余柯達，毛佳婷，柴娟，包云，師帥

(金華市人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心,金華 321000)

早發(fā)性卵巢功能不全(POI)是一種常見內(nèi)分泌疾病,會導(dǎo)致女性不孕,其具有病因復(fù)雜及臨床異質(zhì)性高等特點。POI臨床表現(xiàn)為女性在40歲之前發(fā)生閉經(jīng),血清卵泡刺激素(FSH)升高、雌激素(E2)下降。POI的病因目前尚不完全明確,與遺傳缺陷、自身免疫和化療損傷等誘因有關(guān)[1]。近年來育齡女性癌癥的發(fā)病率逐年上升,化療暴露成為了POI的重要誘因[2]。環(huán)磷酰胺(CTX)是臨床常用于惡性腫瘤治療的烷化劑,會損傷女性的生殖系統(tǒng),導(dǎo)致POI的發(fā)生[3]。目前對POI的治療手段極為有限,臨床上以激素替代療法(HRT)為主,但無法恢復(fù)患者的卵巢功能和生育能力[4]。因此如何安全有效地改善POI患者的卵巢功能、恢復(fù)其生育能力是目前臨床上急需解決的重要問題。

近年來,研究發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細胞(MSCs)移植可有效改善 POI模型動物的卵巢功能及生育能力[5-9],成為了生殖內(nèi)分泌研究領(lǐng)域的熱點。有研究者從經(jīng)血中新發(fā)現(xiàn)了一種MSCs——經(jīng)血間充質(zhì)干細胞(MenSCs)[10-11]。相較于其他MSCs,MenSCs具有取材易、來源廣、含量多等優(yōu)點,且來源于人體廢棄物,無倫理問題,具有廣闊的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用潛力[12]。本研究探討了MenSCs及其培養(yǎng)液(MenSCs-CM)對CTX誘導(dǎo)的POI小鼠模型卵巢功能的修復(fù)作用,為臨床POI的治療提供新的方法。

資料和方法

一、研究對象

1.實驗動物與細胞:健康ICR雌性小鼠,6周齡,SPF級,體質(zhì)量約27 g,購自杭州子源實驗動物科技有限公司[生產(chǎn)許可證號:SCXK(浙)2019-0004],在恒溫恒濕環(huán)境下飼養(yǎng),提供12 h光照/12 h黑暗環(huán)境,正常晝夜節(jié)律自由飲食。所有實驗操作經(jīng)醫(yī)院實驗動物管理與使用委員會核準(zhǔn)通過。

MenSCs原代細胞由本實驗室從女性志愿者經(jīng)血中分離培養(yǎng)得到[13]。

2.主要試劑和儀器:CTX(Sigma,美國);卵泡刺激素(FSH)ELISA試劑盒(上海江萊生物),雌二醇(E2)ELISA試劑盒(上海江萊生物);蘇木精(Sigma,美國),伊紅(Sigma,美國);TUNEL檢測試劑盒(Roche,美國)。全波長酶標(biāo)儀(MD,美國);低速自動平衡離心機(湖南湘儀);輪轉(zhuǎn)式切片機(LEICA,德國);病理組織漂烘儀(常州市郝思琳);顯微鏡(OLYMPUS,日本);隔水式恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進)。

二、研究方法

1.MenSCs/MenSCs-CM制備[13]：選擇生長狀態(tài)最好的第4代MenSCs,用無血清培養(yǎng)基(Gibco,美國)培養(yǎng)3 d(37℃,5% CO2),收集培養(yǎng)基,此時的培養(yǎng)基即為MenSCs-CM。貼壁的MenSCs用胰蛋白酶(Gibco,美國)消化,無血清培養(yǎng)基洗滌后制成濃度為l×106/ml單細胞懸液,即MenSCs。

2.分組及治療:ICR雌性小鼠經(jīng)陰道脫落細胞涂片檢查確定小鼠動情周期正常后,隨機分為4組:對照組(n=30)、POI組(n=30)、POI+MenSCs組(n=30)和POI+MenSCs-CM組(n=30)。POI組、POI+MenSCs組和POI+MenSCs-CM組給予CTX 50 mg/kg/d腹腔注射,連續(xù)注射15 d,構(gòu)建POI模型[14],對照組腹腔注射同體積的生理鹽水。在POI模型建立的第7天對POI+MenSCs組和POI+MenSCs-CM組小鼠分別尾靜脈注入0.6 ml的MenSCs或MenSCs-CM治療,對照組和POI組小鼠注射相等體積的無血清培養(yǎng)基,尾靜脈注射后第3天再注射1次。分別于治療后第7天和第14天進行取材檢測。

3.取材:所有小鼠在取材前兩天進行孕馬血清促性腺激素(PMSG,蘇州蘇牧)注射,使各組的動情周期一致。小鼠處死前,稱取其體重,摘眼球取血,分離血清。處死小鼠后從卵囊內(nèi)取出卵巢,稱取兩側(cè)卵巢重量,計算卵巢臟器系數(shù),卵巢臟器系數(shù)=卵巢重量/體重×100%。

4.血清FSH、E2測定:用ELISA法測定血清FSH、E2的含量,操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行。

5.HE染色觀察卵巢形態(tài):小鼠卵巢在4%多聚甲醛中固定過夜,脫水后用石蠟包埋,行常規(guī)HE染色,在顯微鏡下觀察卵巢組織和卵泡形態(tài),計數(shù)各級卵泡(原始卵泡、初級卵泡、次級卵泡、竇狀卵泡和閉鎖卵泡)[15]。

6. TUNEL法檢測卵巢組織中細胞凋亡:應(yīng)用試劑盒觀察卵巢組織中細胞凋亡情況,陽性細胞的細胞核為棕黃色或棕褐色染色,計算卵巢組織細胞凋亡指數(shù),凋亡指數(shù)=陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

7.小鼠生育能力的觀察:在治療后第7天將雌鼠與證實可育的雄鼠按1∶1進行合籠飼養(yǎng)10 d,觀察小鼠的懷孕和幼崽情況,記錄每窩小鼠的產(chǎn)仔數(shù),并稱取幼崽出生時的體重。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、各組小鼠卵巢臟器系數(shù)和血清性激素檢測結(jié)果

治療第7天,POI組的卵巢臟器系數(shù)顯著低于對照組(P<0.05),POI+MenSCs組和POI+MenSCs-CM組均顯著高于POI組(P<0.05);治療第14天,各組的卵巢臟器系數(shù)變化趨勢與治療第7天一致(圖1A)。治療第7天和第14天,POI組的血清FSH水平顯著高于對照組(P<0.05),POI+MenSCs組和POI+MenSCs-CM組均顯著低于POI組(P<0.05),POI+MenSCs組顯著低于POI+MenSCs-CM組(P<0.05,圖1B)。治療第7天,POI組的血清E2水平顯著低于對照組(P<0.05),POI+MenSCs組、POI+MenSCs-CM組與POI組組間比較均無顯著差異性(P>0.05);治療第14天,POI+MenSCs組和POI+MenSCs-CM組的血清E2水平均顯著高于POI組(P<0.05),POI+MenSCs組顯著高于POI+MenSCs-CM組(P<0.05,圖1C)。

A:小鼠的卵巢臟器系數(shù);B:血清FSH水平;C:血清E2水平。7 d和14 d分別代表治療7、14 d后;組間相互比較,*P<0.05。圖1 各組小鼠的卵巢臟器系數(shù)、血清FSH和E2結(jié)果

二、各組小鼠卵巢組織形態(tài)學(xué)觀察和卵泡計數(shù)結(jié)果

HE染色結(jié)果顯示,對照組卵巢結(jié)構(gòu)完整,可見正常發(fā)育、結(jié)構(gòu)整齊、大小不一的各級卵泡;POI組卵泡數(shù)量較對照組明顯減少,且大部分發(fā)育不良,可見閉鎖卵泡;POI+MenSCs組和POI+MenSCs-CM組的卵巢組織較POI組各級卵泡數(shù)量增加,閉鎖卵泡明顯減少(圖2)。

圖2 各組小鼠卵巢組織形態(tài)學(xué)觀察(HE染色,bar=250 μm)

卵巢組織卵泡計數(shù)結(jié)果顯示,治療第7天和第14天,POI組的原始卵泡、初級卵泡、次級卵泡和竇狀卵泡的數(shù)量均顯著少于對照組(P<0.05),閉鎖卵泡數(shù)顯著多于對照組(P<0.05);POI+MenSCs組和POI+MenSCs-CM組的原始卵泡、初級卵泡、次級卵泡和竇狀卵泡數(shù)量均顯著多于POI組(P<0.05),閉鎖卵泡數(shù)顯著少于POI組(P<0.05);POI+MenSCs組的初級卵泡、次級卵泡和竇狀卵泡數(shù)量均顯著多于POI+MenSCs-CM組(P<0.05),閉鎖卵泡數(shù)顯著少于POI+MenSCs-CM組(P<0.05)(圖3)。

A:治療7 d后;B:治療14 d后。組間相互比較,*P<0.05。圖3 各組小鼠卵巢組織中各級卵泡計數(shù)

三、各組小鼠卵巢組織細胞凋亡水平比較

卵巢組織細胞凋亡結(jié)果顯示,凋亡細胞大部分為成熟卵泡周邊及內(nèi)部的顆粒細胞(GCs)(圖4)。治療第7天和第14天,POI組的凋亡指數(shù)顯著高于對照組(P<0.05),POI+MenSCs組和POI+MenSCs-CM組均顯著低于POI組(均P<0.05),POI+MenSCs組顯著低于POI+MenSCs-CM組(P<0.05)(圖5)。

紅色箭頭指示凋亡細胞。圖4 各組小鼠卵巢組織細胞凋亡結(jié)果(TUNEL染色,bar=25 μm)

7 d和14 d分別代表治療7、14 d后;組間相互比較,*P<0.05。圖5 各組小鼠卵巢組織細胞凋亡指數(shù)

四、各組小鼠生育能力比較

小鼠交配實驗結(jié)果顯示,POI組的幼崽數(shù)顯著少于對照組(P<0.05),POI+MenSCs組和POI+MenSCs-CM組均顯著多于POI組(P<0.05)。各組小鼠的幼崽體重變化趨勢與幼崽數(shù)一致(圖6)。

A:產(chǎn)仔數(shù)量統(tǒng)計圖;B:幼崽體重統(tǒng)計圖。組間相互比較,*P<0.05。圖6 各組小鼠產(chǎn)仔數(shù)量和幼崽體重情況

討 論

MSCs作為一種成體干細胞,具有強大的增殖和自我更新能力,其廣泛存在于骨髓、脂肪和臍帶等組織中[16]。MSCs移植治療為組織修復(fù)和功能重建開拓了嶄新的方向。2007年有研究者首次從女性經(jīng)血中分離得到并鑒定了MenSCs[11]。MenSCs來源于女性經(jīng)血,經(jīng)血是一種人體廢棄物,沒有倫理上的相關(guān)問題,且意味著可以不斷地從同一個女性志愿者的經(jīng)血中獲得具有相同遺傳背景的MenSCs,為其理論基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化提供了極大的便利。本研究所用從經(jīng)血中分離得到的MenSCs,具有MSCs典型的形態(tài)、細胞表面標(biāo)志物和生物學(xué)特性[13]。

MSCs具有自我更新、可塑性強、低免疫原性等特點,在組織功能重建,機體損傷修復(fù)和免疫調(diào)節(jié)等方面具有重要應(yīng)用價值,是現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的熱點之一[17-18]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)MenSCs尾靜脈注射治療化療所致POI模型小鼠后,卵巢臟器系數(shù)增加,血清FSH和E2水平恢復(fù),GCs凋亡顯著減少,生育能力(產(chǎn)仔數(shù)和幼崽體重)得到提高,使POI模型小鼠的卵巢結(jié)構(gòu)和功能損傷得到修復(fù)。與骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)[5]、羊膜間充質(zhì)干細胞(AMSCs)[7]、絨毛膜間充質(zhì)干細胞(CPMSCs)[8]和臍帶間充質(zhì)干細胞(UCMSCs)[9]等MSCs對化療所致POI治療方面具有一致的效果。表明MSCs移植可改變局部組織反應(yīng)及其內(nèi)分泌激素的分泌,改善激素水平,促進卵泡發(fā)育,抑制卵巢過多卵泡閉鎖和GCs凋亡,提高卵巢儲備能力,從而修復(fù)卵巢功能。但由于移植MSCs治療化療所致POI具有惡變和醫(yī)源性感染的風(fēng)險,以及免疫排斥和穩(wěn)定安全性等問題,嚴(yán)重限制了其在POI治療上的進一步發(fā)展。

關(guān)于目前MSCs治療POI的主要機制,多數(shù)研究認為是其通過旁分泌作用來修復(fù)、調(diào)節(jié)、治療卵巢功能。有研究表明BMSCs[19]、UCMSCs[9]和AMSCs[20]尾靜脈注射POI模型鼠后卵巢功能得以恢復(fù),均未觀察到MSCs向卵巢細胞分化,更多的是通過旁分泌途徑來抑制GCs凋亡,改善卵巢局部微環(huán)境,進而恢復(fù)卵巢功能。本研究將MenSCs-CM通過尾靜脈注射POI模型小鼠,發(fā)現(xiàn)其與MenSCs有一致的治療效果,對血清性激素水平(FSH、E2)恢復(fù)和GCs凋亡的改善作用稍差于MenSCs,但對生育能力(產(chǎn)仔數(shù)和幼崽體重)的提升作用與MenSCs無顯著差異性。

MSCs在培養(yǎng)過程中會分泌細胞因子和胞外囊泡(EVs)。MSCs分泌的細胞因子,例如血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、胰島素樣生長因子-1(IGF-1)和肝細胞生長因子(HGF),在恢復(fù)卵巢功能中起重要作用[21]。Li等[8]研究認為MSCs對POI卵巢的修復(fù)作用,是通過其分泌的多種細胞因子組合共同發(fā)揮作用,而非單個細胞因子。目前研究表明細胞因子無法充分表現(xiàn)MSCs的功效[22],EVs是旁分泌機制中的重要組成部分,主要由外泌體和微囊泡組成,攜帶具有生物活性的蛋白質(zhì)、mRNAs和microRNAs(miRNAs)等,參與細胞間的通訊和信號傳導(dǎo),在組織再生中發(fā)揮著重要的作用[23-24]。體外和體內(nèi)研究均表明MSCs分泌的EVs可有效抑制GCs的凋亡,目前已有研究表明MSCs分泌的EVs攜帶的miR-144-5p、miR-23a、miR-27a、miR-17-5P和miR-320可調(diào)控不同通路來抑制GCs的凋亡,恢復(fù)POI卵巢功能[25-28]。上述研究表明MSCs分泌的EVs通過自身攜帶的物質(zhì)可以起到與MSCs類似甚至同樣的治療效果。

我們的實驗仍存在一定的局限性。本研究僅初步探討了MenSCs及其培養(yǎng)液對化療所致POI模型小鼠卵巢功能和生育能力的改善作用,并未對MenSCs治療POI的具體有效分泌產(chǎn)物和分子機制進行探究。因此,接下來MenSCs治療POI的研究,我們將從MenSCs分泌的EVs以及對卵巢功能相關(guān)關(guān)鍵通路進行更深入的研究。