(dá)潛力。也利用強(qiáng)化了TDH表達(dá)水平的重組E.coliBL21（DE3）/pACYCDuet-1-Ectdh進(jìn)行了轉(zhuǎn)化L-蘇氨酸合成2,5-DMP的初步研究，它利用強(qiáng)化的TDH以及自身本底表達(dá)的NADH氧化酶、蘇氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和氨基酸氧化酶等能夠協(xié)同催化2,5-DMP的合成，反應(yīng)24 h后產(chǎn)物得率約12%，顯著高于沒有強(qiáng)化TDH表達(dá)的E.coliBL21（DE3）/pACYCDuet-1，這說(shuō)明TDH確實(shí)在轉(zhuǎn)化L-蘇氨酸合成2,5-DMP的過(guò)程中起關(guān)鍵作用。然而，僅強(qiáng)化TDH表達(dá)難以實(shí)現(xiàn)L-蘇氨酸的高效轉(zhuǎn)化，后續(xù)研究需要參考前人的研究[32]，充分利用代謝工程和酶工程的手段，繼續(xù)強(qiáng)化2,5-DMP積累正相關(guān)的基因表達(dá)，敲除2,5-DMP積累負(fù)相關(guān)的基因，以期進(jìn)一步提高2,5-DMP的得率。