丁慧敏，項雨，吳洪慧，徐天月，葛紅山，3*

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué),南京 210023;2.泰州市人民醫(yī)院,泰州 225300;3.大連醫(yī)科大學(xué),大連 116044)

鄰苯二甲酸二(2-乙基)己酯(DEHP)作為聚氯乙烯塑料的增塑劑,約占全部鄰苯二甲酸酯(PAEs)類增塑劑使用量的50%,被廣泛應(yīng)用于食品包裝、兒童玩具、醫(yī)療用品等制造行業(yè)[1]。DEHP 可經(jīng)胃腸道、肺和皮膚吸收,通常以胃腸道為主要吸收途徑。進(jìn)入人體的DEHP極少部分直接以原型形式經(jīng)由尿液、糞便或者汗液排出體外[2],絕大多數(shù)可在肝臟和胃腸道中迅速水解代謝為鄰苯二甲酸單(2-乙基己基)酯(MEHP)[3]。MEHP極易在體內(nèi)長期蓄積,因此,DEHP 在機(jī)體內(nèi)的毒性作用主要是通過其代謝產(chǎn)物MEHP來實現(xiàn)[4]。研究表明 MEHP可對人體的生殖系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等多個組織系統(tǒng)具有毒性作用[5-8]。有研究報道,DEHP高暴露女性出現(xiàn)了受孕率降低、流產(chǎn)率增加、雌激素水平降低和排卵異常[9]。DEHP和MEHP已被證明可以誘導(dǎo)原始卵泡的消耗、性激素的產(chǎn)生減少、引起卵巢顆粒細(xì)胞凋亡[10-11]。然而,其影響雌性生殖的確切機(jī)制尚不清楚。

鐵死亡是鐵依賴的脂質(zhì)過氧化物過度積累和活性氧(ROS)引發(fā)的一種新的細(xì)胞死亡調(diào)節(jié)形式,在形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)方面不同于凋亡、焦亡或壞死等細(xì)胞死亡方式[12-13]。在生化方面,它表現(xiàn)為亞鐵離子和ROS水平升高、谷胱甘肽過氧化物酶4(GPX4)活性下降,以及脂質(zhì)代謝物清除不充分并在細(xì)胞內(nèi)積累[13]。有研究表明MEHP暴露誘導(dǎo)Sertoli細(xì)胞鐵死亡可能是其雄性生殖毒性的機(jī)制之一[14]。因此,本研究探討MEHP是否可以通過誘導(dǎo)KGN細(xì)胞鐵死亡參與其雌性生殖毒性的發(fā)生和發(fā)展。

材料和方法

一、實驗材料

1.實驗細(xì)胞:人卵巢顆粒細(xì)胞系KGN細(xì)胞(中喬新舟ZQ0916)由中喬新舟生物科技有限公司提供。

2.主要試劑和儀器:胎牛血清(FBS;Sigma,美國);DMEM/F12培養(yǎng)基(Gibco,美國);青霉素/鏈霉素(蘇州新賽美);MEHP(MCE,美國);CCK8(同仁,日本);BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天);?；o酶A合成酶長鏈家族成員4(ACSL4)兔單克隆抗體(ab155282;Abcam,美國)、谷胱甘肽過氧化物酶4(GPX4)兔單克隆抗體(ab125066;Abcam,美國)、溶質(zhì)載體家族7成員11(SLC7A11)兔單克隆抗體(ab216876;Abcam,美國)、鐵蛋白重鏈1(FTH1)兔單克隆抗體(ab65080;Abcam,美國)、β-actin兔單克隆抗體(4970;Cell Signaling Technology,美國);辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔二抗(武漢愛博泰克);全波段多功能酶標(biāo)儀(BioTek,美國);倒置生物顯微鏡(DM i8;Leica,德國);Tanon 4800發(fā)光成像系統(tǒng)(上海天能)。

二、研究方法

1.KGN細(xì)胞系體外培養(yǎng):KGN細(xì)胞系在含有10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基中置于37℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞密度達(dá)80%后加入不同濃度MEHP處理24 h。

2.細(xì)胞活力的檢測(CCK-8法):KGN細(xì)胞經(jīng)計數(shù)后按照5×103/孔將KGN細(xì)胞懸液接種到96孔板中,24 h貼壁生長后,將MEHP藥物以不同的濃度(0、100、200、400、800、1 600 μmol/L)配置在DMEM/F12培養(yǎng)基中,通過換液給予細(xì)胞藥物處理。經(jīng)24 h MEHP藥物處理后,棄去細(xì)胞培養(yǎng)基并用PBS清洗1次,向每孔加入100 μl CCK8和培養(yǎng)基的混合物并將96孔板轉(zhuǎn)入培養(yǎng)箱避光孵育2 h。孵育結(jié)束后使用酶標(biāo)儀在450 nm波長處測量吸光度(OD值)。

3.蛋白免疫印跡(WB):將各組KGN細(xì)胞提取蛋白用BCA試劑盒測量各組蛋白濃度。采用12%的凝膠進(jìn)行聚丙烯酰氨凝膠(SDS-PAGE)電泳,之后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜(Millipore,美國)上;用5%脫脂牛奶(北京索萊寶)室溫封閉2 h,TBST(北京索萊寶)清洗3次;將膜分別與一抗[ACSL4(1∶10 000)、GPX4(1∶1 000)、SLC7A11(1∶1 000)、FTH1(1∶1 000)、β-actin(1∶4 000)]在4℃搖床孵育過夜;第2天用TBST清洗3遍,每次5 min;之后將膜與二抗[HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶5 000)]一起室溫?fù)u床孵育2 h;TBST清洗3遍,每次5 min;用特超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(上海碧云天)曝光顯影。Image J 1.8.0.345軟件用于檢測條帶的灰度值,以目的蛋白和內(nèi)參條帶β-actin灰度值的比值與對照組比較表示目的蛋白的相對表達(dá)水平。

4.細(xì)胞鐵含量檢測:將細(xì)胞棄去培養(yǎng)液,胰酶消化,PBS重懸成1 ml的細(xì)胞懸液,細(xì)胞計數(shù)儀測定每組細(xì)胞量,離心后向細(xì)胞沉淀中加入100 μl提取液,冰浴超聲波破碎細(xì)胞(功率200 W,超聲3 s,間隔7 s;重復(fù)30次),于4℃、10 000 r/min離心10 min,取上清待測。按細(xì)胞鐵含量檢測試劑盒(北京索萊寶)說明書加入相應(yīng)試劑,充分混勻,25℃靜置顯色10 min,于96孔板中測定510 nm處吸光值,分別記為A測定、A空白和A標(biāo)準(zhǔn),計算ΔA測定=A測定-A空白、ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白。細(xì)胞鐵含量(ng/104cell)=27.922×ΔA測定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)

5.丙二醛(MDA)含量測定:將各組KGN細(xì)胞提取蛋白上清,用BCA試劑盒檢測各組上清蛋白濃度。根據(jù)MDA檢測試劑盒(上海碧云天)說明書配好MDA檢測工作液。再取適量標(biāo)準(zhǔn)品用蒸餾水稀釋標(biāo)準(zhǔn)品至1、2、5、10、20、50 μmol/L,設(shè)置空白對照,并在空白對照的離心管中加入0.1 ml裂解液,加入0.1 ml上述不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品用于標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制,加入0.1 ml樣品進(jìn)行測定,再加入MDA檢測工作液0.2 ml混勻,沸水浴15 min。冷卻至室溫,3 500 r/min離10 min,取200 μl上清液加入96孔板,酶標(biāo)儀測量532 nm下吸光度。通過標(biāo)曲計算出樣品溶液中的MDA含量后,以單位重量的蛋白含量(BCA法)來表示最初樣品中的MDA含量(μmol/mg)。

6.細(xì)胞內(nèi)ROS和超氧化物陰離子水平檢測:細(xì)胞按照3×105/孔接種于6孔板,24 h貼壁生長后加入MEHP處理24 h,去除細(xì)胞培養(yǎng)液,加入1 ml 10 μmol/L活性氧熒光探針(DCFH-DA)和10 μmol/L超氧化物陰離子熒光探針(DHE)溶液,37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min,無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次,在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、MEHP改變KGN細(xì)胞形態(tài)并抑制其活力

為了探究不同濃度MEHP對KGN細(xì)胞形態(tài)和增殖能力的影響,以MEHP為0(對照組)、100、200、400、800、1 600 μmol/L濃度進(jìn)行分組,在細(xì)胞密度達(dá)80%時給藥,于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h。鏡下觀察結(jié)果顯示,對照組KGN細(xì)胞形態(tài)正常,呈成纖維樣或梭形并向周圍伸出偽足;100、200 μmol/L MEHP處理后細(xì)胞形態(tài)無明顯改變,400、800、1 600 μmol/L MEHP處理后細(xì)胞數(shù)量減少,逐漸皺縮變圓,失去梭形和偽足樣結(jié)構(gòu),且隨著濃度的增加,形態(tài)改變愈加明顯(圖1)。

圖1 不同濃度MEHP處理后KGN細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變(×100)

采用CCK-8檢測了不同濃度MEHP對KGN的細(xì)胞活力和增殖能力的影響,結(jié)果顯示,與對照組相比較,100、200 μmol/L MEHP處理組細(xì)胞活力無顯著改變(P>0.05),400 μmol/L MEHP處理組細(xì)胞活力減少至對照組的70.3%,800、1 600 μmol/L MEHP處理組減少至對照組的40%以下(P<0.05)(圖2)。即隨著MEHP濃度的增加,KGN細(xì)胞的存活率逐漸下降,高濃度的MEHP可以抑制KGN細(xì)胞的增殖。

與對照組比較,*P<0.05,**P<0.01。圖2 不同濃度MEHP處理后KGN細(xì)胞的存活率

二、MEHP對KGN細(xì)胞鐵死亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

為了研究MEHP對KGN細(xì)胞的影響,用0(對照組)、100、200、400 μmol/L濃度的MEHP處理細(xì)胞并檢測鐵死亡相關(guān)蛋白的表達(dá)變化。WB結(jié)果顯示,100、200、400 μmol/L各組中的ACSL4蛋白表達(dá)隨著MEHP濃度增加而增加,與對照組比較,400 μmol/L MEHP處理組ACSL4蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.05);與對照組比較,200、400 μmol/L MEHP處理組GPX4蛋白表達(dá)顯著下降(P<0.05);與對照組比較,400 μmol/L MEHP處理組SLC7A11和FTH1蛋白表達(dá)均顯著下降(P<0.05)(圖3)。

A:WB法檢測鐵死亡相關(guān)蛋白的表達(dá);B:ACSL4蛋白相對表達(dá)量;C:GPX4蛋白相對表達(dá)量;D:SLC7A11蛋白相對表達(dá)量;E:FTH1蛋白相對表達(dá)量。與對照組比較,*P<0.05,**P<0.01。圖3 WB檢測不同濃度MEHP處理KGN細(xì)胞鐵死亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

三、MEHP對KGN細(xì)胞鐵含量的影響

與對照組比較,400 μmol/L MEHP處理組的細(xì)胞鐵含量增加,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖4)。

與對照組比較,*P<0.05。圖4 MEHP處理后KGN細(xì)胞鐵含量變化

三、MEHP對KGN細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響

MDA檢測試劑盒分析結(jié)果顯示,與對照組比較,400 μmol/L MEHP處理組細(xì)胞內(nèi)MDA含量顯著增加(P<0.01)(圖5)。我們用DCFH-DA和DHE熒光探針檢測了細(xì)胞內(nèi)的ROS和超氧化物陰離子的水平,結(jié)果顯示,MEHP處理后細(xì)胞內(nèi)ROS和超氧化物陰離子水平升高(圖6)。這表明MEHP使得KGN細(xì)胞氧化應(yīng)激水平增加。

與對照組比較,**P<0.01。圖5 MEHP處理后KGN細(xì)胞MDA含量的變化

Hoechst33342:藍(lán)色熒光代表細(xì)胞核;DCFH-DA:綠色熒光代表ROS;DHE:紅色熒光代表超氧化物陰離子。圖6 MEHP處理后KGN細(xì)胞ROS和超氧化物陰離子水平的變化(免疫熒光染色 ×200)

討 論

DEHP是目前應(yīng)用最廣泛的增塑劑,作為一種環(huán)境內(nèi)分泌干擾物,其具有類雌激素作用,對人類和動物的生殖功能有損傷作用[15]。由于女性特殊的生理特點和生活習(xí)慣,DEHP暴露的機(jī)會明顯高于男性。但是由于女性生殖系統(tǒng)相對復(fù)雜,因此DEHP和MEHP的雌性生殖毒性的研究少見報道。女性生殖發(fā)育和功能的異常,如子宮內(nèi)膜異位癥、各種妊娠并發(fā)癥、流產(chǎn)和早產(chǎn)等,都證實與DEHP的暴露有關(guān)[16]。卵巢顆粒細(xì)胞的增殖和分化能調(diào)節(jié)卵泡的生長和成熟,其狀態(tài)是決定卵泡最終命運的關(guān)鍵[17],且已有研究表明卵巢顆粒細(xì)胞可能是DEHP代謝產(chǎn)物MEHP的靶細(xì)胞[18]。因此,我們在體外通過人KGN細(xì)胞建立MEHP損傷顆粒細(xì)胞模型來探究DEHP對卵巢的損傷機(jī)制。

本研究發(fā)現(xiàn),KGN細(xì)胞的活力和增殖能力隨著MEHP劑量的增大而降低,細(xì)胞形態(tài)也發(fā)生明顯變化,失去偽足樣結(jié)構(gòu)。我們還發(fā)現(xiàn)400 μmol/L的MEHP使得KGN細(xì)胞的ACSL4蛋白表達(dá)增加,GPX4、SLC7A11、FTH1蛋白表達(dá)水平均顯著下降。ACSL4是脂質(zhì)過氧化物產(chǎn)生的關(guān)鍵酶,也是鐵死亡的生物標(biāo)志物和敏感調(diào)控因子[19]。SLC7A11是System XC-的重要組成部分,其表達(dá)減少時,System XC-被阻斷,谷氨酸與胱氨酸不能互換,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)谷氨酸堆積,GSH合成減少,進(jìn)而導(dǎo)致GPX4活性下降[20]。GPX4是細(xì)胞內(nèi)最重要的抗氧化物,它可以清除細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)過氧化物,是調(diào)控鐵死亡的關(guān)鍵蛋白[21]。MEHP通過ACSL4表達(dá)上調(diào)使脂質(zhì)過氧化物產(chǎn)生增加,同時GPX4的蛋白表達(dá)和活性降低,無法及時清除脂質(zhì)過氧化物,進(jìn)而引起KGN細(xì)胞鐵死亡抑制細(xì)胞增殖能力。

脂質(zhì)過氧化和鐵離子的蓄積是鐵死亡的標(biāo)志性特征[13]。外周循環(huán)中的Fe3+通過轉(zhuǎn)鐵蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的結(jié)合進(jìn)入細(xì)胞,還原為Fe2+,多余的鐵則儲存在鐵蛋白FTH1和FTL中。過量鐵主要通過芬頓反應(yīng)產(chǎn)生的活性氧而引發(fā)鐵死亡[22],鐵離子的水平與丙二醛、ROS等過氧化產(chǎn)物的產(chǎn)生量呈正相關(guān)。本研究結(jié)果顯示,MEHP增加了KGN細(xì)胞的鐵含量,MDA、ROS、超氧化物陰離子等也明顯增加。鐵自噬是細(xì)胞內(nèi)鐵離子釋放的主要過程,對鐵穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)至關(guān)重要,其是由FTH1介導(dǎo)的[23]。MEHP可能通過激活鐵自噬使得儲存在FTH1的鐵離子被釋放成為游離鐵,細(xì)胞內(nèi)鐵增加,進(jìn)而通過芬頓反應(yīng)產(chǎn)生大量活性氧引發(fā)鐵死亡。

綜上所述,本研究通過鐵代謝、氧化應(yīng)激和鐵死亡調(diào)控因子蛋白表達(dá)的異常初步顯示了鐵死亡是MEHP誘導(dǎo)人卵巢顆粒細(xì)胞KGN細(xì)胞發(fā)生死亡的重要途徑,為DEHP和MEHP的雌性生殖毒性機(jī)制研究開拓了新思路。但是本研究僅局限于KGN細(xì)胞,缺乏卵巢方面的研究,且僅涉及鐵死亡的部分指標(biāo),具有局限性,其發(fā)生鐵死亡的具體機(jī)制還有待進(jìn)一步實驗研究驗證。