紀俊莉,梁笑星,李小萌,楊姿萱,周宇澤,凌一綺,郝艷梅

(蚌埠醫(yī)學(xué)院腫瘤基礎(chǔ)研究與臨床檢驗診斷重點實驗室,蚌埠 233030;*通訊作者,E-mail:1036835322@qq.com)

樹突狀細胞(dendritic cell,DC)來源于骨髓造血干細胞,是免疫系統(tǒng)中最強的抗原提呈細胞[1]。DC激活抗腫瘤免疫應(yīng)答的能力已被應(yīng)用于癌癥免疫治療[2,3]。DC腫瘤疫苗是近年來研究的熱點,DC負載抗原后,在機體內(nèi)激活抗原特異性T細胞反應(yīng),殺傷腫瘤細胞[1,4]。目前,DC疫苗的研究,仍存在著局限性,比如腫瘤微環(huán)境的免疫抑制[5-8]、抗原呈遞不足等[9]。研究DC在機體內(nèi)的免疫功能以及DC疫苗,需要通過體外實驗短時間內(nèi)獲得大量DC。體外培養(yǎng)獲得DC有分選和誘導(dǎo)擴增法,分選獲得的DC純度較高,但成本高,獲得的細胞少,此種方法不便被實驗室采用。誘導(dǎo)擴增法可從脾臟、淋巴結(jié)、外周血和骨髓中分離DC,目前骨髓細胞誘導(dǎo)擴增法是DC培養(yǎng)的經(jīng)典方法,包括Inaba法、Lutz法和Son法,獲得的細胞純度及活性有待改良[10-13]。

本實驗采用Inaba法和Son法結(jié)合,根據(jù)附著在小鼠股骨和脛骨肌肉群分布的位置特點,游離出股骨和脛骨,收集小鼠骨髓細胞。將小鼠骨髓細胞誘導(dǎo)為DC,進行功能鑒定,建立BMDC的體外培養(yǎng)模型,為DC免疫功能的基礎(chǔ)研究和轉(zhuǎn)化應(yīng)用奠定實驗基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

C57BL/6雄性小鼠,SPF級,6～10周齡,購自杭州子源實驗動物科技有限公司,生產(chǎn)許可證號:SCXK(浙)2019-004。BALB/c雌性小鼠,SPF級,5周齡,購自杭州啟真實驗動物科技有限公司,生產(chǎn)許可證號:SCXK(浙)2022-0005。所有實驗動物操作程序均由蚌埠醫(yī)學(xué)院實驗動物管理委員會批準。

1.2 主要試劑及儀器

胎牛血清購自杭州四季青公司,瑞氏-姬姆薩染液購自珠海貝索生物有限公司,Murine GM-CSF和Murine IL-4購自Pepro Tech公司(美國),CD11c、CD80、CD86、CD40、MHC Ⅱ流式抗體均購自Biolegend公司(美國),脂多糖購自Sigma公司(美國),絲裂霉素C購自MedChemExpress公司,CCK-8檢測試劑購自蘭杰柯科技有限公司,引物由華曉基因科技有限公司合成,RNA提取試劑盒購自美基生物科技有限公司,cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR擴增試劑均購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司,BCA蛋白測定試劑盒(增強型)購自上海碧云天有限公司,p-NF-κB抗體和羊抗兔IgG HRP購自Affinity公司。光學(xué)顯微鏡購自日本Olympus公司,流式細胞儀為美國BD公司產(chǎn)品。

1.3 BMDC培養(yǎng)模型的建立

1.3.1 小鼠骨髓細胞的提取 C57BL/6雄性小鼠脫頸處死,游離小鼠雙后肢,浸泡于75%酒精中5 min。轉(zhuǎn)移到超凈工作臺中進行后繼操作,將雙后肢浸泡在冰冷的PBS中2 min,沿著膝關(guān)節(jié)運動方向反向折轉(zhuǎn)股骨與脛骨連接處,肌肉由游離的脛骨膝關(guān)節(jié)端向脛骨遠端剝離,去除附著在脛骨上的肌肉,股骨關(guān)節(jié)軟骨連同附著的肌肉一同從股骨上分離,測定雙后肢離體后獲得潔凈股骨和脛骨的解剖時間。剪去股骨和脛骨的兩端,用注射器吸取基礎(chǔ)培養(yǎng)基沖洗骨髓腔,至骨髓腔變成灰白色,收集細胞懸液。測定小鼠處死到獲得細胞懸液的時間。

1.3.2 BMDC的誘導(dǎo)培養(yǎng) 細胞懸液離心,棄上清,加入含10 ng/ml重組小鼠粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(recombinant murine granulocyte-macrophage colony stimulating factor,rmGM-CSF)和10 ng/ml重組小鼠白細胞介素4(recombinant murine interleukin-4,rmIL-4)的10% FBS的1640完全培養(yǎng)基重懸細胞,調(diào)整有核細胞數(shù)為2×108/L,鋪至24孔板內(nèi),每孔1 ml。37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 d,全換液,棄盡培養(yǎng)基,去除懸浮的粒細胞和淋巴細胞,加入含相同濃度細胞因子的完全培養(yǎng)基,培養(yǎng)箱培養(yǎng)至第4天,半量換液,培養(yǎng)至第7天,收集懸浮及疏松貼壁的BMDC,棄去貼壁的細胞。

1.3.3 光學(xué)顯微鏡下觀察細胞形態(tài) 倒置光學(xué)顯微鏡下觀察誘導(dǎo)2,4,7 d的細胞增殖狀況和BMDC的形態(tài)變化。收獲第7天的細胞,鋪入細胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)過夜,PBS清洗兩次,4%多聚甲醛固定30 min,PBS清洗兩次,自然風(fēng)干。滴加A液,染色1 min;再將B液滴加到A液中,充分混合,染色2～3 min,流水沖洗,待干,顯微鏡下觀察誘導(dǎo)培養(yǎng)第7天的BMDC瑞氏-姬姆薩染色的形態(tài)特征。

1.3.4 流式細胞術(shù)檢測BMDC的純度 收集培養(yǎng)7 d的細胞,用PBS緩沖溶液清洗兩次,盡棄上清。加入100 μl含有0.5 μl APC-CD11c流式抗體的PBS緩沖液,冰上避光孵育15～30 min,PBS洗兩次。4%多聚甲醛300 μl重懸,濾網(wǎng)過濾,盡快上機檢測。

1.4 BMDC功能鑒定

1.4.1 實驗分組 收集誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d的BMDC,分為對照組和LPS組,其中對照組不做處理,LPS組加入1 μg/ml的LPS誘導(dǎo)48 h。

1.4.2 流式細胞術(shù)檢測BMDC由imDC分化為mDC表面標志物的表達 分別收集對照組和LPS組細胞,PBS緩沖液洗滌兩次,分別在100 μl PBS緩沖液中加入2.2 μl的PE-CD86,0.15 μl的Percp-Cy 5.5-MHC Ⅱ,0.5 μl的APC-CD11c和2.2 μl的PE-CD40,0.5 μl的APC-CD11c單抗。冰上避光孵育15～30 min,PBS洗兩次。4%多聚甲醛300 μl重懸,濾網(wǎng)過濾,及時上機檢測。結(jié)果用FlowJo-v10.6.2軟件處理,在CD11c表達陽性的細胞中進行BMDC成熟標記物的陽性率和熒光強度的分析。

1.4.3 CCK-8實驗檢測BMDC對脾臟淋巴細胞增殖能力的影響 小鼠脾臟淋巴細胞的提取:無菌條件下取BALB/c小鼠脾臟,制成脾細胞懸液,裂解紅細胞,洗滌兩次,溫箱中培養(yǎng)過夜,收集懸浮細胞,制成2×106/ml的脾臟淋巴細胞懸液,作為反應(yīng)細胞。

分別收集對照組和LPS組細胞,加入25 μg/ml的絲裂霉素C,溫箱孵育45 min,抑制BMDC的增殖活力。洗滌兩次,完全培養(yǎng)基重懸細胞,將兩組細胞分別制成4×105/ml、2×105/ml、1×105/ml、4×104/ml、2×104/ml濃度的細胞懸液,作為刺激細胞。96孔板中每孔分別加入50 μl的兩組刺激細胞懸液和50 μl的反應(yīng)細胞懸液,每組設(shè)5個復(fù)孔,將兩組刺激細胞與反應(yīng)細胞按照1∶5,1∶10,1∶20,1∶50,1∶100的比例培養(yǎng)96 h。每孔加10 μl CCK-8溶液,溫箱孵育4 h,450 nm處測吸光度值。

1.4.4 qRT-PCR和Western blot檢測BMDC中NF-κB的表達情況 取對照組和LPS組細胞,按照RNA提取試劑盒和cDNA試劑的說明書,提取RNA并逆轉(zhuǎn)錄出cDNA,按照PCR擴增試劑說明書擴增出NF-κB mRNA的相對表達量。引物序列見表1。

表1 NF-κB和β-actin引物序列

對照組和LPS組細胞用裂解液裂解30 min,4 ℃離心機中12 000 r/min離心15 min,測上清蛋白濃度。各組蛋白30 μg電泳,濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜,封閉2 h,p-NF-κB抗體1∶2 000稀釋,4 ℃孵育過夜,TBST洗膜3次,10 min/次,二抗室溫孵育2 h,同上洗滌,超敏ECL發(fā)光試劑盒顯影。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 BMDC培養(yǎng)模型的建立

2.1.1 獲取小鼠骨髓細胞懸液的時間 小鼠脛骨和股骨解剖時間為(0.92±0.06)min,獲取小鼠骨髓細胞懸液時間為(10±1.53)min。

2.1.2 BMDC的形態(tài) 誘導(dǎo)培養(yǎng)第2天,增殖性細胞集落增多,集落較小,部分集落周邊細胞可見短的突起;培養(yǎng)4 d,增殖性集落增多且疏松貼壁,集落周邊細胞具有較長突起;培養(yǎng)7 d,增殖性集落分散,細胞體積增大,表面出現(xiàn)細長的樹枝狀突起,瑞氏-姬姆薩染色后BMDC形狀不規(guī)則,邊緣具有大量長短不一的絲狀,毛刺狀突起(見圖1),具有DC的典型特征。

圖1 光學(xué)顯微鏡下BMDC形態(tài)

2.1.3 BMDC純度 流式細胞術(shù)實驗結(jié)果表明,誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d的CD11c+細胞占細胞總數(shù)比例在88%～98%(見圖2),表明本實驗誘導(dǎo)獲得的BMDC純度高。

圖2 BMDC純度分析

2.2 BMDC功能的鑒定

2.2.1 BMDC由imDC分化為mDC表面標志物的鑒定 流式細胞術(shù)實驗結(jié)果顯示,與對照組相比,LPS組CD11c+BMDC成熟的標記物CD86、CD80、CD40和MHC Ⅱ分子的陽性率明顯增加(P<0.01,見圖3、表2);與對照組相比,LPS組熒光強度顯著增強(P<0.01,見圖4)。結(jié)果表明本實驗誘導(dǎo)7 d后獲得的BMDC為imDC,經(jīng)LPS刺激后可分化為mDC。

圖3 流式細胞術(shù)檢測CD11c+BMDC成熟的標記物CD86、CD80、CD40和MHC Ⅱ的陽性率

與對照組相比,**P<0.01,***P<0.001

表2 兩組CD11c+BMDC成熟標記物表達比較

2.2.2 BMDC對脾臟淋巴細胞增殖能力的影響 CCK-8實驗結(jié)果顯示,刺激細胞與反應(yīng)細胞以1∶5,1∶10,1∶20的比例混合培養(yǎng)時,與對照組相比,LPS組淋巴細胞的增殖能力均明顯增加(P<0.001),以1∶50的比例培養(yǎng)時,淋巴細胞的增殖能力增加(P<0.05),而以1∶100的比例混合培養(yǎng)時,兩組之間的細胞增殖活力并無明顯變化(P>0.05,見表3)。實驗結(jié)果表明LPS刺激后的BMDC從imDC分化為mDC。

表3 不同細胞比值的BMDC對脾臟淋巴細胞增殖能力的影響

2.2.3 BMDC由imDC分化為mDC中NF-κB表達的變化 qRT-PCR實驗結(jié)果顯示,與對照組相比,LPS組BMDC細胞中NF-κB mRNA的表達明顯增加(P<0.001,見圖5)。Western blot實驗結(jié)果表明,與對照組相比,LPS組BMDC細胞中p-NF-κB表達上調(diào)(P<0.01,見圖5)。以上實驗結(jié)果均表明imDC經(jīng)過LPS刺激后,可分化成熟為mDC。

與對照組相比,**P<0.01,***P<0.001

3 討論

DC具有啟動和調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫應(yīng)答的功能,使T細胞激活,活化的T細胞在抗腫瘤免疫應(yīng)答中具有重要作用[14]。以DC為基礎(chǔ)的腫瘤疫苗在腫瘤研究領(lǐng)域取得了重要進展[15,16],然而其用于腫瘤疫苗的技術(shù)還未達到完全成熟[2]。DC的功能和疫苗研發(fā)的基礎(chǔ)研究需要在短時間獲得大量高純度DC。盡管已經(jīng)有永生化細胞株DC2.4的建立,但是有研究表明經(jīng)刺激成熟后DC2.4上清中IL-12的濃度及細胞表面標志物與第9天小鼠骨髓來源DC仍有明顯差別[17],DC2.4不能夠代替原代培養(yǎng)獲得的DC。骨髓細胞誘導(dǎo)擴增法是DC原代培養(yǎng)的一種重要技術(shù)手段,然而這種方法獲得的細胞純度及活性有待提高,需要不斷的研發(fā)和改進。

本研究通過利用附著在脛骨上的肌肉群的位置分布、關(guān)節(jié)軟骨及附著于股骨的肌肉群的結(jié)構(gòu)位置特點,干凈快速地游離出了脛骨和股骨,與文獻[18]相比,明顯縮短了骨骼解剖時間和細胞懸液制備時間,降低了骨髓細胞活性的喪失。本實驗采用BMDC培養(yǎng)的經(jīng)典方法進行改良,用10 ng/ml的rmGM-CSF和10 ng/ml的rmIL-4共同誘導(dǎo)BMDC,在培養(yǎng)過程中,利用細胞特性進行篩選,去除了大部分粒細胞、淋巴細胞和巨噬細胞的干擾;鏡下觀察BMDC的生長,培養(yǎng)初期細胞集落多,培養(yǎng)后期BMDC具有典型特征,收獲的BMDC數(shù)量多。CD11c被認為是髓系DC的表面標志物[19,20],對其檢測測定BMDC純度,誘導(dǎo)獲得的細胞純度可達97.4%。與文獻中DC純度85%[21]相比,本實驗誘導(dǎo)獲得的BMDC純度高。與經(jīng)典方法[12]相比,本實驗可在較短的時間內(nèi)獲得純度較高的BMDC,提高了實驗效率。

為驗證BMDC活性對其功能進行檢測。DC在功能上又可以分為imDC和mDC,imDC低表達MHC Ⅱ分子和協(xié)同刺激分子CD80、CD86、CD40等,imDC激活后分化為mDC,高表達MHC Ⅱ分子和協(xié)同刺激分子CD80、CD86、CD40等[22-24]。mDC可以向初始T細胞提供其活化所需的3種信號:信號1是T細胞受體與MHC-抗原復(fù)合物結(jié)合觸發(fā);信號2是協(xié)同刺激信號,主要是由mDC表達的CD80和CD86與T細胞表達的CD28介導(dǎo),T細胞的有效激活需要信號1和信號2同時存在,如果僅有信號1會導(dǎo)致T細胞功能缺陷,促進免疫耐受;信號3是T細胞極化信號[25]。大部分研究明確mDC可以增強淋巴細胞的活化和增殖能力[26]。LPS刺激后imDC可分化為mDC,LPS為細菌的主要成分,對免疫系統(tǒng)具有顯著的刺激作用。本實驗LPS組與對照組相比,BMDC表面分子CD80、CD86、CD40和MHC Ⅱ的熒光強度和陽性率顯著增強,表明BMDC從未成熟狀態(tài)分化為成熟狀態(tài)。與對照組比較,LPS組BMDC與脾臟淋巴細胞的比值在1∶5～1∶20的比例混合培養(yǎng)時,淋巴細胞的增殖能力均明顯增加。LPS可以通過誘導(dǎo)TLR4/NF-κB的信號通路,轉(zhuǎn)導(dǎo)活化NF-κB,促進細胞因子的釋放,進而促進DC的成熟[20,27-30]。本研究加入LPS后,BMDC中轉(zhuǎn)錄水平NF-κB的表達上調(diào),翻譯水平可以促進p-NF-κB的表達,進一步表明本實驗條件下誘導(dǎo)純化的BMDC活性和功能良好。

本實驗體外BMDC培養(yǎng)模型的方法簡便可行,縮短了骨骼解剖時間和細胞懸液制備時間,用濃度較低的rmGM-CSF和rmIL-4誘導(dǎo)出純度高的BMDC,并鑒定出其具有良好的活性和功能,為DC免疫功能的基礎(chǔ)研究和轉(zhuǎn)化應(yīng)用奠定了實驗基礎(chǔ)。